Крупномасштабные протеомики сверху вниз с использованием зоне капиллярного электрофореза тандем масс-спектрометрия

Подробный протокол описан для разделения, идентификации и характеризации proteoforms в образцы протеина, с использованием капиллярной зоны электрофореза электроспрей ионизации тандем масс-спектрометрия (CZE-ЭСИ-МС/МС). Протокол может использоваться для высокого разрешения характеристика proteoforms в образцах простых белков и крупномасштабных идентификации proteoforms в образцах сложных протеома.

Капиллярная зона электрофореза электроспрей ионизации тандем масс-спектрометрия (CZE-ЭСИ-МС/МС) был признан полезным инструментом для протеомики сверху вниз, которая призвана характеризовать proteoforms в сложных протеомов. Однако применение CZE-МС/МС для крупномасштабных сверху вниз протеомики сдерживается низкой образца-грузоподъемность и узкие разделения окна CZE. Здесь протокол описывается с помощью CZE-МС/МС с объем выборки загрузки микролитр шкалы и 90 мин разделения окна для крупномасштабных протеомики сверху вниз. CZE-MS/MS платформа базируется на линейной полиакриламид (LPA)-покрытием разделения капиллярного с крайне низкой электроосмотического потока, концентрации динамические основанные на рН Джанкшен онлайн образец метода с высокой эффективностью для укладки белков, электро кинетически перекачиваемой оболочка потока CE-MS интерфейс с чрезвычайно высокой чувствительностью и ионная ловушка масс-спектрометр с высокой массы резолюции и скорость сканирования. Платформа может использоваться для высокого разрешения характеристика простой интактных белков образцов и крупномасштабных характеристика proteoforms в различных сложных протеомов. Как, например проявляется весьма эффективное разделение смеси стандартного белка и высокочувствительный обнаружение многих примесей с использованием платформы. В качестве другого примера эта платформа может производить более 500 proteoform и запустить 190 идентификации белков от кишечной палочки протеома в одном CZE-MS/MS.

Сверху вниз протеомики (TDP) предназначена для крупномасштабных характеристика proteoforms в пределах протеома. Расчетная мощность зависит от эффективного разделения жидкой фазы интакт белками до электроспрей ионизации тандем масс-спектрометрия (ESI-МС/МС) анализ из-за высокой сложности и большой динамический диапазон концентраций протеома^{1,2 ,3,4,5}. Электрофорез капилляра зоны (CZE) – это мощный метод для разделения биомолекул, основанный на их соотношение размер заряд⁶. CZE является относительно простым, требующих только открытых трубчатых сплавили кремнезема капилляров, солевого фона (BGE) и блок питания. Образец интакт белками могут быть загружены в капилляр с помощью давления или напряжения, и разделение инициируется погружением обоих концах капилляра в Булак ДжиИПи Инжиниринг и применения высокого напряжения. CZE может подойти эффективность разделения ультра-высокой (> 1 миллион теоретических тарелок) для разделения биомолекул⁷. CZE-MS имеет существенно более высокая чувствительность чем широко используется обратная фаза жидкостной хроматографии (RPLC)-мс для анализа интакт белками⁸. Хотя CZE-MS имеет большой потенциал для крупномасштабных протеомики сверху вниз, его широкое применение в протеомике препятствовали ряд вопросов, включая низкий образца-грузоподъемность и узкие разделения окна. Типичный пример загрузки объем в CZE составляет около 1% от общего объема капилляров, которая обычно соответствует менее чем 100 nL^9,10,11. Разделение окна CZE обычно меньше чем 30 минут из-за сильного электроосмотического потока (EOF)^9,10. Эти проблемы ограничивают CZE-MS/MS для идентификации большого числа proteoforms и низкой обильные proteoforms от сложных протеома.

Много усилий был достигнут улучшить образца грузовместимость CZE через онлайн образца концентрации методов (например, твердофазный микроэкстракция [SPME]^12,13, поле Расширение образца укладки [FESS]^{9 , 11 , 14}и динамические рН перекрестка^15,16,17,18). FESS и динамических рН junction проще, чем SPME, только требующие существенное различие между буфер образца и Булак ДжиИПи Инжиниринг в проводимости и рН. FESS использует буфер образца с гораздо более низкой проводимости, чем BGE, ведущих к укладки аналитов на границе между образца зоны и зоны Булак ДжиИПи Инжиниринг в капилляр. Динамических рН Джанкшен использует базовый образец вилкой (например, бикарбонат аммония 50 мм, pH 8) и кислой BGE (например, уксусная кислота 5% [v/v], pH 2,4) на обеих сторонах вилку образца. По заявлению высокое положительное напряжение в конце инъекции капилляра титрование базовый образец плагина происходит, упором аналитов в жесткой вилкой перед прохождением CZE разделения. Недавно, солнце группа систематически по сравнению FESS и динамических рН перехода для онлайн укладки интакт белками, демонстрируя, что динамический рН перехода может производить гораздо лучшую производительность, чем повязка для онлайн концентрации интакт белками когда объем впрыска образец был 25% объема капиллярного¹⁹.

Нейтрально покрытием разделения капилляров (например, линейные полиакриламида [LPA]) были использованы для сокращения EOF в капилляр, замедляя CZE разделения и расширение разделения окна^20,21. Недавно Dovichi группа разработала простой процедуры для подготовки стабильного LPA покрытия на внутренней стенке капилляров, используя Персульфат аммония (APS) как инициатор и температуры (50 ° C) для производство свободных радикалов и полимеризации²² . Совсем недавно Sun group работают МПУ покрытием разделения капиллярного и динамических рН перекрестка метод для разделения CZE интакт белками, достигнув микролитр масштабе пример загрузки объем и 90 мин разделения окна¹⁹. Эта система CZE открывает дверь к использованию CZE-MS/MS для крупномасштабных протеомики сверху вниз.

CZE-МС требует весьма надежный и чувствительных интерфейса пара CZE МС. Три интерфейса CE-МС были хорошо развиты и коммерциализации в истории CE-MS, и они co оболочка осевые интерфейс²³, sheathless интерфейс, с помощью пористых подсказка как излучатель ESI²⁴и электро кинетически накачкой оболочка потока интерфейса^25,26. Электро кинетически перекачиваемой оболочка интерфейс-на основе потока CZE-МС/МС достиг предела обнаружения низкий zeptomole пептид⁹, свыше 10 000 идентификаций пептида (IDs) от НеЬа клетки протеома в один запуск¹⁴, быстрая характеристика интакт белками¹¹, и очень стабильная и воспроизводимость анализа биомолекул²⁶. Недавно МПУ покрытием разделения капиллярного метода соединения динамический рН, использовались и электро кинетически перекачиваемой оболочка потока интерфейса для крупномасштабных сверху вниз протеомики Escherichia coli (E. coli) протеома^{19 ,27}. CZE-MS/MS платформа подошли более 500 proteoform идентификаторы в едином¹⁹ и почти 6000 proteoform идентификаторы через сцепление с размер-гель-проникающей хроматографии (SEC)-RPLC фракционирование²⁷. Результаты ясно показывают возможности CZE-МС/МС для крупномасштабных протеомики сверху вниз.

Здесь описан подробная процедура использования CZE-MS/MS для крупномасштабных протеомики сверху вниз. CZE-МС/МС система использует МПУ покрытием капилляра для уменьшения EOF в капилляр, метод соединения динамический рН для онлайн концентрации белков, электро кинетически перекачиваемой оболочка потока интерфейса для муфты CZE МС, Орбитрэп масса спектрометр для коллекции МС и МС/МС спектров белков, и TopPIC (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform определение и характеристика) программного обеспечения для ID proteoform через Поиск в базе данных.

1. Подготовка LPA покрытия на внутренней стенке капилляра разделения

1. Предварительная обработка капилляра
   1. Флеш кварцевое капиллярные (120 см в длину, 50 мкм в внутренний диаметр [и.д.], 360 мкм в наружный диаметр [o.d.]) последовательно с 500 мкл рабочего раствора гидроксида натрия 1 М, деионизированной воды, 1М хлористоводородной кислоты, деионизированной воды, и LC-MS класс метанола с помощью насоса шприца.
   2. Сухие капилляра с газом азота (10 psi, ≥ 12 h) и заполнения капилляра с 50% (v/v) 3-(trimethoxysilyl) метакрилата пропил в метаноле, с помощью насоса шприца. Уплотнение обоих концах капилляра с резины силики и проинкубируйте его при комнатной температуре в течение 24 часов.
      Примечание: Во время этого шага, внутренней стенки капилляра функционализированных с C = C. больше инкубации приводит к лучше капиллярное покрытие за счет более полной реакции.
   3. Вырежьте небольшую часть (~ 5 мм) из капилляра с обоих концов с расщепления камня. Промойте капилляра с метанолом (500 мкл) с помощью шприца насоса для очистки непрореагировавшего реагентов. Сухие капилляра с газом азота (10 psi, ≥12 h).
2. Подготовка LPA покрытия
   Примечание: Данная процедура основана на Чжу и др. ²² с незначительными изменениями.
   1. Подготовьте раствор акриламида (40 мг акриламида в 1 мл воды) и Аммония пероксодисульфат (APS) раствор (5% [w/v] в воде).
   2. Добавить 2-3 мкл раствора APS 500 мкл раствора акриламида, вихревой смесь и Дега газом азота 5 мин для удаления кислорода в решении.
   3. Загрузить смесь в предварительно обработанные капилляров, с помощью вакуума, уплотнение обоих концах капилляра с резины силики и проинкубируйте его в водяной бане при 50 ° C за 40 мин.
   4. Удаление небольшую часть (~ 5 мм) из капилляра с обоих концов с расщепления камня. Нажмите непрореагировавшего решения из капилляра с водой (200 мкл), с помощью насоса шприца.
      Примечание: Убедитесь, полимер, выталкивается из капилляра является агарозы гелеобразной консистенции. Длительный инкубационный шаг (до ~ 45-50 мин) может привести к более капиллярное покрытие. С длительного реакции капилляр может быть заблокирован и высокого давления необходимо вытеснить из полимера с водой. ВЭЖХ насос может использоваться для этой цели.

2. травление капилляра с плавиковой кислоты

Предупреждение: Используйте процедуры безопасности при обработке фтористоводородную кислоту (HF) решения. Все операции, связанные с кв должны быть сделаны в химические вытяжки. Перед любой операцией, ВЧ связи убедитесь, что гель 2,5% кальция глюконат доступен для использования в случае воздействия. Двойной перчатки обязательны, типичный нитриловые внутри и тяжелых неопрена перчатка вне. Носите пальто лаборатории и химические защитные очки. После операции HF отделить жидких и твердых отходов. Жидкие отходы кв должны быть нейтрализованы сразу с высокой концентрации натрия гидроксида раствор для временного хранения до отходов пикап. Твердых отходов ВЧ необходимо временно храниться в пластиковый контейнер, что выложено две толстые пластиковые один галлон Ziploc мешки и крышкой. Должным образом должны быть помечены как твердых и жидких отходов.

1. Записать часть капилляра с помощью нежный пламени (например, карманные зажигалки) чтобы удалить полиимида наружной покрытие (1 см в длину) около 4 см от один конец капилляра. Аккуратно очистите сожгли часть капилляра, вытирая удалить полиимидные, покрытие полностью.
   Примечание: Осторожно, как часть капилляра без полиимида покрытие будет немного хрупкой.
2. Просверлите маленькое отверстие на конце трубки 200 мкл вокруг такого же размера как капиллярные наружный диаметр провести достаточно капилляр на месте после того, как оно резьбой через это отверстие. Проденьте конец капиллярной, которая близка сожгли часть через отверстие до тех пор, пока находится в трубку сожгли часть.
   Примечание: Рекомендуется проверить размер отверстия с конца капиллярной от сожгли часть обеспечить правильный размер, как сожгли часть капилляра хрупок.
3. Мкл ~ 150 кв (48-51% раствор в воде) на трубу 200 мкл так что ВЧ решение о на полпути вверх сожгли часть на капилляра. Инкубируйте капилляров в раствор HF при комнатной температуре 90-100 мин.
   Примечание: Рекомендуется, что создается другое отверстие в крышке трубки и некоторых небольших объектов (например, кончик небольшой пипеткой) используется для держать трубку во время инкубации. Наконечник пипетки может использоваться для прокола пены или некоторые другие прочную платформу из которого реакционной камере можно повесить, создание безопасной среды. Место бумажные полотенца ниже трубка, содержащая ВЧ и надлежащих процедур в случае разлива.
4. Удаление капиллярной из трубки и вымойте внешности с дейонизированной водой, чтобы удалить любые остаточные ВЧ.
   Примечание: Убедитесь, что внешний диаметр капилляра в самой узкой части сожгли часть теперь меньше чем 100 мкм, как это должно быть.
5. Вырежьте травлению часть капилляра в середине самой узкой части, используя расщепления камня производить разделения капиллярного с менее чем 100 мкм в o.d. на одном конце. Вырежьте-травленная конец капилляра для получения 1-м разделения капиллярного.
   Примечание: Удаление отходов ВЧ институционально предписанного протоколом.

3. Подготовка образцов

1. Подготовка смеси стандартного белка
   1. Подготовить стандартный белка смесь, содержащую c тситохрома (Cyto.c, 12 кДа, 0,1 мг/мл), лизоцим (14.3 кДа, 0,1 мг/мл), β-казеина (24 кДа, 0,4 мг/мл), миоглобина (16,9 кДа, 0,1 мг/мл), ангидразы (CA, 29 кДа, 0.5 мг/мл) и бычьим сывороточным альбумином (БСА, 66,5 кДа 1.0 мг/мл) в LC-MS класс воды как Стоковый раствор.
      Примечание: Стоковый раствор может быть aliquoted и хранятся при температуре-80 ° C для использования.
   2. Стоковый раствор разбавляют на коэффициент 10 с 50 mM бикарбонат аммония раствор (pH 8.0) в воде класса LC-MS для анализа CZE-MS.
      Примечание: Фильтр раствор бикарбоната аммония перед использованием с мембранный фильтр (например, 0,2 мкм мембраны нитроцеллюлозы и 50 мм в диаметре).
2. Подготовка образца E. coli
   1. Культура клетки E. coli (K-12 MG1655) в среде фунтов при 37 ° C при встряхивании в 225 об/мин, до тех пор, пока значение OD600 подходы 0,7. Собирать E. coli клетки черезцентрифугирования (3,283 x g, 10 мин) и промойте их в несколько раз фосфат амортизированное saline (PBS) для удаления среды.
   2. Приостановить клеток E. coli литического буфера, содержащий 8 М мочевины, Ингибиторы протеаз и бикарбонат аммония 100 мм (рН 8.0) и ultrasonicate на льду 15 мин с использованием ультразвуковой ячейки disruptor с рогом Кубок для полного клеток лизис.
      1. Равным 50 Скважность (%) и Выходного контроля 7 для disruptor ультразвуковой ячейки.
   3. Центрифуга lysate на 18 000 х g для 10 минут собрать супернатант и отбросить гранулы. Используйте небольшое Алиготе супернатант для измерения концентрации белка с assay bicinchoninic кислоты (BCA).
      Примечание: Lysate должен быть разбавлен по крайней мере по три для уменьшения концентрации мочевины, меньше, чем 3 M для того, чтобы стать совместимыми с BCA assay раза. BCA генотипирования основе процедуры производителя.
   4. Смешайте 1 мг E. coli белков с холодной ацетона с тома соотношение 1:4 и держать смеси при 20 ° C ночь до осадок белков.
      Примечание: Выполнение всех экспериментов с использованием ацетона в химические вытяжки.
   5. Спин вниз осажденный белки (12000 x g, 5 мин) и удалить супернатант. Помыть лепешка с холодной ацетон снова (же объем, как раньше) и спин вниз снова.
   6. Удалить супернатант и позволяют гранулы для просушки в химические вытяжки на пару минут.
      Примечание: Не пересушить Пелле белка.
   7. Распустить осажденный белки E. coli (1 мг) в 200 мкл 8 M мочевины в бикарбонат аммония 100 мм (рН 8,0).
   8. Денатурируйте, уменьшить и алкилата образца.
      1. Проинкубируйте образцы при 37 ° C за 30 мин до Денатурировать белки.
      2. Уменьшить с Дитиотреитол (DTT), добавив 2 мкл раствора DTT 1 М (в 100 мм бикарбонат аммония) в образце и инкубации образца при 37 ° C за 30 мин.
      3. Алкилата белки с iodoacetamide (IAA), добавив 6 мкл раствора IAA 1 М (в бикарбонат аммония 100 мм) в образце и Проинкубируйте образцы для 20 мин при комнатной температуре в темноте.
      4. Утолить избыток IAA с DTT, добавив 2 мкл раствора 1 М DTT и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре. Подкислять образца с муравьиной кислоты (ФА), чтобы получить окончательное FA концентрации 1% (v/v).
         Примечание: Сокращение и алкилирования выполняются для помощи разворачивается белков для вниз по течению фрагментации. Эти шаги будут потеряны данные дисульфидными облигаций. Если цель состоит в том, чтобы изучить дисульфидными облигаций на белки, Избегайте этих шагов. Помните, чтобы обрабатывать все концентрированные кислоты решения в химические вытяжки.
   9. Опреснения образца с помощью ловушки столбец C4 (например, 4 мм и.д., 10 мм в длину, Упакованные с частицами 3-мкм, имеющие 300-Е поры) с системой ВЭЖХ. Используйте детектор УФ на длине волны 254 Нм для обнаружения.
      1. Задайте мобильных фазе расхода на 1 мл/мин активировать столбец, перемещая его с 80% (v/v) Ацетонитрил (АКС), 0,1% FA в воде в течение 10 мин и сбалансировать, перемещая его с 2% (v/v) АКС, 0.1% FA в воде в течение 10 мин.
      2. Загрузить 500 мкг белков на столбце и опреснения, перемещая их с 2% (v/v) АКС, 0.1% FA в воде в течение 10 мин со скоростью потока 1 мл/мин.
      3. Элюировать белки с 80% (v/v) АКС, 0.1% FA в воде в течение 3 минут при скорости потока 1 мл/мин. Собирать элюата и lyophilize с вакуумным концентратор.
         Примечание: Столбец C4 ловушка может использоваться для опреснения большое количество белков, но не низкой микрограмм белков из-за потери возможной образца. Для ограниченного белка материалы рассмотрите возможность использования наконечники с C4 СМИ для обессоливания белка. Будьте осторожны, чтобы не пересушить белки при лиофилизации образца.
   10. Растворяют в 250 мкл бикарбонат аммония 50 мм (рН 8,0) для экспериментов CZE-МС 500 мкг белка (при условии образец потери во время подготовки пробы).

4. Установка системы CZE-MS/MS и анализ образцов

1. Установка системы CZE
   1. Подготовить BGE, содержащих 5% или 10% (v/v) уксусная кислота (рН ~2.4 или ~ 2.2) в LC-MS класс воды. Положите ~1.5 мл Булак ДжиИПи Инжиниринг в BGE флакон, совпадающий с панели буфера CZE Автоматический пробоотборник.
      Примечание: Сделайте свежий BGE каждую неделю и изменить решение BGE во флаконе каждый день чтобы избежать любого загрязнения.
   2. Добавить пример решения (5-200 мкл) вставить трубу и положить вставить трубку в thatmatches флакон образца с образца лоток CZE Автоматический пробоотборник.
   3. Загрузите образец, Булак ДжиИПи Инжиниринг и разделения капиллярного в CZE Автоматический пробоотборник.
      Примечание: Язык, используемый в этом протоколе наиболее точно отражает использование одной конкретной Автоматический пробоотборник (см. Таблицу материалов), но принципы могут быть применены к другим автосампл.
      1. Выберите загрузить образец в странице ручного управления CZE Автоматический пробоотборник. Загрузите BGE флакона в буфер лоток Автоматический пробоотборник, отметив свою позицию в буфере лоток. Загрузите образец флакона в образце лоток Автоматический пробоотборник, отметив свою позицию на панели образцов.
         Примечание: Прибор может эксплуатироваться в ручном режиме, нажав на изображение инструмента для Монитора устройства на странице главного инструмента и выбрав ручной под Непосредственным контролем.
      2. Загрузите разделения капиллярного в автоматический пробоотборник CZE, используя-травленная конец капилляра. Автоматический пробоотборник Положите Выравнивание позиции, с помощью ручного управления. Поток-травленная конец капилляра в отверстие, которое используется для хранения разделения капиллярного до тех пор, пока он не может физически резьбовые далее.
         Примечание: В этом случае, конец капилляра почти на той же высоте, как в конце электрода, и по крайней мере 50 мкл пример в пробирку образца требуется убедиться, что конец капилляра погружается в примере во время инъекции. Если объем образца является низким (т.е., 5 мкл), высота инъекции конец капиллярной потребности быть скорректированы, как описано в шаге 4.1.3.2.1.
         1. Отрегулируйте высоту инъекции конец капилляра, если объем образца ниже чем 50 мкл (т.е., 5 мкл). Автоматический пробоотборник переключитесь в режим ожидания с помощью ручного управления. Введите образец положение в системе и переместить капилляра в образце. Нажмите инъекции конец капилляра далее вплоть до достижения нижней части образца флакона.
            Примечание: В этом случае образец инъекции могут выполняться с образцом всего 5 мкл во флаконе.
      3. Продолжая использовать ручное управление, флеш капилляра с Булак ДжиИПи Инжиниринг для 20 минут, используя давление 20 psi.
2. Настройка интерфейса CZE-MS
   1. Тянуть боросиликатного стекла капиллярные (1 мм диаметр, 0,75 мм в и.д., длиной 10 см) в двух электроспрей излучателей с отверстием 20-40 мкм в o.d.
      Примечание: Сохранить длину электроспрей излучатель как 4-5 см и разрезать его с расщепления камня при необходимости. Распоряжаться всех стеклянных отходов в Шарпс контейнер. Ниже приводятся параметры, чтобы получить советы 20 - 40 мкм. Установите тепла для 498, тянуть до 5, скорость до 10, задержка 150, и давление до 200. Проверьте размер излучателей с помощью микроскопа перед использованием. При необходимости слегка отрегулируйте параметры.
   2. Гора коммерческих электро кинетически перекачиваемой оболочка потока интерфейса (см. Таблицу материалы) в передней части масс-спектрометр. Заполните резервуар буфер оболочка с буфером, содержащие 10% (v/v) метанола и 0,2% (v/v) фа в воде класса LC-MS.
   3. Промойте T в интерфейсе оболочка буфера через давления вручную с помощью шприца. Поток 1-мм OD конце электроспрей эмитентом через рукав трубки и подключения эмиттера с одним портом Tчерез штуцер. Просто промойте T вручную снова с помощью шприца для заполнения излучатель с оболочкой буфера.
   4. Подрегулируйте расстояние между отверстия излучателя и вход масс-спектрометр для ~ 2 мм с помощью камеры, которые пришли с интерфейсом. Примените 2 - 2,2 кв напряжения на флаконе буфер оболочка для электроспрей. Отрегулируйте напряжение спрей для достижения стабильной электроспрей.
      Примечание: Если не электроспрей или нестабильной электроспрей наблюдается, проверьте интерфейс, чтобы убедиться, что есть нет больших пузырей в эмиттере, в Tи трубы, которая используется для соединения оболочкой флакон буфера и Т. Расстояние между отверстия излучателя и входа в масс-спектрометр может быть примерно оценена, сравнивая его с 1-мм OD излучатель. Спрей напряжения зависит от размера эмиттера. Для излучателей 20 - 40 мкм 2-2,2 кв является достаточно хорошим. Не забудьте всегда будьте осторожны при использовании высоких напряжений.
   5. Выключить напряжение спрей и мягко поток травлению конец разделения капиллярного через T на излучатель, до тех пор, пока он не толкнул дальше. Приложите низкого давления (т.е., 5 psi) в конце инъекции капилляра в ходе этого процесса, чтобы убедиться, что есть никаких пузырей в капилляр.
      Примечание: Капиллярные подключен к T через рукав трубы и фитинга. Отрегулируйте положение травлению конец капилляра в излучатель с помощью камеры в течение 500 мкм. Расстояние может быть примерно оценена, сравнивая его с 1-мм OD излучателя.
   6. Остановите низкого давления в конце инъекции капилляра. Промойте излучатель немного буфер оболочка. Опять же применяются 2-2,2 кв напряжения спрей для тестирования спрей.
3. Настройка метода CZE для образца инъекции, разделения, промывка капилляра и срабатывание в масс-спектрометр для сбора данных
   1. Выберите новый метод в раскрывающемся меню файл на экране главный инструмент, чтобы начать новый метод.
   2. Выберите Вход как SV/EV, лоток как образец, давление как 5 psi, кв 0, а Продолжительность как 95 s для инъекций образца.
      Примечание: Образец впрыскивается в капиллярной через давления. Объем впрыска образец может быть рассчитываются на основе время давление и инъекции, с помощью закона Пуазейля, которое в. К примеру, 5 psi для впрыска 95-s образца соответствует около 500 nL объем выборки загрузки для 1-m долго разделения капиллярного (50-мкм и.д.).
   3. Выберите параметры для разделения CZE и Настройка параметров для запуска сбора данных.
      1. Установите входе InV, лоток как буфер, давление как 0 psi, кв 30, а Продолжительность как 4200 s для разделения смеси образца стандартный белка. Установите входе InV, лоток как буфер, давление как 0 psi, кв 20, а также Продолжительность как 6600 s для разделения образца протеома E. coli .
         Примечание: Напряжения, применяется для разделения может быть скорректирована по сложности образца. Для простых белков образцов, 30 кв могут быть применены к ускорить анализ. Для сложных образцов, 20 кв применяется замедляют разделение и приобрести больше МС/МС спектры для proteoform идентификаторы.
      2. Настройка параметров для запуска сбора данных под Timed события. Задать время (s) как 0,0 и тип как реле 1 для активировать на шаге 1; Задать время (s) как 1.0 и тип реле 1 для деактивировать на шаге 2.
   4. Выберите Вход как InV, лоток как буфер, давление как 10 psi, кв 30, а Продолжительность 600 s для промывки капилляра.
   5. Сохраните файлы метод CZE-МС и МС/МС экспериментов.
4. Настройка МС и МС/МС
   1. Настройка параметров анализа интактных белков с помощью масс-спектрометр квадруполь Ион-ловушка МС и МС/МС (см. Таблицу материалы).
      Примечание: Режим положительных ионов и выше энергии Столкновительное диссоциации (HCD) для фрагментации заняты.
      1. Отрегулируйте настройки параметров файла: Включите режим интактных белков и использовать треппинг давление 0,2. Установите ионного переноса капиллярного температуру до 320 ° C и s объектив РФ уровень до 55.
      2. Построение файла метод МС и МС/МС.
         1. Для полной МС установите количество microscans до 3, в резолюции 240 000 человек (по м/z 200), автоматическая регулировка усиления контроля (СМЖЛ) целевого значения для 1E6, время максимальной впрыска до 50 мс и сканирования диапазона до 600-2000 m/z.
      3. Для MS/MS используйте приобретение зависящих от данных (ДВР) для восьми наиболее интенсивных ионов в полном спектре MS. Задание окна изоляции 4 m/z и нормализованных Столкновительное энергии (Лазурный берег NCE) до 20%. Задайте количество microscans 1, резолюции 120 000 человек (по м/z 200), целевое значение СМЖЛ для 1E5 и время максимальная впрыска до 200 мс.
      4. Установите порог интенсивности вызывает фрагментацию 1E5 и ионов с состояние заряда выше, чем 5 быть изолированы для фрагментации. Включите исключение изотопов и динамического исключения до 30 s.
         Примечание: Количество microscans для МС/МС может быть увеличена до 3. В этом случае Top3 ДВР метод может использоваться для того, чтобы уменьшить время цикла.
   2. Настройка проводной связи между CE Автоматический пробоотборник и масс-спектрометр для автоматического запуска сбора данных. Подключите один конец провода к A 1 контакт реле и реле 1 B контакты на задней части Автоматический пробоотборник CE. Подключите другой конец проволоки для Запуска в - и в + на стороне масс-спектрометр.
5. CZE-MS/MS эксперимента и анализ образцов
   1. Применить 30 кв, с помощью ручного управления CE в конце образца инъекций и 2-2,2 кв на флаконе буфер оболочка, используя внешний блок питания для тестирования разделения капиллярного и электроспрей.
      Примечание: Разделение ток, в этом случае составляет около 8-9 МКА если уксусная кислота 5% (v/v) используется в качестве Булак ДжиИПи Инжиниринг.
   2. Настройка последовательности приобретение данных на компьютере масс-спектрометр, выбрав новую последовательность.
      1. Выберите неизвестный тип образца и укажите путь и имя файла. Укажите метод MS, чтобы использоваться для каждого образца, работают под Инструмент метод.
         Примечание: Поскольку есть отдельный компьютер для управления автоматический пробоотборник CE, положение образца не нужно быть указаны здесь.
   3. Настройка последовательности CZE разделения на компьютере CE для обозначения позиция в буфере, пример позиции и метод CZE. Чтобы начать новую последовательность, выберите последовательность под анализ раскрывающееся меню на странице главного инструмента.
   4. Сначала запустите метод сбора данных на компьютере масс-спектрометр, выбрав запустить последовательность (или запустить образец на одном бежит). Затем запустите последовательность CE на компьютере автоматический пробоотборник CE.
      Примечание: Когда напряжение разделения на после инъекции образца, сигнал передается от CE Автоматический пробоотборник масс-спектрометр для запуска сбора данных. Разделение текущего будет уменьшаться в начале во время разделения из-за динамических рН Джанкшен Образец укладки. Затем постепенно восстанавливается ток.

5. база данных поиск собранных файлов Raw с помощью программного обеспечения TopPIC

1. Передача файлов .raw, включая МС и МС/МС данные от масс-спектрометр компьютера на компьютер, выделенный для базы данных поиска.
   Примечание: Эти файлы .raw могут быть большими и требует мощного компьютера для того, чтобы достичь быстрой базы данных поиска.
2. Скачайте ProteoWizard и TopPIC люкс на компьютер, выделенный для базы данных поиска.
   Примечание: ProteoWizard и TopPIC являются открытым исходным кодом и можно найти в Интернете (ProteoWizard: http://proteowizard.sourceforge.net; TopPIC люкс: http://proteomics.informatics.iupui.e.,u/software/toppic/). UniProt базы данных используются для базы данных поиска и можно найти на веб-сайте UniProt.
3. Конвертировать файлы .raw в .mzML файлы с msconvert, инструмент преобразования формата файла MS в ProteoWizard²⁸. В GUI msconvert (MSConvertGUI.exe) нажмите кнопку Обзор и выберите файл .raw, чтобы быть преобразованы. Выберите mzML в качестве выходного формата и держать все остальные параметры на их значения по умолчанию. Нажмите кнопку начать в нижней правой части GUI.
4. Конвертировать файлы .mzML в .msalign файлы с инструментом TopFD в TopPIC люкс²⁹.
   1. В GUI TopFD (topfd_gui.exe) нажмите на кнопку файл и выберите файл .mzML, созданный на предыдущем шаге. Оставьте значения по умолчанию параметров и нажмите кнопку начать в нижней правой части GUI.
      Примечание: TopFD преобразует прекурсоров и фрагмент изотопный кластеры monoisotopic масс и определяет возможные proteoform функции в MS1 данных путем объединения прекурсоров изотопный кластеры с аналогичными monoisotopic масс и закрыть миграции раз. Три файлы будут создаваться из TopFD, включая файл ms1.msalign, файл ms2.msalign и Feature-файл. Файлы ms1.msalign и ms2.msalign содержат deconvoluted monoisotopic массы MS1 и МС/МС спектры, соответственно. Feature-файл содержит возможные proteoform функции.
5. Выполните поиск по базе данных с TopPIC (версия 1.1.3) в TopPIC люкс³⁰.
   1. В TopPIC GUI (toppic_gui.exe) нажмите на файл базы данных и выберите соответствующую базу данных для поиска.
   2. Нажмите на спектр файлов и выберите файл ms2.msalign, созданный в шаге 5.4.1 как входные данные. Выберите файл компонента MS1 и выберите Feature-файл, созданный в действии 5.4.1.
   3. Установите хвоща carbamidomethylation (C57) как фиксированной модификация вследствие лечения IAA.
      Примечание: Текстовый файл может также создаваться с различными модификациями фиксированной в текстовом редакторе. Затем можно выбрать текстовый файл, используя кнопку файл рядом с фиксированной изменения в TopPIC GUI.
   4. Выберите функцию манок базы данных и в разделе Параметры среза, выберите ДРД (ложные обнаружения ставка) в раскрывающемся меню рядом с уровнем спектра. Значение ФДР 0,01 на уровне спектра и 0,05 на уровне proteoform.
      Примечание: TopPIC предоставляет несколько вариантов для фильтрации результатов: спектра уровня ФДР, proteoform уровень ФДР или оба. ФДР вычисляется на основе целевого манок подход³¹.
   5. Оставьте Создание функция снят и задайте погрешность (ppm) до 15.
   6. В разделе Расширенные параметрывыберите в раскрывающемся меню 2 для максимального числа массовых изменений. Установите Максимальная масса сдвиг (Da) неизвестных модификаций 500 ПДР оставьте все остальные параметры на их значения по умолчанию и нажмите кнопку начать в нижней правой части GUI.
      Примечание: TopPIC программное обеспечение генерирует два полученные текстовые файлы. Файла с суффиксом. OUTPUT_TABLE содержит список выявленных proteoform спектр матчей (PrSMs) и один с суффиксом. FORM_OUTPUT_TABLE содержит список выявленных proteoforms. Для каждого PrSM программное обеспечение предоставляет общую информацию на матч, наблюдаемые осколков, соответствующий фрагмент ионов, и обнаруженных массы сдвигов.

На рисунке 1 показана схема динамической системы CZE-ЭСИ-MS основанные на рН Джанкшн, используемых в эксперименте. Долгое вилки образца в основной буфер впрыскивается в МПУ покрытием разделения капиллярного заполнены с кислой Булак ДжиИПи Инжиниринг. После применения высокого напряжения I и II, аналитов в зоне образца будет концентрированной через метод динамической рН Джанкшен. Чтобы оценить производительность системы CZE-MS, обычно анализируется Стандартный белка смесь (цитохром с, лизоцима, β-казеина, миоглобин, CA и BSA). Представитель electropherogram смеси в стандартной белка показано в рисунке 2A. Стандартный белка смесь обычно выполняются по крайней мере в двух экземплярах, оценить эффективность разделения и воспроизводимость системы. Эффективность разделения может вычисляться с количество теоретических тарелок некоторых белков, как показано на рисунке 2B. Воспроизводимость может оцениваться относительно стандартных отклонений белок интенсивность и миграции времени. Рисунок 3 A показывает увеличенное представление electropherogram образец протеина E. coli , проанализировали динамические основанные на рН Джанкшен CZE-МС/МС. Нормированный уровень (NL) белок интенсивность должна быть в масштабе 10⁸ если 1 мкг E. coli белков загружаются для анализа с масс-спектрометр квадруполь-ионная ловушка. Увеличенное представление о electropherogram может использоваться для оценки разделение окна системы. В этом случае разделения окна является 80-90 мин Рисунок 3B показывает пример PrSM, включая общие сведения соответствующего proteoform, белок последовательность, наблюдаемых осколков и модификации. Очень низкой E-Value (2.11E-48) и спектральные ФДР (0) предлагаю высокая достоверность идентификатор proteoform Большое количество ионов соответствует фрагмент (60) далее указывает высокая достоверность идентификатора. Наблюдаемые осколков показывает, что фрагментация proteoform является высокоэффективным, охватывающих Термини и средней части proteoform. N-терминальный расщеплении трех аминокислот (MTM) определяется путем поиска по базе данных.

Рисунок 1 : Диаграмма динамической системы CZE-ЭСИ-MS основанные на рН Джанкшен. Образец растворяют в 50 мм бикарбонат аммония, рН 8. Булак ДжиИПи Инжиниринг — 5% или 10% (v/v) уксусная кислота, ~2.4 рН или ~ 2.2. Капилляр МПУ покрытием 1-м используется для разделения. Электро кинетически перекачиваемой оболочка потока интерфейс используется для пара CZE МС. Масс-спектрометр квадруполь-ионная ловушка используется. Высокого напряжения я (HV I) обеспечивается питания интегрированы в CE Автоматический пробоотборник для разделения. Высокого напряжения II (HV II) предоставляется отдельный источник питания для электроспрей. Масс-спектрометр обоснована. Расстояние между отверстия излучателя и вход масс-спектрометр — ~ 2 мм. Расстояние между концом травлению капилляров в эмиттере и отверстия излучателя составляет менее 500 мкм. Размер отверстия излучателя электроспрей составляет 20-40 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Данные о стандартных белка смесь анализируемой динамические основанные на рН Джанкшен CZE-г-жа (A) Эта группа показывает базовый пик electropherogram. (B) Эта группа показывает количество теоретических тарелок (N) трех белков. Объем впрыска образец был 500 nL. HV, я был 30 кв для разделения и HV II был 2,2 кв для электроспрей. Булак ДжиИПи Инжиниринг был 5% (v/v) уксусная кислота, рН 2.4. Образец был в бикарбонат аммония 50 мм (рН 8) и содержит цитохром с (0,01 мг/мл), лизоцим (0,01 мг/мл), β-казеина (0,04 мг/мл), миоглобина (0,01 мг/мл), ангидразы (CA, 0,05 мг/мл) и бычьим сывороточным альбумином (БСА, 0,1 мг/мл). Не МС/МС спектры были приобретены для стандартного белка смесь образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Данные E.coli proteomeanalyzed, динамические основанные на рН Джанкшен CZE-MS/г-жа (A) это представление показывает масштаб в группы на основе пик electropherogram E. coli образец протеина. (B) Эта группа показывает пример PrSM определены через поиск базы данных TopPIC, приобретенных спектров МС/МС. Общая информация соответствующего proteoform, последовательности белка, наблюдается осколков, и представлены модификации. При необходимости, можно также рассматривать соответствующий фрагмент ионов из отдельных PrSM. HV, я был 20 кв для разделения и HV II был 2,2 кв для электроспрей. Булак ДжиИПи Инжиниринг был 10% (v/v) уксусная кислота, рН ~ 2.2. Образец в бикарбонат аммония 50 мм (рН 8) и концентрация белка был 2 мг/мл. Объем впрыска образец был 500 nL. Top8 ДВР метод был использован для получения данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Здесь мы предоставляем подробный протокол использовать CZE-MS/MS для высокого разрешения характеристики proteoforms в образцах простых белков и для крупномасштабных идентификации proteoforms в образцах сложных протеома. Схема системы CZE-ЭСИ-MS/MS это показано на рисунке 1. Существует четыре важнейшие шаги в протоколе. Во-первых подготовка высококачественных LPA покрытия на внутренней стенке капилляра разделения является чрезвычайно важным. LPA-покрытием разделения капиллярного можно уменьшить EOF в капилляр, расширить окно разделения CZE и уменьшить белка адсорбции на своей внутренней стенки¹⁹. Реакция полимеризации для изготовления LPA покрытие осуществляется через Заполнение капилляра с смесью акриламида (мономер) и Аммония пероксодисульфат (Инициатор полимеризации), следуют Отопление капилляров на водяной бане, чтобы вызвать ²²реакции. Время в водяной бане имеет решающее значение. Слишком короткое время реакции приведет к неполной реакции и плохое покрытие. Мы обычно позволяют реакция группы до 50 минут, позволяя реакции перейти на более длительный период для лучшего покрытия. С длительного реакции капилляр может быть заблокирован и ВЭЖХ насос может потребоваться использовать для вытолкнуть полимер внутри капилляра с водой. Один из капилляров, МПУ покрытием непрерывно может использоваться для около одной недели, основываясь на данных литературы и наш опыт²².

Вторым важным шагом является муфта CZE MS с электро кинетически перекачиваемой оболочка потока CE-MS интерфейс^25,26. Расстояние между окончанием разделения капиллярного в эмиттере ESI и отверстия излучателя значительно влияет на чувствительность CZE-MS, и короткие расстояния производит выше чувствительность²⁵. В конце разделения капиллярного необходимо быть выгравированы с HF, чтобы уменьшить ее наружный диаметр от 360 мкм до менее чем 100 мкм, позволяя конец капилляра для толкания недалеко от отверстия излучателя. Расстояние между отверстия излучателя и масс-спектрометр вход был оптимизирован для достижения лучших чувствительность и хорошая устойчивость²⁶. Мы обычно держатся на расстоянии около 2 мм.

Третьим важнейшим шагом является CZE-МС и МС/МС анализ с динамические основанные на рН Джанкшен онлайн Образец укладки¹⁹. PH буфер образца и BGE должны быть значительно отличается, с тем чтобы обеспечить эффективное Образец укладки. Концентрация белка в образце должна быть соответствующей. Если слишком высока концентрация белков, белки можно ускорили в капилляр во время укладки образца. Концентрация белка образцов для рисунки 2 и 3 можно рассматривать как типичные примеры. Последний важный шаг-это поиск в базе данных с TopPIC для proteoform идентификаторы³⁰. Несколько шагов необходимы для преобразования файлов, прежде чем можно выполнить поиск по базе данных с TopPIC. Надлежащего ФДР фильтр необходим для обеспечения качества выявленных proteoforms. Мы обычно используют 1% спектра уровня FDR для фильтрации результатов поиска базы данных. Мы отмечаем, что инициатива сверху вниз протеомики является очень хороший ресурс для методов протеомики сверху вниз и данных анализа программного обеспечения^32,33.

Мы должны отметить, что некоторые части протокола может потребоваться изменение слегка и устранения некоторых неполадок может потребоваться. Время полимеризации в водяной бане для подготовки LPA покрытия могут отличаться в разных лабораториях. Время для ВЧ травления разделения капиллярного может потребоваться быть слегка изменен из-за разной температуры в различных лабораториях. При создании интерфейса CE-MS, убедитесь, что электроспрей стабильной до резьбы разделения капиллярного в эмиттере электроспрей. Если не электроспрей или нестабильной электроспрей наблюдается, проверьте интерфейс, чтобы убедиться, что есть нет больших пузырей в эмиттере, в Tили в трубку, которая используется для соединения оболочкой флакон буфера и Т. Кроме того, расстояние между отверстия излучателя и входа в масс-спектрометр может повлиять на стабильность электроспрей и обычно около 2 мм. Электроспрей напряжения может также повлиять на стабильность спрей. Для 20 - 40 мкм излучателей обычно достаточно 2-2,2 кв. Как описано в предыдущем пункте, концентрацию белка в образце должна быть соответствующей. Если слишком высока концентрация белков, белки можно ускорили в капилляр во время укладки образца. Обратите внимание на текущий профиль на компьютере автоматический пробоотборник CE. Если ток равен нулю в самом начале выполнения CZE, это означает, что вилки воздуха вдувается в капилляр во время инъекции шаг выборки. Убедитесь, что достаточно большой объем выборки во флаконе. Если текущей является нормальным в начале и вдруг становится ноль во время выполнения, это обычно означает, что концентрация белка является слишком высокой.

CZE-MS/MS, основанных на этом протоколе позволяет с высоким разрешением характеристику примеры простых белков и крупномасштабных сверху вниз протеомики сложных протеомов. В качестве примера CZE-MS подошли к высоким разрешением характеристика стандартных белка смеси, содержащей шесть белков¹⁹. Как показано на рисунке 2, CZE-MS четко отделены шестью белки с разделение высокой эффективности, выявили три формы β-казеина и обнаружено много примесей. В качестве другого примера single shot CZE-MS/MS можно воспроизвести принесли свыше 500 proteoform идентификаторов и 190 белка от протеома E. coli , используя только 1 мкг E. coli белков с ФДР спектра уровень 1%¹⁹. CZE-MS/MS улучшить количество proteoform идентификаторы из сложных протеом, по крайней мере три раза, по сравнению с предыдущими исследованиями single shot CZE-MS/MS. Как показано на рисунке 3A, CZE-MS/MS одновременно достигли объем выборки загрузки 500-nL и 90 мин разделения окна для анализа E. coli протеома¹⁹. TopPIC программное обеспечение может предоставить всеобъемлющую информацию о выявленных proteoforms (рис. 3B). CZE-МС/МС система обеспечивает протеомики сообщества с полезным инструментом для крупномасштабных и высоким разрешением протеомики сверху вниз.

CZE-МС/МС все еще имеет некоторые ограничения для протеомики глубоко сверху вниз. Хотя мы продемонстрировали, что CZE-MS/MS может достигнуть над 500proteoform идентификаторы из E. coli протеома в один проход, количество proteoform идентификаторы из single shot CZE-MS/MS является только примерно 50%, от^{, состояние искусства RPLC-MS/MS34 35}. В этом протоколе только HCD используется для фрагментации белка, приводит к ограниченным фрагментации покрытий выявленных proteoforms. Внесены некоторые улучшения может быть протокол CZE-MS/MS повысить количество и качество proteoform идентификаторы из single shot CZE-МС/МС. Во-первых увеличение длины капиллярных разделения должна обеспечить более широкое разделение окна, приводит к более proteoform идентификаторы. Во-вторых быстрее с помощью масс-спектрометра с гораздо более высокой разрешающей способности, сканирование, скорость и несколько фрагментации методы (например, HCD,³⁶ электрона передачи диссоциации [ETD],³⁷ и ультрафиолетового фотодиссоциации [UVPD]³⁸ ) будет, безусловно, улучшить количество proteoform идентификаторы и фрагментации покрытия определенных proteoforms.

Авторы не имеют ничего сообщать.

Авторы благодарят Heedeok Hong группу в Отдел химии, Университет штата Мичиган, обеспечивающих любезно клетки Escherichia coli для экспериментов. Авторы благодарят поддержку от национального института Генеральной медицинских наук, национальные институты здравоохранения (NIH) через Грант R01GM118470 (для X. Liu) и Грант R01GM125991 (л солнцем и X. Liu).