Proteómica de arriba hacia abajo a gran escala mediante electroforesis capilar de zona Spectrometry total en tándem

Se describe un protocolo detallado para la separación, identificación y caracterización de proteoforms en muestras de proteínas utilizando la zona capilar electroforesis-electrospray ionización-spectrometry total en tándem (CZE-ESI-MS/MS). El protocolo puede utilizarse para la caracterización de alta resolución de proteoforms en las muestras de proteína simple y la identificación a gran escala de proteoforms en muestras complejas del proteoma.

Zona capilar electroforesis-electrospray ionización-spectrometry total en tándem (CZE-ESI-MS/MS) ha sido reconocido como una herramienta útil para proteómica de arriba hacia abajo que tiene como objetivo caracterizar proteoforms en proteomas complejos. Sin embargo, la aplicación de CZE-MS/MS para proteómica de arriba hacia abajo a gran escala ha sido impedido por la baja capacidad de carga de muestra y estrecha ventana de separación de CZE. Aquí, se describe un protocolo mediante CZE-MS/MS con un volumen de muestra de carga escala microlitro y una ventana de separación de 90 min para proteómica a gran escala de arriba hacia abajo. La plataforma de CZE-MS/MS se basa en una poliacrilamida lineal (LPA)-revestido separación capilar con flujo electroosmotic extremadamente bajo, un método de concentración dinámica muestra en línea basado en el cruce de pH con una alta eficiencia para el amontonamiento de proteína, un electro-cinéticamente bombeado vaina flujo CE-MS interfaz con muy alta sensibilidad y un espectrómetro de masas de trampa de iones con alta resolución en masa y velocidad de exploración. La plataforma puede ser utilizada para la caracterización de alta resolución de muestras simple proteína intacta y la caracterización a gran escala de proteoforms en diversos proteomas complejos. Por ejemplo, demuestra una muy eficiente separación de una mezcla de proteína estándar y una detección muy sensible de muchas impurezas utilizando la plataforma. Otro ejemplo, esta plataforma puede producir más de 500 proteoform y 190 identificaciones de proteína de un proteoma de Escherichia coli en un CZE-MS/MS solo ejecutan.

Proteómica de arriba hacia abajo (TDP) tiene como objetivo para la caracterización a gran escala de proteoforms dentro de un proteoma. TDP se basa en la separación de fase líquida efectiva de proteínas intactas antes de análisis de electrospray spectrometry total en tándem de ionización (ESI-MS/MS) debido a la alta complejidad y un rango dinámico de gran concentración del proteoma^{1,2 ,3,4,5}. Electroforesis capilar de zona (CZE) es una técnica poderosa para la separación de biomoléculas basados en sus relaciones de tamaño de la carga⁶. CZE es relativamente simple, requiriendo sólo un abierto tubular fundido silicona capilar, un electrolito de fondo (BGE) y una fuente de alimentación. Una muestra de proteínas intactas se puede cargar en el capilar mediante presión o tensión, y separación se inicia sumergiendo ambos extremos del tubo capilar en el BGE y aplicando un alto voltaje. CZE puede acercarse a ultra alta eficacia de separación (> 1 millón de platos teóricos) para la separación de biomoléculas⁷. CZE-MS tiene una sensibilidad considerablemente mayor que la cromatografía líquida de fase inversa utilizada (RPLC)-MS para el análisis de proteínas intactas⁸. Aunque CZE-MS tiene un gran potencial para gran escala proteómica de arriba hacia abajo, su amplia aplicación en la proteómica ha sido impedido por varios asuntos, incluyendo una baja capacidad de carga de muestra y separación estrecha ventana. La muestra típica carga de volumen en CZE es alrededor del 1% del total del volumen capilar, que corresponde generalmente a menos de 100 nL^9,10,11. La ventana de separación de CZE es generalmente menos de 30 minutos debido a la fuerte electroosmotic flujo (EF)^9,10. Estos problemas limitan el CZE-MS/MS para la identificación de un gran número de proteoforms y bajo proteoforms abundante de un proteoma complejo.

Se ha realizado mucho esfuerzo para mejorar la muestra de carga volumen de CZE via online muestra concentración métodos (e.g., microextracción en fase sólida [SPME]^12,13, muestra mayor campo apilando [tarifas]^{9 , 11 , 14}y pH dinámico salida^15,16,17,18). FESS y cruce de pH dinámicos son más simples que la SPME, requiriendo sólo una diferencia significativa entre el tampón y el BGE en conductividad y pH. FESS emplea un tampón con mucho menor conductividad que el BGE, llevando a un apilamiento de analitos en el límite entre la zona de muestra y la zona BGE en el capilar. Cruce de pH dinámica utiliza un enchufe básico muestra (p. ej., bicarbonato de amonio 50 mM, pH 8) y un ácido BGE (p. ej., ácido acético al 5% [v/v], pH 2.4) a ambos lados de la toma de muestra. Aplicación de un alto voltaje positivo al final de la inyección del tubo capilar, valoración de la toma de la muestra básica ocurre, concentrando los analitos en un tapón apretado antes de someterse a una separación de CZE. Recientemente, el grupo sol sistemáticamente en comparación con FESS y cruce de pH dinámico para el apilamiento en línea de proteínas intactas, demostrar ese cruce de pH dinámica podría producir mucho mejor rendimiento que las tarifas para la línea concentración de proteínas intactas cuando el volumen de inyección de muestra fue de 25% del volumen capilar total¹⁹.

Separación neutral revestido capilares (p. ej., poliacrilamida lineal [LPA]) han sido empleados para reducir la EF en los capilares, ralentizando la separación CZE y ampliar la ventana de separación^20,21. Recientemente, el grupo de primaria desarrollado un procedimiento simple para la preparación de la capa estable de LPA en la pared interior de los capilares, utilizando persulfato de amonio (APS) como el iniciador y la temperatura (50 ° C) para la producción de radicales libres y polimerización²² . Muy recientemente, el grupo sol emplea la separación recubierto de LPA capilar y el método de cruce de pH dinámico para la separación de CZE de proteínas intactas, llegando a una muestra de microlitro escala carga de volumen y una separación de 90 min ventana¹⁹. Este sistema CZE abre la puerta al uso de CZE-MS/MS para proteómica a gran escala de arriba hacia abajo.

CZE-MS requiere una interfaz altamente robusta y sensible a pareja CZE a MS. Tres interfaces de CE-MS han sido bien desarrollados y comercializados en la historia de la EM de la CE, y son la vaina co-axial-flow interfaz²³, la interfaz de sheathless usando una punta porosa como el ESI emisor²⁴y el electro-cinéticamente bombeado de la envoltura de flujo interfaz^25,26. El electro-cinéticamente bombeada vaina-flujo-basada en interfaz CZE-MS/MS ha alcanzado una baja zeptomoles péptido detección límite⁹, más 10.000 identificaciones del péptido (IDs) de la HeLa proteoma en un solo funcionamiento¹⁴, una caracterización rápida de la célula de proteínas intactas¹¹y muy estables y reproducibles de análisis de biomoléculas²⁶. Recientemente, el capilar de separación LPA-revestido, el método de cruce de pH dinámico y la interfaz de flujo de bombeo electro-cinéticamente vaina fueron destinados a gran escala proteómica de arriba hacia abajo de un proteoma de Escherichia coli (e. coli)^{19 ,27}. La plataforma de CZE-MS/MS acercaron más de 500 proteoform IDs en un solo funcionamiento¹⁹ y casi 6.000 proteoform IDs mediante acoplamiento con Cromatografía por exclusión de tamaño (SEC)-TAGATOSA fraccionamiento²⁷. Los resultados demuestran claramente la capacidad de CZE-MS/MS para proteómica a gran escala de arriba hacia abajo.

En este documento, se describe un procedimiento detallado de usar CZE-MS/MS para proteómica a gran escala de arriba hacia abajo. El CZE-MS/MS sistema emplea el tubo capilar recubierto de LPA para reducir la EF en el capilar, el método de cruce de pH dinámico para determinar la concentración de proteínas, la interfaz de flujo de electro-cinéticamente bombeado vaina para acoplamiento CZE a MS, un orbitrap en línea masa Espectrómetro para la colección de espectros MS y MS/MS de las proteínas y un software de TopPIC (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform identificación y caracterización) para proteoform ID vía búsqueda base de datos.

1. preparación de la capa de LPA en la pared interior del tubo capilar de separación

1. Tratamiento previo del tubo capilar
   1. Ras un capilar de sílice fundida (120 cm de longitud, 50 μm en diámetro interno [identificación], 360 μm en diámetro exterior [verde oliva]) con 500 μl de hidróxido de sodio de 1 M, agua desionizada, 1 M de ácido clorhídrico, agua desionizada y LC-MS metanol de grado usando una bomba de jeringa.
   2. Secar el capilar con el gas del nitrógeno (10 psi, ≥ 12 h) y llenar el capilar con 50% (v/v) 3-(trimetoxisilil) metacrilato de propilo en metanol con una bomba de jeringa. Selle ambos extremos del tubo capilar con caucho de silicona e incubar a temperatura ambiente durante al menos 24 h.
      Nota: Durante este paso, la pared interna del tubo capilar es funcionalizada con C = C. ya resultados de incubación en la capa capilar mejor debido a una reacción más completa.
   3. Corte una porción pequeña (~ 5 mm) del tubo capilar de ambos extremos con una piedra Hendedoras. Enjuague capilar con metanol (500 μl) con una bomba de jeringa para limpiar los reactivos sin reaccionar. Seque el capilar con el gas del nitrógeno (10 psi, ≥12 h).
2. Preparación de la capa de LPA
   Nota: Este procedimiento se basa en Zhu et al. ²² con modificaciones menores.
   1. Preparar una solución de acrilamida (40 mg de acrilamida en 1 mL de agua) y la solución de persulfato (APS) de amonio (5% [p/v] de agua).
   2. Añadir 2-3 μl de la solución de la APS a 500 μl de la solución de acrilamida, vórtice la mezcla y desgasificar con gas de nitrógeno durante 5 min eliminar el oxígeno en la solución.
   3. Cargar la mezcla en el tubo capilar pretratado con un vacío y selle ambos extremos del tubo capilar con caucho de silicona, incubar en un baño de agua a 50 ° C durante 40 minutos.
   4. Quitar una porción pequeña (~ 5 mm) del tubo capilar de ambos extremos con una piedra Hendedoras. Empuje la solución fuera del tubo capilar con agua (200 μL), utilizando la bomba de jeringa.
      Nota: Asegúrese de que el polímero en el capilar es una consistencia de gel de agarosa. Un paso de incubación más largo (hasta ~ 45-50 min) puede resultar en una mejor capa capilar. Con largos periodos de reacción, puede obstruir el tubo capilar y alta presión es necesaria para empujar el polímero con agua. Una bomba HPLC puede usarse para este propósito.

2. grabado del tubo capilar con ácido fluorhídrico

PRECAUCIÓN: Use los procedimientos de seguridad adecuados durante la manipulación de soluciones de ácido fluorhídrico (HF). Todas las operaciones relacionadas con HF que deba realizarse en una campana química. Antes de cualquier operación relacionada con HF, asegúrese de que el gel de gluconato de calcio 2.5% es disponible para su uso en caso de exposición. Guantes doble se requiere, un guante de nitrilo típico dentro y un neopreno pesado guante fuera. Use una bata y gafas de seguridad química. Después de las operaciones de HF, separar residuos peligrosos líquidos y sólidos. Los residuos líquidos de la HF deben ser neutralizado de inmediato con una solución de hidróxido de sodio de alta concentración para almacenamiento temporal antes de la recogida de residuos. Los residuos sólidos de la HF deben almacenarse temporalmente en un recipiente de plástico que es alineado con dos gruesos un galón Ziploc bolsas de plástico y una tapa. Tanto los residuos sólidos y líquidos deben etiquetarse correctamente.

1. Quemar una parte del tubo capilar con una llama suave (p. ej., bolsillo) para quitar el polyimide-revestimiento exterior (1 cm de longitud) alrededor de 4 cm de un extremo del tubo capilar. Limpie suavemente la parte quemada del tubo capilar limpiando para quitar el polyimide capa totalmente.
   Nota: Proceda con la precaución, la porción del tubo capilar sin la capa de poliimida será un poco frágil.
2. Perfore un pequeño agujero en el extremo de un tubo de 200 μL alrededor del mismo tamaño que el diámetro externo capilar para mantener suficientemente el capilar en posición una vez que se rosca a través de este agujero. Enrosque el extremo del tubo capilar que está cerca de la porción quemada a través del orificio hasta la parte quemada en el tubo.
   Nota: Se recomienda para comprobar el tamaño del agujero con el extremo del tubo capilar de la porción quemada para el tamaño correcto, ya que la parte quemada del tubo capilar es frágil.
3. Añadir ~ 150 μL de HF (48% - 51% solución en agua) al tubo de 200 μL para que la solución de HF es sobre mitad la parte quemada en el capilar. Incubar el tubo capilar en la solución de HF a temperatura de 90-100 min.
   Nota: Se recomienda que se crea otro agujero en la tapa del tubo y algún objeto pequeño (por ejemplo, una punta de pipeta pequeña) se utiliza para sostener el tubo mientras que la incubación lleva a cabo. Punta de la pipeta puede utilizarse para perforar la espuma o algunos otros sólida plataforma desde la que puede colgar la cámara de reacción, creando un ambiente seguro. Coloque toallas de papel debajo del tubo que contiene HF y seguir los procedimientos adecuados en caso de un derrame.
4. Retire el capilar del tubo y lave el exterior con agua desionizada para eliminar cualquier HF residual.
   Nota: Asegúrese de que el diámetro externo del tubo capilar en la porción más estrecha de la parte quemada es ahora menor de 100 μm, como debe ser.
5. Corte la parte grabada del tubo capilar en el centro de la porción más estrecha utilizando una piedra Hendedoras para producir un tubo capilar de separación con menos de 100 μm de diámetro exterior en un extremo. Corte el extremo no-grabado al agua fuerte del tubo capilar para obtener una separación de 1 m capilar.
   Nota: Deseche residuos HF según el protocolo institucional establecido.

3. preparación de las muestras

1. Preparación de una mezcla de proteína estándar
   1. Preparar una mezcla de proteína estándar que contiene citocromo c (Cyto.c, 12 kDa, 0,1 mg/mL), lisozima (14,3 KD, 0,1 mg/mL), β-caseína (24 kDa, 0.4 mg/mL), mioglobina (16,9 kDa, 0,1 mg/mL), anhidrasa carbónica (CA, 29 kDa, 0,5 mg/mL) y albúmina de suero bovino (BSA, kDa 66,5 1.0 mg/mL) en LC-MS grado agua como una solución de reserva.
      Nota: La solución puede ser alícuotas y almacenados a-80 ° C para su uso.
   2. Diluir la solución por un factor de 10 con una solución de bicarbonato de amonio 50 mM (pH 8.0) en agua de calidad LC-MS para análisis de MS CZE.
      Nota: Filtro de la solución de bicarbonato de amonio antes de su uso con un filtro de membrana (p. ej., 0.2 μm de membrana de nitrato de celulosa y 50 mm de diámetro).
2. Preparación de una muestra de e. coli
   1. Células de e. coli (K-12 MG1655) cultivos en medio LB a 37 º C agitando a 225 rpm hasta que acerque el valor OD600 0,7. Recoger e. coli las células mediantecentrifugación (3.283 x g, 10 minutos) y lavar varias veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para quitarlo del medio.
   2. Suspender las células de e. coli en el tampón de lisis que contienen urea 8 M, inhibidores de la proteasa y bicarbonato de amonio 100 mM (pH 8.0) y ultrasonicate en el hielo durante 15 min con un disruptor celular ultrasónico un cuerno de taza para lisis celular completa.
      1. Defina el Ciclo de trabajo (%) a 50 y el Control de la salida a 7 el disruptor ultrasónico de la célula.
   3. Centrifugue el lisado a 18.000 x g durante 10 minutos recoge el sobrenadante y desechar el precipitado. Utilice una pequeña alícuota del sobrenadante para la medición de la concentración de proteína con el ensayo de bicinchoninic ácido (BCA).
      Nota: El lisado necesita ser diluido por lo menos por un factor de tres para reducir la concentración de urea inferior a 3 M para ser compatible con el ensayo BCA. El ensayo BCA se realiza según procedimiento del fabricante.
   4. Mezclar 1 mg de proteínas de e. coli con acetona fría con una relación de volumen de 1:4 y mantener la mezcla a-20 ° C durante la noche para precipitar las proteínas.
      Nota: Realizar todos los experimentos utilizando acetona en una campana química.
   5. Desactivación de proteínas precipitadas (12.000 x g, 5 min) y eliminar el sobrenadante. Lavar el sedimento con acetona fría otra vez (mismo volumen que antes) y girar hacia abajo otra vez.
   6. Saque el sobrenadante y el pellet secar en la campana química para un par de minutos.
      Nota: No seque en exceso el precipitado de proteína.
   7. Disolver el precipitado proteínas de e. coli (1 mg) en 200 μL de 8 M de urea en 100 mM amonio bicarbonato (pH 8.0).
   8. Desnaturalizar, reducir y alkylate la muestra.
      1. Incubar la muestra a 37 ° C por 30 min desnaturalizar las proteínas.
      2. Reducir con Ditiotreitol (DTT) Añadir 2 μl de solución DTT de 1 M (en 100 mM de bicarbonato de amonio) en la muestra y la muestra a 37 ° C por 30 min de incubación.
      3. Alkylate las proteínas con Yodoacetamida (IAA) mediante la adición de 6 μl de solución de IAA de 1 M (en 100 mM de bicarbonato de amonio) a la muestra e incubar la muestra durante 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
      4. Calmar el exceso IAA con TDT por añadir 2 μl de solución de 1 M de la TDT e incubar 5 min a temperatura ambiente. Acidificar la muestra con ácido fórmico (FA) para obtener una concentración final de la FA de 1% (v/v).
         Nota: Reducción y alquilación se realizan para facilitar el desarrollo de proteínas de fragmentación aguas abajo. Esos pasos, perderá la información de enlaces disulfuro. Si el objetivo es estudiar los enlaces de disulfuro en las proteínas, evitar esos pasos. Recuerde que debe manejar todas las soluciones de ácido concentradas en una campana química.
   9. Desalar la muestra usando una columna de la trampa de la C4 (por ejemplo, 4 mm de diámetro interno, 10 mm de longitud, lleno con partículas de 3 μm de tener 300 Å poros) con un sistema HPLC. Use un detector de UV a una longitud de onda de 254 nm para la detección.
      1. Fijar el caudal de fase móvil a 1 mL/min activar la columna enjuagándolo con 80% (v/v) de acetonitrilo (ACN), 0.1% FA en agua durante 10 min y equilibre enjuagándolo con 2% (v/v) ACN, 0.1% FA en agua durante 10 minutos.
      2. Carga de 500 μg proteínas en la columna y la desalinización mediante lavado con 2% (v/v) ACN, 0.1% FA en agua por 10 min a un flujo de 1 mL/min.
      3. Eluir las proteínas con el 80% (v/v) ACN, 0.1% FA en agua durante 3 minutos a una velocidad de flujo de 1 mL/min. Recoger el eluido y liofilizar con un concentrador de vacío.
         Nota: La columna de la trampa de C4 se puede utilizar para desalar grandes cantidades de proteínas pero no baja microgramos de proteínas debido a la pérdida de muestra posible. Para materiales de la proteína limitada, considere el uso de puntas de pipeta con C4 medios de proteína de la desalación. Tenga cuidado de no seque en exceso las proteínas cuando se lyophilizing la muestra.
   10. 500 μg de proteínas (suponiendo que no hay pérdida de muestra durante la preparación de la muestra) se disuelven en 250 μl 50 mM de bicarbonato de amonio (pH 8.0) CZE-MS experimentos.

4. instalación del sistema de CZE-MS/MS y análisis de las muestras

1. Configuración del sistema TCH
   1. Preparar un BGE que contengan 5% o 10% (v/v) de ácido acético (pH ~2.4 o ~ 2.2) en LC-MS grado agua. Poner ~1.5 mL del BGE en un frasco BGE que coincide con la bandeja del almacenador intermediario de los muestreadores CZE.
      Nota: Asegúrese de BGE fresca cada semana y el cambio la solución BGE en el frasco cada día para evitar cualquier contaminación.
   2. Añadir una solución de la muestra (5-200 μL) a un tubo de inserción y el tubo de inserción en una thatmatches vial de muestra con la bandeja de la muestra de los muestreadores CZE.
   3. Carga la muestra, el BGE y la separación capilar en el CZE inyector automático.
      Nota: El lenguaje utilizado en este protocolo con más precisión refleja el uso de un muestreador especial (véase Tabla de materiales), pero los principios pueden aplicarse a otros muestreadores automáticos.
      1. Seleccionar muestra la carga en la página de manual de control de los muestreadores CZE. Cargar el frasco BGE en la bandeja de búfer de los muestreadores, señalando su posición en la bandeja del almacenador intermediario. Coloque el frasco de la muestra en la bandeja de la muestra de los muestreadores, señalando su posición en la bandeja de la muestra.
         Nota: El instrumento puede ser operado en control manual haciendo clic en la imagen del instrumento para el Dispositivo de Monitor en la Página principal instrumento y seleccionando Manual bajo Control directo.
      2. Cargar el capilar de separación en el CZE inyector automático, utilizando el extremo no-grabado al agua fuerte del tubo capilar. Ponga el inyector automático a la posición de alineación usando control manual. Enrosque el extremo no-grabado al agua fuerte del tubo capilar en un agujero que se usa para mantener la separación capilar hasta que no puede ser físicamente roscado más.
         Nota: en este caso, el extremo del tubo capilar es casi a la misma altura que el extremo del electrodo, y por lo menos 50 μl de la muestra es necesaria en el frasco de la muestra para asegurarse de que el extremo del tubo capilar se sumerge en la muestra durante la inyección. Si el volumen de la muestra es baja (es decir, 5 μl), la altura del final de la inyección de la capilar tiene que ajustarse como se describe en el paso 4.1.3.2.1.
         1. Ajuste la altura de la final de la inyección del tubo capilar si el volumen de la muestra es inferior a 50 μl (es decir, 5 μl). Cambie el inyector automático a espera con control manual. Escribe la posición de la muestra en el sistema y hacia el capilar de la muestra. Empuje el extremo de la inyección del tubo capilar más hasta alcanzar la parte inferior de la cubeta de muestra.
            Nota: en este caso, la inyección de la muestra puede realizarse con una muestra de sólo 5 μL en el frasco.
      3. Seguir utilizar el control manual, al ras del tubo capilar con el BGE por 20 min, utilizando una presión de 20 psi.
2. Configuración de la interfaz de CZE-MS
   1. Tirar un vidrio de borosilicate capilar (1 mm de diámetro externo, 0,75 mm de diámetro interno 10 cm de largo) en dos emisores de electrospray con un orificio de 20-40 μm en diámetro exterior
      Nota: Mantenga la longitud del emisor electrospray como 4-5 cm y corta con una piedra Hendedoras si es necesario. Disponer de todo el vidrio residuos en un contenedor de objetos punzantes. Con los siguientes parámetros para obtener consejos de 20 - 40 μm. Establezca el calor 498, el tirón a 5, la velocidad a 10, el retraso en 150 y la presión a 200. Compruebe el tamaño de los emisores con un microscopio antes de su uso. Ajustar los parámetros ligeramente si es necesario.
   2. Montaje de un flujo comercial vaina electro-cinéticamente bombeado de interfaz (véase Tabla de materiales) al frente del espectrómetro de masas. Llene el depósito de búfer de vaina con un búfer que contiene 10% (v/v) de metanol y 0.2% (v/v) FA en LC-MS agua de calidad.
   3. Enjuague la T en la interfaz con la envoltura tampón vía presión manualmente con una jeringa. Enrosque el extremo 1-mm-diámetro exterior de un emisor a través de una tubería de manga de electrospray y conectar el emisor con un puerto de la Ta través de una conexión. Simplemente descarga el T manualmente otra vez con una jeringa para llenar el radiador con el tampón de la vaina.
   4. Ajustar la distancia entre el orificio del emisor y la entrada del espectrómetro de masa a 2 mm con la ayuda de la cámara que viene con la interfaz. Aplique un voltaje de 2 - 2.2 kV en el frasco de buffer de vaina por electrospray. Ajustar la tensión de rociado para alcanzar una estable electrospray.
      Nota: Si se observa no electrospray o un electrospray inestable, Compruebe la interfaz para asegurarse que no hay grandes burbujas en el emisor, en Ty en la tubería que se utiliza para conectar el frasco de buffer de la vaina y la T. Puede estimarse aproximadamente la distancia entre el orificio del emisor y la entrada del espectrómetro de masas por comparación con el 1-m m o.d. del emisor. El voltaje en aerosol depende del tamaño del emisor. Para emisores de 20 a 40 μm, 2-2.2 kV es suficientemente bueno. Recuerda siempre tener cuidado al usar voltajes altos.
   5. Apague el voltaje de aerosol y suavemente del hilo de rosca final grabado al agua fuerte de la separación capilar a través de la T en el emisor hasta que no puede ser empujado más lejos. Aplicar una presión baja (es decir, 5 psi) al final de la inyección del tubo capilar durante este proceso para asegurarse de que hay no hay burbujas en el tubo capilar.
      Nota: El tubo capilar se conecta a la T , a través de un tubo de manga y un accesorio. Ajustar la posición del grabado final del tubo capilar en el emisor con la ayuda de la cámara a 500 μm. La distancia puede estimarse aproximadamente por comparación con el 1-m m o.d. del emisor.
   6. Detener la presión baja al final de la inyección del tubo capilar. Lavar un poco el emisor con el tampón de la vaina. Una vez más, se aplican 2-2.2 kV de tensión de aerosol para el aerosol de prueba.
3. Configuración de un método de TCH para la inyección de muestra, separación, lavado capilar y activación del espectrómetro de masas para adquisición de datos
   1. Seleccione nuevo método en el menú desplegable de archivo en la pantalla principal instrumento para iniciar un nuevo método.
   2. Seleccione entrada como SV/EV, bandeja como muestra, presión 5 psi, KV como 0 y duración 95 s para una inyección de la muestra.
      Nota: La muestra se inyecta en el capilar mediante presión. El volumen de inyección de la muestra puede calcularse basándose en el tiempo de inyección y presión usando la ley de Poiseuille. Por ejemplo, 5 psi para una inyección 95-s muestra corresponde a cerca de 500 nL de volumen de carga de muestra para una separación de 1 m de longitud capilar (diámetro interior de 50 μm).
   3. Seleccione los parámetros para la separación de CZE y configurar los parámetros para la activación de la adquisición de datos.
      1. Configurar la entrada como InV, bandeja como almacenador intermediario, presión 0 psi, KV como 30 y la duración como 4.200 s para la separación de la muestra de la mezcla de proteína estándar. Configurar la entrada como InV, bandeja como almacenador intermediario, presión 0 psi, KV como 20 y la duración como 6.600 s para la separación de la muestra de proteoma de e. coli .
         Nota: El voltaje aplicado para la separación puede ajustarse en base a la complejidad de la muestra. Para muestras de proteína simple, 30 kV puede aplicarse para acelerar el análisis. Para muestras complejas, 20 kV se aplica para reducir la separación y adquirir más espectros MS/MS para proteoform IDs.
      2. Establecer los parámetros para la activación de la adquisición de datos en Eventos programados. Fijar tiempo (s) 0,0 como tipo 1 relé para Activar en el paso 1; Programar el tiempo (s) 1.0 y tipo como relé 1 desactivar en el paso 2.
   4. Seleccione entrada InV, bandeja como almacenador intermediario, presión 10 psi, KV como 30 y la duración como 600 s para lavado capilar.
   5. Guarde los archivos de método para la CZE-MS y MS/MS experimentos.
4. Configuración de MS y MS/MS
   1. Configurar los parámetros de MS y MS/MS para el análisis de la proteína intacta con un espectrómetro de masas de trampa de iones cuadrupolo (véase Tabla de materiales).
      Nota: El modo de iones positivos y mayor energía inicar la disociación (HCD) de fragmentación son empleados.
      1. Ajustar la configuración de archivo de tune: activar modo de proteína intacta y una presión de captura de 0.2. Establecer a la transferencia de iones temperatura capilar a 320 ° C y el nivel de RF s-lente a 55.
      2. Construir el fichero MS y MS/MS.
         1. Para la MS completa, establecer el número de microscans a 3, la resolución de 240.000 (en m/z 200), el valor automatic gain control (AGC) objetivo a 1E6, el tiempo de inyección máxima de 50 ms y la gama de escaneo a 600-2000 m/z.
      3. Para MS/MS, use adquisición de dependiente de datos (DDA) para los ocho iones más intensos en un amplio espectro de MS. Establece la ventana de aislamiento en 4 m/z y la energía de impacto normalizada (NCE) al 20%. Establecer el número de microscans a 1, la resolución de 120.000 (en m/z 200), el valor objetivo AGC a 1E5 y el tiempo de inyección máxima de 200 ms.
      4. Defina el umbral de intensidad para el disparo de fragmentación a 1E5 y los iones con un estado de carga superior 5 a ser aislado por la fragmentación. Encienda el excluir isótopos y establece la exclusión dinámica en 30 s.
         Nota: El número de microscans para MS/MS puede incrementarse a 3. En este caso, un método de Top3 PDD puede utilizarse para reducir el tiempo de ciclo.
   2. Configurar una conexión por cable entre el CE inyector automático y el espectrómetro de masas para la activación automática de la adquisición de datos. Conecte un extremo de un cable a los contactos de relé 1 y relé 1 contacto B en la parte posterior de los muestreadores de CE. Conecte el otro extremo del cable En - y en + en el espectrómetro de masas.
5. Experimento de CZE-MS/MS y análisis de las muestras
   1. Aplicar 30 kV utilizando el control manual de la CE en el extremo de inyección de muestra y 2-2.2 kV en el frasco de buffer de vaina utilizando la fuente de alimentación externa para probar la separación capilar y electrospray.
      Nota: La separación actual, en este caso, es alrededor de 8-9 ma si se utiliza ácido acético al 5% (v/v) como el BGE.
   2. Configurar una secuencia de adquisición de datos en el equipo del espectrómetro de masas mediante la selección de una nueva secuencia.
      1. Seleccione desconocidos como el tipo de muestra y especificar un nombre de archivo y ruta de acceso. Indicar el método de MS para cada muestra, bajo Instrumento método.
         Nota: Ya hay un equipo separado para el control de los muestreadores de la CE, la posición de la muestra no necesita ser especificado.
   3. Establece una secuencia de separación de la TCH en el computador para indicar la posición del búfer, posición de la muestra y el método CZE. Para iniciar una nueva secuencia, seleccione secuencia en el menú desplegable de análisis de la Página principal instrumento.
   4. Iniciar el método de adquisición de datos en el equipo del espectrómetro de masas primero seleccionando Ejecutar secuencia (o Ejecutar ejemplo para solos funcionamientos). Luego, comenzar la secuencia del CE en el equipo de muestreadores de CE.
      Nota: Cuando la tensión de separación está encendido después de la inyección de la muestra, una señal es enviada de los muestreadores de CE al espectrómetro de masas para la activación de la adquisición de datos. La separación actual disminuirá al principio durante la separación por el apilamiento de muestra pH dinámico cruce. Entonces, la corriente se recupera poco a poco.

5. base de datos búsqueda de los archivos crudos recogidos con el Software de TopPIC

1. Transferir los archivos RAW, incluyendo los datos MS y MS/MS, del equipo espectrómetro de masas para un ordenador dedicado a la búsqueda de la base de datos.
   Nota: Estos archivos RAW pueden ser grande y requiere un ordenador potente para lograr una búsqueda rápida de la base de datos.
2. Descargar suite ProteoWizard y TopPIC en el equipo dedicado a la búsqueda de la base de datos.
   Nota: ProteoWizard y TopPIC suite son software de código abierto y puede ser encontrada en línea (ProteoWizard: http://proteowizard.sourceforge.net; Suite de TopPIC: http://proteomics.informatics.iupui.e.,u/software/toppic/). Bases de datos de UniProt se utilizan para las búsquedas de base de datos y pueden encontrarse en la Página Web de UniProt.
3. Convertir los archivos RAW a .mzML archivos con msconvert, una herramienta de conversión de formato de MS archivo de ProteoWizard²⁸. En el GUI de msconvert (MSConvertGUI.exe), haga clic en el botón examinar y seleccione el archivo .raw a convertir. Seleccione mzML como formato de salida y mantener todas las opciones a sus valores predeterminados. Haga clic en el botón iniciar en la parte inferior derecha de la interfaz gráfica.
4. Convertir los archivos de .mzML archivos de .msalign con la herramienta TopFD en el TopPIC suite²⁹.
   1. En la interfaz gráfica de usuario de TopFD (topfd_gui.exe), haga clic en el botón archivo y seleccione el archivo .mzML creado en el paso anterior. Mantenga los valores predeterminados de los parámetros y, después, haga clic en el botón iniciar en la parte inferior derecha de la interfaz gráfica.
      Nota: TopFD convierte el precursor y fragmento clústeres isotópicos en masas monoisotopic e identifica características de posibles proteoform en MS1 datos mediante la combinación de clústeres isotópicos precursor con masas similares de monoisotopic y tiempos de migración cercana. Se genera tres archivos de TopFD, incluyendo un archivo ms1.msalign un archivo ms2.msalign y un archivo .feature. Los archivos ms1.msalign y ms2.msalign contienen monoisotopic deconvoluted masas de espectro MS1 y MS/MS, respectivamente. El archivo .feature contiene características de posible proteoform.
5. Realizar una búsqueda de base de datos con TopPIC (versión 1.1.3) en TopPIC suite³⁰.
   1. En el GUI de TopPIC (toppic_gui.exe), haga clic en archivo de base de datos y seleccione una base de datos adecuado para la búsqueda.
   2. Haga clic en archivo de espectro y seleccione el archivo ms2.msalign generado en el paso 5.4.1 como entrada. Seleccione el archivo de función de MS1 y elegir el archivo .feature generado en el paso 5.4.1.
   3. Establecer carbamidomethylation de cisteína (C57) como una modificación fija debido al tratamiento de IAA.
      Nota: Un archivo de texto también puede ser creado con varias modificaciones fijadas por un editor de texto. Entonces, el archivo de texto se puede seleccionar mediante el botón de archivo junto a modificaciones fijadas en el GUI de TopPIC.
   4. Seleccione la función de base de datos de señuelo y corte en configuración, seleccione FDR (tarifa falsa del descubrimiento) en el menú desplegable al lado de nivel de espectro. Establecer el FDR a 0,01 en el espectro y 0.05 en el nivel de proteoform.
      Nota: TopPIC ofrece múltiples opciones para filtrar los resultados: espectro nivel FDR, FDR proteoform nivel o ambos. El FDR se evalúa basado en el enfoque de señuelo blanco³¹.
   5. Deje la función de generación sin seleccionar y configurar la tolerancia a errores (ppm) a 15.
   6. En Parámetros avanzados, seleccione 2 para el número máximo de cambios masivos en el menú desplegable. Establecer la masa de máximo desplazamiento (Da) de modificaciones desconocidas a 500 Da. dejar todos los demás parámetros en sus valores predeterminados y haga clic en el botón iniciar en la parte inferior derecha de la interfaz gráfica.
      Nota: El software de TopPIC genera dos archivos de texto resultantes. El archivo con el sufijo. OUTPUT_TABLE contiene la lista de los partidos identificados proteoform-espectro (PrSMs) y con un sufijo. FORM_OUTPUT_TABLE contiene la lista de proteoforms identificado. Para cada PrSM, el software brinda información general sobre el partido, el patrón de fragmentación observada, los iones fragmento combinado, y masa detectado cambios.

La figura 1 muestra un diagrama del sistema dinámico de basado en el cruce de pH CZE-ESI-MS utilizado en el experimento. Una toma larga de la muestra en un buffer básico se inyecta en una revestido de LPA separación capilar llenada de un ácido BGE. Después de aplicar altos voltajes I y II, los analitos en la zona de la muestra será concentrada por el método de cruce de pH dinámico. Para evaluar el funcionamiento del sistema CZE-MS, por lo general se analiza una mezcla estándar de proteína (citocromo c, lisozima, β-caseína, mioglobina, CA y BSA). El electroferograma representativa para la mezcla de proteína estándar se muestra en la figura 2A. La mezcla de proteína estándar normalmente corre por lo menos en duplicado para evaluar la eficacia de separación y la reproducibilidad del sistema. La eficiencia de separación puede evaluarse con el número de platos teóricos de algunas proteínas, como se muestra en la figura 2B. La reproducibilidad puede ser evaluada por las desviaciones estándar relativas del tiempo de intensidad y la migración de proteínas. Figura 3 A muestra una vista ampliada de un electroferograma de la e. coli proteína muestra analizada por el dinámica basado en el cruce de pH CZE-MS/MS. La intensidad de nivel normalizada (NL) la proteína debe estar en la escala de 10⁸ si 1 μg de proteínas de e. coli se cargan para el análisis con un espectrómetro de masas cuadrupolo ion trap. Una vista ampliada en el electroferograma puede utilizarse para evaluar la ventana de separación del sistema. En este caso, la ventana de separación es 80-90 minB figura 3muestra un ejemplo PrSM, incluyendo la correspondiente proteoform información general, secuencia de la proteína, patrón de fragmentación observada y modificaciones. El E-valor muy bajo (2.11E-48) y FDR espectral (0) indican la alta confianza de la identificación de proteoform. El elevado número de iones fragmento emparejado (60) además indica que la alta confianza de la identificación. El patrón de fragmentación observada muestra que la fragmentación de la proteoform es muy eficiente que cubre el termini y parte media de la proteoform. La hendidura de la N-terminal de tres aminoácidos (MTM) se determina a través de la búsqueda de la base de datos.

Figura 1 : Diagrama de del dinámica pH cruce-CZE-ESI-MS sistema de. La muestra se disuelve en bicarbonato de amonio 50 mM, pH 8. El BGE es 5% o 10% (v/v) de ácido acético, pH ~2.4 o ~ 2.2. Un tubo capilar recubierto de LPA de 1 m se utiliza para la separación. Una interfaz de flujo de bombeo electro-cinéticamente vaina se utiliza para acoplar CZE a MS. Se utiliza un espectrómetro de masas cuadrupolo ion trap. El alto voltaje I (HV I) es proporcionado por la fuente de alimentación integrada en el CE muestreadores para la separación. Alta tensión II (at II) es proporcionado por una fuente de alimentación separada de electrospray. El espectrómetro de masas está conectado a tierra. La distancia entre el orificio del emisor y la entrada del espectrómetro de masas es de ~ 2 mm. La distancia entre el extremo del tubo capilar grabado al agua fuerte en el emisor y el orificio del emisor es inferior a 500 μm. El tamaño del orificio del emisor electrospray es 20-40 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Datos de una mezcla de proteína estándar analizado por la dinámica de basado en el cruce de pH CZE-Sra. (A) este panel muestra un electroferograma pico base. (B) este panel muestra el número de platos teóricos (N) de tres proteínas. El volumen de inyección de muestra fue de 500 nL. HV era 30 kV para la separación y II HV fueron de 2,2 kV por electrospray. El BGE fue ácido acético al 5% (v/v), pH 2.4. La muestra fue de bicarbonato de amonio 50 mM (pH 8) y contiene citocromo c (0,01 mg/mL), lisozima (0,01 mg/mL), β-caseína (0.04 mg/mL), mioglobina (0,01 mg/mL), anhidrasa carbónica (CA, 0.05 mg/mL) y albúmina de suero bovino (BSA, 0,1 mg/mL). No hay espectros MS/MS fueron adquiridos para la muestra de la mezcla de proteína estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Datos de la proteomeanalyzed de e. coli por el dinámico basado en el cruce de pH CZE-MS/MS. Muestra de proteína (A) este panel muestra un zoom en vista del electroferograma pico basado de la e. coli . (B) este panel muestra un ejemplo que prsm identificado mediante la búsqueda de la base de datos de TopPIC de los espectros MS/MS adquiridas. La información general de proteoform correspondiente, secuencia de la proteína, observa el patrón de fragmentación, y las modificaciones se presentan. Los iones fragmento combinado de PrSM individual también puede verse si es necesario. HV 20 kV para la separación y II HV fueron de 2,2 kV por electrospray. El BGE fue 10% (v/v) ácido acético, pH ~ 2.2. La muestra fue de bicarbonato de amonio 50 mM (pH 8) y la concentración de proteína fue de 2 mg/mL. El volumen de inyección de muestra fue de 500 nL. Se utilizó un método de PDD top8 para adquirir los datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para utilizar CZE-MS/MS para la caracterización de alta resolución de proteoforms en las muestras de proteína simple y para la identificación a gran escala de proteoforms en muestras complejas del proteoma. En la figura 1muestra un diagrama del sistema CZE-ESI-MS/MS. Hay cuatro pasos críticos en el protocolo. En primer lugar, la preparación de recubrimiento de alta calidad LPA en la pared interior de separación capilar es muy importante. Una separación recubierto de LPA capilar puede reducir la EF en el capilar, ampliar la ventana de separación de CZE y reducir la adsorción de proteínas en su pared interna¹⁹. La reacción de polimerización para la fabricación de la capa de la LPA es realizada a través de relleno del tubo capilar con una mezcla de acrilamida (monómero) y persulfato de amonio (iniciador de polimerización), seguido por el tubo capilar en un baño de agua para activar la calefacción al reacción²². El momento en el baño de agua es crítico. Un tiempo de reacción muy corto dará lugar a una reacción incompleta y pobre capa. Suele permitimos la reacción al grupo a 50 minutos, permitiendo que la reacción que continuar por un período más largo para una mejor capa. Con largos periodos de reacción, puede obstruir el tubo capilar y una bomba HPLC que deba utilizarse para empujar el polímero dentro del tubo capilar con agua. Un tubo capilar recubierto de LPA puede utilizarse continuamente durante aproximadamente una semana, basado en los datos de la literatura y nuestra experiencia de²².

El segundo paso crítico es acoplamiento CZE a MS con el flujo de bombeo electro-cinéticamente vaina CE-MS interfaz^25,26. La distancia entre el extremo de la separación capilar en el emisor de la ESI y el orificio del emisor afecta significativamente la sensibilidad de CZE-MS, y una distancia más corta produce una mayor sensibilidad²⁵. Al final de la separación capilar debe ser grabado con HF, para reducir su diámetro externo de 360 μm a menos de 100 μm, lo que permite el extremo del tubo capilar para ser empujado cerca del orificio del emisor. La distancia entre el orificio del emisor y la entrada del espectrómetro de masas se ha optimizado para llegar a la mayor sensibilidad y buena estabilidad²⁶. Por lo general mantenemos la distancia alrededor de 2 mm.

El tercer paso crítico es la CZE-MS y MS/MS de análisis con el apilamiento dinámico basado en el cruce de pH en línea muestra¹⁹. El pH del solución tampón de muestras y el BGE deben ser significativamente diferentes para asegurar la muestra eficiente apilado. La concentración de proteína en la muestra debe ser adecuado. Si la concentración es demasiado alta, las proteínas se pueden precipitar en el tubo capilar durante la muestra de apilamiento. Las concentraciones de proteína de las muestras utilizadas para las figuras 2 y 3 pueden considerarse como ejemplos típicos. El último paso crítico es la búsqueda de la base de datos con TopPIC para proteoform IDs³⁰. Varios pasos son necesarios para las conversiones de archivo antes de que se puede realizar la búsqueda de la base de datos con TopPIC. Un filtro adecuado de FDR es necesario para asegurar la calidad de la proteoforms identificada. Por lo general utilizamos un 1% espectro nivel FDR para filtrar los resultados de la búsqueda de la base de datos. Podemos observar que la iniciativa de Proteómica de arriba hacia abajo es un muy buen recurso para métodos de Proteómica de arriba hacia abajo y análisis de datos software^32,33.

Debemos destacar que algunas partes del protocolo pueden necesitar ser modificado ligeramente y algunos problemas pueden ser necesario. El tiempo de polimerización en el baño de agua para la preparación de la capa de LPA puede variar en diferentes laboratorios. El tiempo para HF grabado de la separación capilar deba modificarse ligeramente debido a una temperatura distinta en diferentes laboratorios. Al configurar la interfaz CE-MS, asegúrese de que el electrospray es estable antes de enhebrar el capilar de separación en el emisor por electrospray. Si se observa no electrospray o un electrospray inestable, Compruebe la interfaz para asegurarse que no hay burbujas grandes en el emisor, en To en la tubería que se utiliza para conectar el frasco de buffer de la vaina y la T. Además, la distancia entre el orificio del emisor y la entrada del espectrómetro de masas puede afectar la estabilidad de electrospray y es generalmente cerca de 2 milímetros. La tensión de electrospray también puede influir en la estabilidad de aerosol. Para los emisores de 20 a 40 μm, 2-2.2 kV es generalmente suficiente. Como se describe en el párrafo anterior, la concentración de proteína en la muestra debe ser adecuado. Si la concentración es demasiado alta, las proteínas se pueden precipitar en el tubo capilar durante la muestra de apilamiento. Prestar atención al perfil actual en el equipo de muestreadores de CE. Si la corriente es cero en el inicio de la carrera CZE, significa que una toma de aire se inyecta en el tubo capilar durante la etapa de inyección de muestra. Asegúrese de que el volumen de la muestra en el frasco es bastante grande. Si la corriente es normal al principio y de repente se convierte en cero durante el funcionamiento, generalmente significa que la concentración de proteína es demasiado alto.

Basado en este protocolo CZE-MS/MS permite la caracterización de alta resolución de las muestras de proteína simple y la proteómica de arriba hacia abajo a gran escala de proteomas complejos. Por ejemplo, el CZE-MS se acercó a la caracterización de alta resolución de una mezcla de proteína estándar que contiene seis proteínas¹⁹. Como se muestra en la figura 2, el CZE-MS claramente separadas las seis proteínas con una alta eficacia de separación, reveló tres formas de β-caseína y detecta muchas impurezas. Como otro ejemplo, solo tiro CZE-MS/MS reproducible rindió identificadores de más de 500 proteoform y 190 proteína IDs desde el proteoma de e. coli , usando sólo 1 μg de proteínas de e. coli con un 1% espectro nivel FDR¹⁹. CZE-MS/MS mejorado el número de ID de un proteoma complejo por al menos tres veces, en comparación con estudios previos de CZE-MS/MS de tiro proteoform. Como se muestra en la figura 3A, CZE-MS/MS simultáneamente alcanzó un volumen de carga de muestra 500-nL y una ventana de separación de 90 min para el análisis de e. coli proteoma¹⁹. El software de TopPIC puede proporcionar información completa acerca de los proteoforms identificados (figura 3B). El sistema de CZE-MS/MS ofrece la comunidad proteómica con una herramienta útil para proteómica de arriba hacia abajo a gran escala y de alta resolución.

CZE-MS/MS todavía tiene algunas limitaciones para proteómica profundo de arriba hacia abajo. Aunque hemos demostrado que la CZE-MS/MS puede alcanzar sobre IDs 500proteoform del proteoma de e. coli en una única prueba, el número de proteoform IDs de solo tiro CZE-MS/MS es sólo aproximadamente 50% de la de estado-de-arte-TAGATOSA-MS/MS^{34, 35}. En el presente Protocolo, sólo HCD se utiliza para fragmentación de la proteína, llevando a coberturas de fragmentación limitada de proteoforms identificados. Varias mejoras se pueden hacer en el protocolo de CZE-MS/MS para mejorar el número y la calidad de la proteoform IDs de solo tiro CZE-MS/MS. En primer lugar, aumentando la longitud de la separación capilar debe proporcionar una ventana de separación más amplia, llevando a más proteoform ID. En segundo lugar, utilizando un espectrómetro de masas con un poder de resolución mucho más alto, más rápido análisis tasa y múltiples métodos de fragmentación (por ejemplo, HCD,³⁶ electrones transferencia disociación [ETD],³⁷ y ULTRAVIOLETA photodissociation [UVPD]³⁸ ) sin duda mejorará el número de proteoform IDs y las coberturas de fragmentación de proteoforms identificado.

Los autores no tienen nada que revelar.

Los autores agradecen a grupo de Heedeok Hong en el Departamento de química, Universidad Estatal de Michigan, por proporcionar amablemente las células de Escherichia coli para los experimentos. Los autores agradecen el apoyo del Instituto Nacional de Ciencias de Medicina General, los institutos nacionales de salud (NIH) a través de Grant R01GM118470 (a X. Liu) y Grant R01GM125991 (a l el sol y X. Liu).