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要約

詳細なプロトコルは、分離、同定、キャピラリー ゾーン電気泳動-エレクトロ スプレー イオン化タンデム質量分析法 (CZE-ESI MS/ミリ秒) を使用して蛋白質のサンプルの proteoforms の特性に記述されています。単純な蛋白質のサンプルの proteoforms の高分解能特性と複雑なプロテオーム サンプルで proteoforms の大規模な同定のプロトコルを使用できます。

要約

キャピラリー ゾーン電気泳動-エレクトロ スプレー イオン化タンデム質量分析法 (CZE-ESI MS/ミリ秒) を特徴付ける複雑なプロテオームの proteoforms を目指して、トップダウン プロテオミクスの便利なツールとして認識されています。しかし、大規模なトップダウン プロテオミクス CZE MS/MS のアプリケーションは低サンプル読み込み容量によって妨害された、CZE の分離ウィンドウを絞り込みます。ここでは、プロトコルは、大規模なトップダウン プロテオミクス 1 マイクロリットル スケール サンプル容積と 90 分分離ウィンドウ CZE MS/MS を使用して説明します。CZE MS/MS プラットフォームは線形ポリアクリルアミド (LPA) に基づいて-コーティング分離非常に低い電気浸透流、スタッキングのタンパク質、高効率でダイナミック オンライン pH ベース接合のサンプル濃縮法と毛細血管を非常に高感度で電気速度論的励起シース フロー-MS インターフェイスの高イオン トラップ質量質量解像度とスキャン速度が。プラットフォームは、単純なそのままな蛋白質のサンプルの高解像度特性との様々 な複雑なプロテオーム proteoforms の大規模解析に使用できます。例として、標準的な蛋白質の混合物の非常に効率的な分離とプラットフォームを使用して多くの不純物の高感度検出が示されています。別の例として、このプラットフォームは以上 500 proteoform を作り出すことができるし、単一 CZE-MS/MS の大腸菌プロテオームから 190 のタンパク質同定を実行します。

概要

トップダウン プロテオミクス (TDP)、プロテオーム内 proteoforms の大規模解析を目指します。TDP が高い複雑さのためのエレクトロ スプレー イオン化タンデム質量分析法 (ESI ・ MS/MS) 解析の前にそのままな蛋白質の効果的な液相分離とプロテオーム1,2 の大規模な濃度のダイナミック レンジに依存しています。 ,3,4,5。キャピラリー ゾーン電気泳動法 (CZE) は、彼らのサイズ-電荷比6に基づく生体分子の分離のための強力な手法です。CZE はのみ、オープン鋼管溶融シリカ毛細管、背景の電解質 (BGE)、および電源ユニットを必要とする比較的簡単です。圧力または電圧、使用して毛細血管にそのままな蛋白質のサンプルを読み込むことができ、BGE で毛細血管の両端を浸漬、高電圧を適用することによって分離を開始しました。CZE 超高分離効率のアプローチすることができます (> 100 万の理論的な版)7生体分子の分離のため。CZE MS が広く使用されている逆相液体クロマトグラフィー (市販清涼飲料水) よりも大幅に高い感度-8そのままな蛋白質の質量分析。CZE MS には、大規模なトップダウン プロテオミクスのための大きな可能性がありますが、プロテオミクスで広い応用は低いサンプル積載と狭い分離ウィンドウを含むいくつかの問題によって妨害されました。CZE でボリュームを読み込む一般的なサンプルは、通常9,nL 未満 10010,11に対応する総細孔容積の約 1% です。CZE の分離ウィンドウは、通常、強力な電気浸透流 (EOF)9,10のため 30 分以内です。これらの問題は、多数の proteoforms と複雑なプロテオームから低の豊富な proteoforms を識別するための CZE MS/MS を制限します。

CZEを介してオンライン サンプル濃度の方法 (例えば固相マイクロ抽出 [SPME]12,13、フィールド拡張サンプル スタッキング [フェス]9のボリュームを読み込むサンプルを改善するために多くの努力をなされています。,11,14、および動的 pH ジャンクション15,16,17,18)。フェスおよび動的 pH ジャンクション SPME、伝導度と pH のサンプル バッファーと、BGE の大きな違いをのみ必要とするよりも簡単です。フェスは、BGE、検体サンプル ゾーンと、キャピラリー中で BGE ゾーン間の境界上のスタッキングにつながるより多くの低い伝導性を持つサンプル バッファーを採用しています。動的 pH ジャンクションは、基本的なサンプル プラグイン (例えば、50 mM 重炭酸アンモニウム、pH 8) およびサンプル プラグの両側に酸性の BGE (例えば5% [v] 酢酸、pH 2.4) を利用します。毛細血管の射出端高正電圧のアプリケーションに基本的なサンプル プラグの滴定が発生するタイトなプラグに CZE 分離を経る前に、検体を中心します。最近、太陽グループ体系的に比較してフェスと動的 pH ジャンクションそのまま蛋白質のオンライン スタッキングのためタンパク質濃度のオンラインのフェスよりもはるかに優れた性能を作り出すことができる、動的な pH の接合部を示すときサンプル注入量総細孔容積19の 25% であった。

中立的コーティング分離毛細血管 (例えば、線形ポリアクリルアミド [LPA]) は、減速 CZE 分離し、分離ウィンドウ20,21を拡大、キャピラリー中で EOF を減らすために採用されています。最近、Dovichi グループ、毛細血管の内壁安定 LPA コーティングの準備のための簡単な手順を利用して開発過硫酸アンモニウム (APS) イニシエーターとフリーラジカル産生と重合22 の温度 (50 ° C).太陽グループは非常に最近では、ボリュームと 90 分分離ウィンドウ19ロード 1 マイクロリットル スケールのサンプルに達するキャピラリー LPA コーティング分離とそのまま蛋白質の CZE 分離の動的 pH 接合法に用いられます。この CZE システムは、大規模なトップダウン プロテオミクス CZE MS/MS を使用してドアを開きます。

CZE MS MS に CZE のカップルに非常に堅牢で敏感なインタ フェースが必要です。3 つの CE MS インターフェイスはよく発達し、CE-MS の歴史の中で実用化されている、コーアクシャル シースフロー インターフェイス23、ESI エミッタ24、多孔性の先端を使用して sheathless のインターフェイスと電気速度論的励起シース フロー インターフェイス25,26です。低 zeptomole ペプチド検出限界9に達している、電気速度論的励起シース フロー インターフェイス ベース CZE MS/MS、以上 10,000 ペプチッド識別 (Id)、hela 細胞から細胞プロテオーム単一の14、高速解析を実行そのままな蛋白質11生体分子26の高い安定性と再現性のある解析。最近、LPA コーティング分離キャピラリ、動的 pH 接合法電気速度論的励起シース フロー インターフェイスを用いてエシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) プロテオーム19 の大規模なトップダウン プロテオミクス ,27。CZE MS/MS プラットフォームに近づいて単一の19とほぼ 6,000 proteoform Idを介してサイズ排除クロマトグラフィー (SEC) で結合を実行以上 500 proteoform Id-市販清涼飲料水分別27。結果は、大規模なトップダウン プロテオミクス CZE MS/MS の能力を明確に示します。

ここで、大規模なトップダウン プロテオミクス CZE MS/MS を使用する詳細な手順を説明します。CZE MS/MS システム採用オンライン濃度タンパク質、MS、orbitrap に CZE を結合の電気速度論的励起シース フロー インターフェイスの動的 pH 接合法、キャピラリー中で EOF を抑える LPA コーティング キャピラリー質量蛋白質および proteoform IDによるデータベース検索のための TopPIC (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform の同定と機能解析) ソフトウェアの MS、MS/MS スペクトルのコレクションの分析計

プロトコル

1. 分離毛細管の内壁に LPA コーティングの準備

  1. 毛細血管の前処理
    1. 500 μ L のシリンジ ポンプを使用して LC MS グレードのメタノール、脱イオン水 1 M 塩酸脱イオン水 1 M 水酸化ナトリウムと連続して石英キャピラリー (内径 [id] [外径] 外径 360 μ m で 50 μ m、長さ 120 cm) をフラッシュします。
    2. 乾燥窒素ガス (10 psi、≥ 12 h) で毛細血管と毛細血管を詰めて 50% (v/v) 3-(構築) プロピル メタクリル酸メタノール シリンジ ポンプを使用しています。シリカ ゴムで毛細血管の両端をシールし、少なくとも 24 時間室温でインキュベートします。
      注: この手順では、毛細血管の内壁は C と機能はより完全な反応によるより良い毛管コーティングで c. 長い培養結果を =。
    3. 割石で両端から毛細血管の (~ 5 mm) の小さな部分をカットします。メタノール (500 μ L) 未反応試薬をクリーンアップするシリンジ ポンプを使用して毛細血管をすすいでください。窒素ガス (10 psi、≥12 h) で毛細血管を乾燥させます。
  2. LPA コーティングの準備
    注: この手順は朱らに基づいてください。22変更を加える。
    1. アクリルアミド ソリューション (水の 1 mL 中のアクリルアミドの 40 mg)、アンモニウムの過硫酸 (APS) 溶液 (水で 5% [w/v]) を準備します。
    2. アクリルアミド溶液、渦混合物の 500 μ L に APS ソリューションの 2-3 μ L を追加し、ソリューション内の酸素の削除に 5 分間、窒素ガスでガス抜き。
    3. シリカ ゴムで毛細血管の両端をシールの真空を使用して前処理の毛細血管に混合物を読み込み、および 40 分 50 ° C の水浴中でインキュベートします。
    4. 割石で、両端から毛細血管のごく一部 (~ 5 mm) を削除します。・ シリンジ ポンプを使用して水 (200 μ L) で毛細血管から未反応のソリューションをプッシュします。
      注: は、毛細血管から押し出されるポリマーは、agarose のゲルのような一貫性を確認します。長い潜伏ステップ (最大 45 〜 50 分) より良い毛管コーティングにつながります。反応期間の長い、毛細血管をブロックになることがあります、高圧水と高分子を押し出す必要です。高速液体クロマトグラフィー ポンプは、この目的のため使用できます。

2. フッ化水素酸で毛細血管のエッチング

注意: は、フッ化水素酸 (HF) ソリューションを処理しながら適切な安全手順を使用します。HF に関連するすべての操作は、化学のフードで行われる必要があります。任意の HF 関連操作の前に 2.5% カルシウム グルコン酸ゲルが露出の場合使用可能なことを確認します。二重手袋は必要な典型的なニトリル手袋の内側と重いネオプレン グローブの外。白衣や化学物質の安全ゴーグルを着用します。HF の操作の後に、液体と固体の有害廃棄物を切り離しておきます。HF の液体廃棄物は、廃棄物ピックアップする前に一時的な記憶域の高濃度水酸化ナトリウム溶液ですぐに中和する必要があります。HF 廃棄物は 2 つ厚いプラスチック 1 ガロンのジップロック袋やふたが並ぶプラスチック容器に一時的に保存する必要があります。両方固体および液体廃棄物が正しくラベル付けする必要があります。

  1. 穏やかな炎を用いた毛細血管の部分を燃やす (例えばポケットにライター) 毛細血管の一方の端から約 4 cm、ポリイミド - 外装 (長さ 1 cm) を削除します。優しくポリイミド コーティングを完全に削除を拭くことによって毛細血管の焦げた部分をクリーニングします。
    メモ: は、なし、ポリイミド塗膜は少し壊れやすい毛細血管の部分として、注意して進みます。
  2. それはこの穴に通して一度場所で毛細血管を十分に保持する毛細血管の外径と同じサイズを 200 μ L 管の端に小さな穴を開けます。焦げた部分がチューブになるまで、穴から焦げた部分の近くにある毛細血管の端を通します。
    注: 毛細血管の焦げた部分が壊れやすいように正しいサイズを確実に焼けた部分から毛細血管の端と穴のサイズをテストすることをお勧めします。
  3. 200 μ L 管 hf (48 ~ 51% 水溶液の水) 〜 150 μ L を追加し、HF ソリューションは毛細血管で焦げた部分を途中で、ようにします。90-100 分間室温で HF ソリューションには毛細血管を孵化させなさい。
    注: お勧めチューブのふたに別の穴が作成されます、インキュベーション中管を保持するためにいくつかの小さなオブジェクト (例えば、小ピペット チップ) を使用します。ピペット チップは、穿刺泡またはいくつかその他強固なプラットフォームから、掛けることができる反応チャンバから安全な環境を作成する使用できます。HF を含むチューブ下紙タオルを置き、流出の場合適切な手順を実行します。
  4. チューブから毛細血管を削除し、任意の残留 HF を削除する脱イオン水で外装を洗います。
    注: は、焦げた部分の最も狭い部分で毛細血管の外径が今 100 μ m より小さくする必要がありますを確認します。
  5. 割石を使用して、1 つの端の外径より小さい 100 μ m 分離毛管を生成する最も狭い部分の真ん中に毛細血管のエッチングの部分をカットします。毛管 1 m 分離を取得する毛細血管の非エッチング端をカットします。
    注: は、制度上定められたプロトコルに従って HF 廃棄物の処分します。

3. サンプルの準備

  1. 標準蛋白質の混合物の調製
    1. シトクロム c (Cyto.c、12 kDa、0.1 mg/mL)、リゾチーム (14.3 kDa、0.1 mg/mL)、β-カゼイン (24 kDa、0.4 mg/mL)、ミオグロビン (16.9 kDa、0.1 mg/mL)、カルボニックアンヒドラーゼ (CA, 29 kDa、0.5 mg/mL) とウシ血清アルブミン (BSA、66.5 kDa を含む標準的な蛋白質の混合物を準備します。、1.0 mg/mL) LC ms グレード在庫ソリューションとして水。
      注: 原液は、避けようと用-80 ° C で保存されますすることができます。
    2. CZE MS 分析用 LC MS グレード水で 50 mM 重炭酸アンモニウム溶液 (pH 8.0) で 10 倍原液を希釈します。
      注: は、膜フィルター (例えば、硝酸セルロース膜と 50 mm の直径の 0.2 μ m) を使用する前に重炭酸アンモニウムのソリューションをフィルターします。
  2. エシェリヒア属大腸菌のサンプルの調製
    1. OD600 値が 0.7 に近づくまで 225 rpm で揺れながら 37 ° C で LB 培地で培養大腸菌(K-12 MG1655) 細胞。エシェリヒア属大腸菌細胞を介して遠心分離 (3,283 × g, 10 分) を収集し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) メディアを削除すると複数回洗ってください。
    2. 8 M 尿素、プロテアーゼ阻害剤、および 100 mM 重炭酸アンモニウム (pH 8.0) を含む換散バッファーのエシェリヒア属大腸菌のセルを中断し、超音波細胞攪乱カップ ホーンを用いた完全なセル換散のため 15 分間氷の上 ultrasonicate。
      1. デューティ サイクル (%)を 50 に設定し、超音波細胞ホルモンの出力制御を 7 に設定します。
    3. 遠心上清 18,000 x gで 10 分間収集で溶解、ペレットを破棄します。タンパク質濃度測定ビシンコニン酸 (BCA) アッセイの上澄みの小さい因数を使用します。
      注: BCA アッセイと互換性になるためにより 3 M 低い尿素濃度を削減する 3 つの要因によって、少なくとも希釈するライセート ニーズ。BCA アッセイは、製造元の手順に基づいて実行されます。
    4. ミックス 1 mg 冷アセトンで大腸菌タンパク質の容積比は 1:4 と、タンパク質を沈殿させる一夜に-20 ° C で混合物を維持。
      注: は、すべて実験化学フードでアセトンを使用してを実行します。
    5. 沈殿したタンパク質 (12,000 × g、5 分) をスピンし、上清を削除します。(前に、と同じボリューム) 再度冷アセトンでペレットを洗浄し、再びスピンダウンします。
    6. 上澄みを除去し、分のカップルのための化学のフードで乾燥ペレットを許可します。
      注: しない蛋白ペレットを overdry していません。
    7. 溶解析出大腸菌タンパク質 (1 mg) 100 mM 重炭酸アンモニウム (pH 8.0) で 8 M 尿素を 200 μ l 添加します。
    8. 変性、軽減、およびサンプルのアルキル基を導入します。
      1. 蛋白質を変性する 30 分の 37 ° C でサンプルをインキュベートします。
      2. ジチオトレイトール (DTT) サンプルに (100 mM 重炭酸アンモニウム) の 1 M の DTT 溶液 2 μ L を追加し、37 ° C、30 分でサンプルをインキュベートを軽減します。
      3. ヨードアセトアミド (IAA) 蛋白質を (100 mM 重炭酸アンモニウム) の 1 M IAA 溶液 6 μ L を追加することによってサンプル アルキレートし、暗闇の中で室温で 20 分間サンプルをインキュベートします。
      4. 1 M の DTT 溶液 2 μ L を追加することによって DTT で余分な独立行政法人を癒やす、室温で 5 分間インキュベートします。ギ酸 (FA) を最終濃度 1% (v/v) を取得するサンプルを酸性化します。
        注: 減少およびアルキル化は下流の断片化のための蛋白質の展開を支援するために実行されます。これらの手順は、ジスルフィド結合の情報を失われます。目的タンパク質のジスルフィド結合を検討する場合は、これらの手順は省きます。化学フードすべて濃厚酸溶液を処理してください。
    9. 高速液体クロマトグラフィーを用いた C4 トラップ列 (例えば内径 4 mm、300 Å 細孔を有する 3 μ m の粒子が満載、長さ 10 mm) を使用してサンプルの塩分を除きます。波長 254 で UV 検出器を使用して検出のための nm。
      1. 80% (v/v) アセトニ トリル (ACN) 0.1% でそれをフラッシュすることによって列を 1 mL/分アクティブに移動相の流量を設定、10 分間水に FA 2% (v/v) ACN、0.1% でそれをフラッシュすることにより平衡と 10 分のための水で FA。
      2. 列に 500 μ g 蛋白質をロードし、2% (v/v) ACN、0.1% をそれらをフラッシュすることによって塩分を除く 1 mL/分の流量で 10 分の水で FA。
      3. 80% (v/v) ACN、0.1% のタンパク質を溶出水 1 mL/分の流量で 3 分間で FA。溶出液を収集し、真空濃縮、凍結乾燥します。
        注: 大量のタンパク質が可能なサンプルの損失のための蛋白質の低されていないマイクログラムを脱塩する C4 トラップ列を使用できます。限られた蛋白質材料、蛋白質の脱塩のため C4 メディアのピペット チップを使用を検討してください。サンプルを lyophilizing するときにタンパク質を overdry ように注意してください。
    10. 50 mM 重炭酸アンモニウム (pH 8.0) CZE MS の実験のための 250 μ L (仮定のサンプル損失サンプル準備中) 蛋白質の 500 μ g を溶かしてください。

4. CZE MS/MS システムとサンプルの分析のセットアップ

  1. CZE システムのセットアップ
    1. 5% または 10% (v/v) 酢酸を含む BGE の準備 (pH ~2.4 または 〜 2.2) LC MS のグレードの水。CZE オートサンプラーのバッファー トレイと一致する BGE バイアルに、BGE ~1.5 mL を入れてください。
      注: 新鮮な BGE 毎週、変更 BGE ソリューション バイアルに毎日確認任意の汚染を避けるためにします。
    2. 挿入管に試料溶液 (5-200 μ L) を追加し、CZE オートサンプラーのサンプル トレイ付きサンプル バイアル主体的に挿入管を入れた。
    3. CZE オートサンプラーにキャピラリー分離、BGE、サンプルを読み込みます。
      注: 最も正確にこのプロトコルで使用される言語を反映して 1 つの特定のオートサンプラーを使用 (材料の表を参照)、他のオートサンプラーに原則を適用ことができます。
      1. CZE オートサンプラーの手動制御のページでサンプルをロードを選択します。BGE バイアルをバッファー トレイでその位置に注目、オートサンプラーのバッファー トレイに読み込みます。サンプル トレイでその位置に注目、オートサンプラーのサンプル トレイにサンプル瓶をロードします。
        注: 楽器は手動制御でのメインの楽器ページにデバイス モニターの楽器の画像をクリックして、[手動直轄で運営できます。
      2. 毛細血管の非エッチング端を使用して CZE オートサンプラーに分離キャピラリをロードします。オートサンプラーを手動コントロールを使用して位置合わせの位置に置きます。毛細血管の非エッチング端に保持されます分離毛細血管まで物理的にスレッドできませんさらに穴に通します。
        注: この場合、毛細血管の最後はほとんど、電極の端と同じ高さで、少なくとも 50 μ L、サンプルの毛細血管の終わりは射出中にサンプルに没頭していることを確認するサンプル瓶に必要です。サンプル ボリュームがある場合低 (すなわち、5 μ L)、4.1.3.2.1 の手順で説明するように調整する毛細血管のニーズの噴射終りの高さ。
        1. 検体量は 50 μ L (すなわち、5 μ L) よりも低い場合は、毛細血管の噴射終りの高さを調整します。オートサンプラーを手動コントロールを使用してスタンバイに切り替えます。システムのサンプル位置を入力し、毛細血管をサンプルに移動します。さらにサンプル瓶の底に到達まで毛細血管の注入終了を押してください。
          注: この例では、サンプル注入が行えますバイアルにのみ 5 μ L のサンプルを。
      3. 手動のコントロールを使用して、フラッシュが 20 psi の圧力を使用して 20 分間 BGE で毛細血管を続けています。
  2. CZE MS インターフェイスのセットアップ
    1. 外径で 20-40 μ m のオリフィスを有する 2 つのエレクトロ スプレー エミッタにホウケイ酸塩のガラス管 (外径、内径、長さ 10 cm の 0.75 mm で 1 mm) を引く
      注: エレクトロ スプレー エミッタとして 4-5 cm の長さし、必要に応じて断石でそれを切る。すべてのガラスの処分鋭利な容器に廃棄物。20-40 μ m のヒントを得るための設定は次のとおりです。150、200 への圧力に、498 に熱、5 を引く、10 速度、遅延を設定します。使用する前に顕微鏡を用いたエミッタのサイズを確認します。必要に応じて、パラメーターを少し調整します。
    2. 商業電気速度論的励起シースフロー インターフェイス (材料の表を参照してください) の質量分析計の前面にマウント。シース バッファー リザーバーを 10% (v/v) メタノールと 0.2% (v/v) LC MS グレード水で FA を含むバッファー。
    3. 鞘バッファーを介して手動で注射器で加圧とインターフェイスでTをフラッシュします。スリーブ チューブを介してエレクトロ スプレー エミッタの 1 mm 外径端を通し、エミッタをTを介して継ぎ手の 1 つのポートに接続します。単にTを手動でフラッシュ再び鞘バッファーでエミッタを埋めるため注射器で。
    4. エミッタのオリフィスとインターフェイスに付属しているカメラの助けを借りて 〜 2 mm 質量分析計の入口間の距離を調整します。エレクトロ スプレーの鞘バッファー バイアルで 2-2.2 kV の電圧を適用します。安定したエレクトロ スプレーに到達するスプレー電圧を調整します。
      注: ないエレクトロ スプレーまたは不安定なエレクトロが見られる場合は、エミッタ、 T、およびチューブ シース バッファー バイアルとTに接続するために使用大きな気泡がないかどうかを確認するインターフェイスを確認します。エミッタのオリフィス、質量分析計の入口間の距離は、エミッタの 1 mm の外径と比較して概算できます。スプレー電圧は、エミッタのサイズによって異なります。20-40 μ m のエミッターの 2 2.2 kV は十分です。常に高電圧を使用する場合は注意してください。
    5. スプレー電圧の電源を切り、それをさらにプッシュすることはできませんまで優しくエミッタにTをキャピラリー分離のエッチング端を通します。この過程で毛細血管内に気泡がないかどうかを確認する毛細血管の射出端に低圧 (すなわち、5 つの psi) を適用されます。
      注: 毛細血管を介して Tに接続されてスリーブ管および継ぎ手。500 μ m 内にカメラの助けを借りてエミッタ内の毛細血管のエッチングの終わりの位置を調整します。エミッタの 1 mm の外径と比較して距離を概算できます。
    6. 毛細血管の射出端に低圧を停止します。少しシース バッファーでエミッタをフラッシュします。スプレーをテストするスプレー電圧 2 2.2 kV を再度適用します。
  3. CZE 法サンプル注入、分離、キャピラリーのフラッシュ、およびデータ集録のための質量分析計のトリガーのセットアップ
    1. 新しい方法を開始する主な機器の画面でファイルのドロップ ダウン メニューの下で新しい方法を選択します。
    2. 95 として 0、および期間と SV/EV、トレイサンプルとして、5 つの psi として圧力、 KV 入口を選択してサンプル注入の s。
      注: このサンプルは、毛細血管を介して加圧に注入されます。サンプル注入量は、ポアズイユの法則を使用して圧力と噴射時間に基づいて計算することができます。たとえば、95 のサンプル注入の 5 つの psi は、約 500 に対応サンプル容積 1 m 長い分離キャピラリー (内径 50 μ m) のための nL。
    3. CZE 分離パラメーターを選択し、データ集録をトリガーするためのパラメーターを設定します。
      1. 4,200 として InV、バッファーとしてトレイ、圧力0 psi としてKV 30、および期間として入口を設定標準タンパク質混合試料の分離のための s。6,600 として 20、および期間としてKV 0 psi として圧力バッファーとしてトレイInV入口を設定エシェリヒア属大腸菌のプロテオーム サンプルの分離のための s。
        メモ: 分離のための電圧はサンプルの複雑さに基づいて調整することができます。単純なタンパク質サンプルは、30 kV、解析を高速化に適用できます。複雑なサンプル、20 の kV は分離を遅くし、proteoform Id のためのより多くの MS/MS スペクトルを取得に適用されます。
      2. タイミング イベントの下でデータ集録をトリガーするためのパラメーターを設定します。手順 1; でアクティブに 0.0 とリレー 1型時間 (秒)を設定します。手順 2 で 1.0 とリレー 1型で非アクティブ化のための時間 (秒)を設定します。
    4. 600 として InV、バッファーとしてトレイ、圧力10 psi としてKV 30、および期間として入口を選択 s キャピラリーをフラッシュします。
    5. CZE MS と MS/MS 実験の方法ファイルを保存します。
  4. MS、MS/MS のセットアップ
    1. 四重極イオン トラップ質量分析計を用いた無傷タンパク質解析の MS、MS/質量パラメーターを設定 (材料の表を参照してください)。
      注: ポジティブ イオン モードと断片化のより高いエネルギーの衝突解離 (HCD) が用いられます。
      1. 曲ファイルの設定を調整する:無傷タンパク質モードに切り替えて、0.2 のトラップの圧力を使用します。キャピラリー温度 320 ° C および s-レンズ RF レベル 55 にイオン移動を設定します。
      2. MS、MS/MS メソッド ファイルをビルドします。
        1. 完全 MS 1E6、50 ms、最大射出時間と 600-2000 m/zスキャン範囲に数 3 microscans、解像度 (200 m/z ) で 240,000 を自動利得制御 (AGC) の目標値を設定します。
      3. MS/MS、完全な MS スペクトルの 8 つの最も強烈なイオンのデータ依存型買収 (DDA) を使用します。4 m/zと 20% に正規化された衝突エネルギー (NCE) に分離ウィンドウを設定します。1 microscans、解像度 (200 m/z ) に 120,000 に番号、1E5、AGC ターゲット値と最大射出時間 200 ms に設定します。
      4. 1E5 断片化をトリガーに強度の閾値を設定し、充電状態を個別の断片化に 5 よりも高いとイオンを設定します。同位体を除外するをオンにし、動的な除外を 30 に設定 s。
        注: 3 MS/MS の microscans の数を増やせます。この場合、Top3 DDA 法は、サイクル タイムを短縮するために使用できます。
    2. CE オートサンプラーとデータ集録の自動トリガーを質量分析計との間の有線接続を設定します。リレー 1 接点 Aおよび CE オートサンプラーの背面に1 連絡先 B を中継するワイヤの一方の端を接続します。開始 -するワイヤのもう一方の端を接続し、開始 +質量分析計の側に。
  5. サンプルの CZE MS/MS 実験と解析
    1. 適用 30 kV サンプル注入と外部電源を使用したキャピラリー分離およびエレクトロ テスト鞘バッファー バイアルで 2 2.2 kV CE の手動制御を使用します。
      注: 現在、分離はこの場合、周りは 8-9 μ A、BGE として酢酸 5% (v/v) を使用する場合。
    2. 質量分析計のコンピューターに、データ ・ アクイジション ・ シーケンスを設定するには、新しいシーケンスを選択します。
      1. サンプルの種類として不明なを選択し、ファイル名とパスを指定します。楽器法を実行各サンプルに使用する MS の方法を示します。
        注: CE オートサンプラーを制御するための別のコンピューターがある、のでは、ここで指定するサンプル位置が必要ありません。
    3. CZE メソッド、サンプル位置バッファーの位置を示す CE コンピューターに CZE 分離シーケンスを設定します。新しいシーケンスを開始するには、メインの楽器ページに解析ドロップ ダウン メニューの下シーケンスを選択します。
    4. シーケンスを実行(または単一の実行サンプルを実行) を選択することによってまず質量コンピューターでデータ取得メソッドを開始します。その後、CE オートサンプラー コンピューターの CE シーケンスを開始します。
      メモ: 分離電圧がのサンプル注入後、信号が送信されます CE オートサンプラーからデータ集録をトリガー質量分析計に。現在の分離は、動的 pH 接合サンプル スタッキングによる分離の間に初めに減少します。その後、現在は徐々 に回復します。

5. TopPIC ソフトウェアで収集された Raw ファイルの検索

  1. 質量分析計コンピューターをデータベース検索専用コンピューターから MS や MS/MS データなど、.raw ファイルを転送します。
    注: これらの .raw ファイルが大きくなるし、高速のデータベース検索に達するために強力なコンピューターが必要があります。
  2. データベース検索専用コンピューターに ProteoWizard と TopPIC のスイートをダウンロードします。
    注: ProteoWizard と TopPIC suite は、オープン ソースのソフトウェア、オンラインで見つけることができます (ProteoWizard: http://proteowizard.sourceforge.net;TopPIC スイート: http://proteomics.informatics.iupui.e.,u/software/toppic/)。UniProt のデータベースは、データベースの検索に使用され、UniProt のウェブサイトで見つけることができます。
  3. .Raw ファイルを変換すると、msconvert と .mzML ファイル、ProteoWizard28MS ファイル形式変換ツール。Msconvert (MSConvertGUI.exe) の gui の参照ボタンをクリックし、変換する .raw ファイルを選択します。出力形式として mzML を選択し、既定値の他のすべてのオプションを維持します。GUI の右下のスタートボタンをクリックします。
  4. TopPIC スイート29TopFD ツールで .msalign ファイルを .mzML ファイルに変換します。
    1. GUI の TopFD (topfd_gui.exe)、ファイルボタンをクリックし、前の手順で作成した .mzML ファイルを選択します。パラメーターの既定値を保持し、GUI の右下の開始ボタンをクリックします。
      注: TopFD モノアイソ大衆に前駆体とフラグメントの同位体クラスターを変換し、同様のモノアイソ固まりおよび近くの移行時間と前駆体同位体クラスターを組み合わせることにより MS1 データの可能な proteoform 機能を識別します。3 つのファイルが TopFD、ms1.msalign ファイル、ms2.msalign ファイル、.feature ファイルなどから生成されます。Ms1.msalign および ms2.msalign ファイルでは、MS1 および MS/MS スペクトルの deconvoluted モノアイソ大衆をそれぞれ含まれています。.Feature ファイルには、可能な proteoform 機能が含まれています。
  5. TopPIC スイート30TopPIC (1.1.3) を使ってデータベース検索を実行します。
    1. TopPIC gui (toppic_gui.exe) のデータベース ファイルをクリックし、適切なデータベースの検索を選択します。
    2. スペクトル ファイルをクリックし、ステップの入力として 5.4.1 で生成された ms2.msalign ファイルを選択します。MS1 機能ファイルを選択し、手順 5.4.1 で生成した .feature ファイルを選択します。
    3. 独立行政法人の治療のための固定変更としてシステイン carbamidomethylation (C57) を設定します。
      注: テキスト ファイルも作成できますさまざまな固定変更とテキスト エディターで。その後、TopPIC GUI の固定変更の横にある [ファイル] ボタンを使用して、テキスト ファイルを選択できます。
    4. おとりのデータベース機能を選択し、[カットオフ設定スペクトル レベルの横にあるドロップ ダウン メニューでFDR (虚偽の発見率) を選択します。Proteoform レベルでのスペクトル レベルで 0.05、0.01 に FDR を設定します。
      注: TopPIC は、結果をフィルター処理するための複数のオプションを提供します: FDR スペクトル レベル、proteoform レベルの FDR、またはその両方。FDR は、ターゲットおとりアプローチ31に基づいて評価されます。
    5. ままに生成関数選択し、許容誤差 (ppm)を 15 に設定します。
    6. [拡張パラメーター] には、ドロップ ダウン メニューで最大質量シフト数の 2 を選択します。最大質量シフト (Da) 500 への不明な変更の設定の da は既定値のままに他のすべてのパラメーターと GUI の右下のスタートボタンをクリックします。
      注: TopPIC ソフトウェアは、結果として得られる 2 つのテキスト ファイルを生成します。サフィックスを持つファイルです。OUTPUT_TABLE には、識別された proteoform スペクトル マッチ (PrSMs) とサフィックスを持つ 1 つのリストが含まれています。FORM_OUTPUT_TABLE には、識別された proteoforms のリストが含まれています。各 PrSM のソフトウェア試合、観測された断片化パターン一致するフラグメント イオンで一般的な情報を提供し、検出された質量をシフトします。

結果

図 1は、実験で使用される動的な pH ベース接合 CZE ESI MS システムの図を示しています。基本的なバッファーでサンプルの長いプラグは、LPA コーティング分離キャピラリー酸性 BGE でいっぱいに注入されます。高電圧を適用する後 I および II、分析サンプル ゾーンに集中されるを介して動的な pH 接合法。CZE MS システムのパフォーマンスを評価するには、標準的な蛋白質の混合物 (シトクロム c、リゾチーム、β-カゼイン、ミオグロビン、CA、および BSA) 通常分析します。標準蛋白質の混合物の代表的なレーザービームを図 2に示します。標準蛋白質の混合物は通常分離効率とシステムの再現性を評価し、少なくとも、実行します。図 2Bに示すように、いくつかのタンパク質の理論的な版の数の分離効率を評価できます。再現性は、タンパク質の強度と移行時間の相対標準偏差で評価できます。図 3Aは、動的 pH ベース接合 CZE - ms/ms 分析大腸菌蛋白質のサンプルのレーザービームの拡大ビューを示しています。正規化されたレベル (NL) 蛋白質強度 10 の規模にする必要があります8 1 μ gエシェリヒア属大腸菌タンパク質の四重極イオン トラップ質量分析計で分析のため読み込まれている場合。一塩のズームイン ビューは、システムの分離ウィンドウを評価するために使用できます。この場合、分離ウィンドウが 80-90 分図 3Bは、PrSM、一般に対応する proteoform 情報、タンパク質シーケンス、観測された断片化パターン修正など例を示しています。E 値を非常に低く (2.11E-48)、スペクトル FDR (0) proteoform ID の高信頼を提案します。一致するフラグメント イオン (60) さらに数が多いが ID の高い信頼性を示します観測された断片化パターンは、proteoform の断片化はテルミニ駅と、proteoform の中央部を覆う高効率を示しています。3 つのアミノ酸 (MTM) の N 末端胸の谷間は、データベースの検索によって決定されます。

figure-results-1278
図 1:図動的 pH ベース接合 CZE ESI MS システム。重炭酸アンモニウム 50 mM、pH 8 で、サンプルを溶解します。5% または 10% (v/v) 酢酸、pH ~2.4 〜 2.2 bge 中です。1 m LPA コーティング キャピラリーは、分離に使用されます。電気速度論的励起シース フロー インターフェイスを使用して MS に CZE。四重極イオン トラップ質量分析計が使用されます。高電圧私 (HV 私) 電源分離の CE オートサンプラーに統合によって提供されます。高電圧 (HV II) は、エレクトロ スプレーの別の電源供給によって提供されます。質量分析計を接地します。エミッタのオリフィス、質量分析計の入口の間の距離は、〜 2 mm です。エミッタにエッチングは毛細血管の終わりとエミッタの開口部間の距離は、未満 500 μ m です。エレクトロ スプレー エミッタのオリフィスのサイズは 20-40 μ m ですこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。 。

figure-results-2053
図 2: 動的 pH ベース接合の CZE-さんによって分析標準蛋白質の混合物のデータ(A) このパネルが基準ピーク レーザービームを示しています。(B) このパネルは、理論的な版 (N) 3 つのタンパク質の数を示します。サンプル注入量は 500 nL。私は 30 HV 分離、kV と HV II だった 2.2 kV エレクトロ スプレー。Bge 中 5% (v/v) 酢酸酸、pH 2.4 であった。サンプル 50 mM 重炭酸アンモニウム (pH 8) にあったし、シトクロム c (0.01 mg/mL)、リゾチーム (0.01 mg/mL)、β-カゼイン (0.04 mg/mL)、ミオグロビン (0.01 mg/mL)、カルボニックアンヒドラーゼ (CA、0.05 mg/mL) とウシ血清アルブミン (BSA、0.1 mg/mL) が含まれています。標準蛋白質の混合物サンプルの MS/MS スペクトルが取得されません。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-2821
図 3: データ、動的 pH ベース接合 CZE-MS さんによるエシェリヒア属大腸菌proteomeanalyzed の(A) このパネル、ズームインの番組観に基づいてピーク一塩エシェリヒア属大腸菌の蛋白質のサンプル。(B) このパネルは PrSM が取得した MS/MS スペクトルの TopPIC データベース検索によって識別される例を示します。タンパク質配列の一般的な対応する proteoform 情報フラグメント パターンを観察した、変更が表示されます。必要な場合は、個々 の PrSM から一致したフラグメント イオンは閲覧します。20 の頃 HV 分離、kV と HV II だった 2.2 kV エレクトロ スプレー。Bge 中は 10% (v/v) 酢酸、pH 2.2 〜 だったサンプルは、50 mM 重炭酸アンモニウム (pH 8)、蛋白質濃度 2 mg/mL であった。サンプル注入量は 500 nL。Top8 DDA 法は、データの集録に使用されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

ここでは、単純な蛋白質のサンプルの proteoforms の高分解能特性と複雑なプロテオーム サンプルで proteoforms の大規模な同定に CZE MS/MS を使用する詳細なプロトコルを提供します。CZE-MS/MS システムのダイアグラムは、図 1に示すです。プロトコルの 4 つの重要なステップがあります。まず、キャピラリー分離の内壁の高品質 LPA コーティングの準備は非常に重要です。LPA コーティングのキャピラリー分離は、キャピラリー中で EOF を減らす、CZE の分離ウィンドウを広げるし、その内壁19へのタンパク質吸着を削減できます。LPA コーティングを作るのための重合反応実行を介してアクリルアミド (モノマー) と (重合開始剤)、過硫酸アンモニウムの混合物をトリガーする水浴のキャピラリーを加熱することによって続いて毛細管を充填、反応22。風呂の水のタイミングは重要です。あまりにも短い反応時間、不完全な反応と貧しいコーティングに します。我々 は通常より良いコーティングで長期間続行する反応をできるように 50 分 goup に反応を許可します。反応期間の長い、毛細血管がブロックされ、HPLC ポンプ水毛管の内部ポリマーを押し出すために使用する必要があります。1 つの LPA コーティング キャピラリー連続使用約 1 週間文献データと当社の経験22に基づきます。

2 番目の重要なステップは、電気速度論的励起シース流-MS インターフェイス25,26MS に CZE を結合です。ESI エミッタのキャピラリー分離の終わり、エミッタ開口部間の距離大幅に CZE MS の感度に影響を与える、短い距離は高い感度25を生成します。キャピラリーの分離の終わりは、HF, 未満 100 μ m、エミッタ開口部近くにプッシュすると毛細血管の終わりを許可する 360 μ m からその外径を抑えるとエッチングする必要があります。エミッタ オリフィス、質量分析計の入口間の距離は、最高の感度と安定性の良い26に到達する最適化されています。我々 は通常 2 mm 程度の距離を保ちます。

3 番目の重要なステップは、CZE MS と動的オンライン pH ベース接合のサンプル スタック19MS/MS 分析。サンプル バッファーと、BGE の pH は効率的なサンプル スタックを確保するために大幅に異なる必要があります。サンプルの蛋白質の集中を適切な必要があります。タンパク質濃度が高すぎる場合、サンプル スタック時タンパク質キャピラリー中で沈殿できます。図 2および3を使用するサンプルのタンパク質の濃度は、典型的な例として考えることが。最後の重要なステップは、proteoform Id30の TopPIC でデータベースの検索です。複数のステップは、TopPIC でデータベース検索を実行することができます前にファイルの変換に必要です。適切な FDR フィルター識別された proteoforms の品質を確保する必要があります。我々 は通常 1% を使用してスペクトル レベル FDR データベース検索結果をフィルター処理します。我々 は、トップダウン プロテオミクス メソッドおよびデータ解析ソフトウェア32,33の非常に良いリソースをトップダウン プロテオミクス イニシアチブには注意してください。

我々 は、プロトコルのいくつかの部分は、少し変更する必要があり、いくつかのトラブルシューティングが必要になる可能性がありますに注意しなければなりません。水浴で重合の LPA コーティングの準備のための時間は、異なった実験室で異なる場合があります。Hf 時間キャピラリー分離のエッチングは、異なった実験室で異なる温度により若干変更する必要があります。-MS インターフェイスを設定する場合は、エレクトロ スプレーはエレクトロ スプレー エミッタに分離キャピラリをスレッド化する前に安定しているを確認します。ないエレクトロ スプレーまたは不安定なエレクトロが見られる場合は、エミッタ、 T、またはチューブ シース バッファー バイアルとTに接続するために使用大きな気泡がないかどうかを確認するインターフェイスを確認します。さらに、エミッタのオリフィス、質量分析計の入口間距離エレクトロ スプレーの安定性に影響を与えることができます、通常は約 2 mm。エレクトロ スプレー電圧はスプレーの安定性に影響を与えることができます。20-40 μ m のエミッターの 2 2.2 kV は通常十分です。前の段落で説明したよう、サンプルの蛋白質の集中を適切なする必要があります。タンパク質濃度が高すぎる場合、サンプル スタック時タンパク質キャピラリー中で沈殿できます。CE オートサンプラー コンピューター上の現在のプロファイルに注意を払います。現在が CZE 実行の非常に初めにゼロの場合、エアコンのプラグは、サンプル注入ステップ中に毛細血管に注入されるそれを意味します。バイアルに試料量が十分であることを確認します。現在は初めに正常、突然実行中にゼロになる場合は、通常、タンパク質の濃度が高すぎることを意味します。

CZE MS/MS このプロトコルに基づく単純なタンパク質試料の高分解能特性と複雑なプロテオームの大規模なトップダウン プロテオミクスができます。たとえば、CZE MS 6 タンパク質19を含む標準的な蛋白質の混合物の高分解能評価に近づいた。図 2に示すとおり、CZE MS 明らかに高分離効率の六つの蛋白質を分離、β-カゼインの 3 つの形態を明らかにした、多くの不純物を検出します。別の例として単発 CZE ・ MS/MS 1 x 108 以上 500 proteoform 190 蛋白質 Id と大腸菌のプロテオームからを使用して生成のみ 1 μ gエシェリヒア属大腸菌タンパク質の 1% スペクトル レベル FDR19。CZE MS/MS 改善によって複雑なプロテオームから Id 前シングル ショット CZE MS/MS 研究と比較して少なくとも 3 回、proteoform の数です。図 3Aに示すように、500 nL サンプル容積および19エシェリヒア属大腸菌のプロテオーム解析用 90 分分離ウィンドウ CZE MS/MS 同時に達した。TopPIC ソフトウェアは、識別された proteoforms (図 3B) に関する総合的な情報を提供することができます。CZE MS/MS システムは、大規模、高解像度のトップダウン プロテオミクス プロテオミクス コミュニティの便利なツールを提供します。

CZE MS/MS はまだ深いトップダウン プロテオミクスのためのいくつかの制限を持っています。Proteoform シングル ショット CZE ・ MS/MS から Id の数が概ね最新の市販清涼飲料水・ MS/MS34からの 50% でだけ CZE MS/MS を単一の実行にエシェリヒア属大腸菌のプロテオームから 500proteoform Id に達することができる我々 が、 35。このプロトコルでのみ HCD は、識別された proteoforms のカバレッジを限られた断片化につながるタンパク質の断片化に使用されます。いくつかの改善は数とシングル ショット CZE ・ MS/MS から Id proteoform の品質を改善するために CZE MS/MS プロトコルさせることができます。まず、キャピラリー分離の長さの増加詳細 proteoform Id につながる広い分離窓を提供しなければなりません。レート、および複数の断片化の方法 (例えばHCD、36電子移動解離 [ETD]、37紫外光解離 [UVPD]38 で第二に、非常に高い解像力と質量分析計を使用して、速いスキャンします。) 確かに proteoform Id の数と識別された proteoforms の断片化カバレッジを改善します。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、親切に実験のためのエシェリヒア属大腸菌のセルを提供するためミシガン州立大学化学科で Heedeok 香港のグループをありがとうございます。著者に感謝 (太陽と X. Liu) に一般的な医学の国立研究所、国立衛生の健康 (NIH) 助成金 (X. Liu) に R01GM118470 とグラント R01GM125991 からサポート。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Fused silica capillaryPolymicro Technologies106815001750 µm i.d. 360 µm o.d.
Sodium hydroxide pelletsMacron Fine Chemicals7708-10Corrosive
LC-MS grade waterFisher ScientificW6-1
Hydrochloric acidFisher ScientificSA48-1Corrosive
MethanolFisher ScientificA456-4Toxic, Health Hazard
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylateSigma-AldrichM6514Moisture and heat sensitive
Hydrofluoric acidAcros Organics423805000Highy toxic
AcrylamideAcros Organics164855000Toxic, health hazard
Ammonium persulfateSigma-AldrichA3678Health hazard, Oxidizer
lysozymeSigma-AldrichL6876
Cytochrome CSigma-AldrichC7752
MyoglobinSigma-AldrichM1882
ß-caseinSgma-AldrichC6905
Carbonic anhydraseSigma-AldrichC3934
Bovine serum albuminSigma-AldrichA2153
UreaAlfa Aesar36428-36
DL-DithiothreitolSigma-AldrichD0632Health Hazard
IodoacetamideFisher ScientificAC122270250Health Hazard
Formic AcidFisher ScientificA117-50Corrosive, Health Hazard
C4 trap columnSepax Technologies110043-4001C3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long
AcetonitrileFisher ScientificA998SK-4Toxic, Oxidizer
Ammonium bicarbonateSigma-Aldrich1066-33-7
Nalgene rapid-flow filtersThermo Scientific126-00200.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter
E. coli cellsK-12 MG1655
Dulbecco's phosphate-buffered salineSigma-AldrichD8537
BCA assayThermo Scientific23250
AcetoneFisher ScientificA11-1
HPLC system for protein desaltingAgilient1260 Infinity II
Acetic AcidFisher ScientificA38-212
CE autosamplerCMP ScientificECE-001
Electro-kinetically pumped sheath flow interfaceCMP Scientific
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass SpectrometerThermo Fisher Scientific
Sutter flaming/brown micropipette pullerSutter InstrumentsP-1000
Ultrasonic cell disruptor for cell lysisBranson101063196Model S-250A
Vaccum concentratorThermo Fisher ScientificSPD131DDA-115

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