Em grande escala proteômica de cima para baixo usando zona capilar eletroforese espectrometria de massa em Tandem

Um protocolo detalhado é descrito para a separação, identificação e caracterização de proteoforms em amostras de proteínas usando a zona capilar eletroforese-electrospray em tandem-ionização espectrometria de massa (CZE-ESI-MS/MS). O protocolo pode ser usado para a caracterização de alta resolução do proteoforms em amostras da proteína simples e a identificação em larga escala de proteoforms em amostras complexas proteome.

Zona capilar eletroforese-electrospray em tandem-ionização espectrometria de massa (CZE-ESI-MS/MS) tem sido reconhecida como uma ferramenta útil para proteômica de cima para baixo que visa caracterizar proteoforms no complexo proteomes. No entanto, a aplicação de CZE-MS/MS para proteômica de cima para baixo em larga escala tem sido dificultada pela baixa capacidade de carregamento de amostra e estreita janela de separação de CZE. Aqui, um protocolo é descrito usando CZE-MS/MS com um volume de amostra-carregamento microlitro-escala e uma janela de separação de 90 min para proteômica em grande escala de cima para baixo. A plataforma CZE-MS/MS é baseada em uma linear poliacrilamida (LPA)-revestida separação capilar com electroosmotic extremamente baixo fluxo, um método de concentração dinâmica amostra on-line baseados em pH-junção com uma eficiência elevada para empilhamento de proteína, uma interface de fluxo CE-MS bainha electro-cineticamente bombeado com sensibilidade extremamente elevada e um espectrômetro de massa ion trap com alta resolução de massa e velocidade de digitalização. A plataforma pode ser usada para a caracterização de alta resolução das amostras simples da proteína intacta e a caracterização em grande escala de proteoforms em vários proteomes complexos. Por exemplo, são demonstrados uma altamente eficiente separação de uma mistura de proteína padrão e uma detecção altamente sensível de muitas impurezas utilizando a plataforma. Como outro exemplo, esta plataforma pode produzir mais de 500 proteoform e executar 190 identificações de proteína de um proteome de Escherichia coli em uma única CZE-MS/MS.

Proteômica de cima para baixo (TDP) destina-se para a caracterização em grande escala de proteoforms dentro de um proteome. TDP depende a separação líquido-fase eficaz das proteínas intactas antes da análise de electrospray (ESI-MS/MS), espectrometria de massa em tandem-ionização devido a alta complexidade e alcance dinâmico de grande concentração do proteome^{1,2 ,3,4,5}. Eletroforese capilar de zona (CZE) é uma técnica poderosa para a separação de biomoléculas com base em suas proporções de tamanho-de-carga⁶. CZE é relativamente simples, exigindo apenas uma aberta tubular fundido sílica capilar, um eletrólito de fundo (BGE) e uma fonte de alimentação. Uma amostra de proteínas intactas pode ser carregada no capilar usando pressão ou tensão, e a separação é iniciada imergindo-se ambas as extremidades do capilar na BGE e aplicando uma alta tensão. CZE pode aproximar a eficiência de separação ultra alta (> 1 milhão de pratos teórico) para a separação de biomoléculas⁷. CZE-MS tem uma sensibilidade drasticamente mais elevada do que amplamente utilizada líquida cromatografia de fase reversa (SBST)-MS para análise de proteínas intactas⁸. Embora CZE-MS tem um grande potencial de proteômica em grande escala de cima para baixo, sua ampla aplicação em proteômica tem sido impedida por várias questões, incluindo uma baixa capacidade de carregamento de amostra e separação estreita janela. O exemplo típico carregamento volume em CZE é cerca de 1% do volume total capilar, que geralmente corresponde a menos de 100 nL^9,10,11. A janela de separação de CZE é geralmente menos de 30 min devido a electroosmotic forte fluxo (EOF)^9,10. Estas questões limitam a CZE-MS/MS para a identificação de um grande número de proteoforms e baixa proteoforms abundante de um proteome complexo.

Muito esforço foi feito para melhorar a amostra carregar volume de CZE via on-line amostra concentração métodos (por exemplo, solid-phase microextraction [SPME]^12,13, amostra de campo avançado empilhamento [FESS]^{9 , 11 , 14}e pH dinâmico junção^15,16,17,18). FESS e junção de pH dinâmico são mais simples do que de SPME, exigindo apenas uma diferença significativa entre o amortecedor da amostra e a BGE na condutividade e pH. FESS emprega um amortecedor da amostra com muito baixa condutividade do que o BGE, levando a um empilhamento de analitos na fronteira entre a zona da amostra e a zona BGE no capilar. Junção de pH dinâmico utiliza um plug de amostra básica (por exemplo, bicarbonato de amónio de 50 mM, pH 8) e um ácido BGE (por exemplo, ácido acético a 5% [v/v], pH 2,4) em ambos os lados do plugue de amostra. A pedido de uma alta tensão positiva na extremidade do capilar de injeção, a titulação da amostra básica ficha ocorre, focando os analitos em um plugue apertado antes de sofrer uma separação CZE. Recentemente, o grupo sol sistematicamente comparado FESS e junção de pH dinâmico para o empilhamento on-line de proteínas intactas, demonstrando aquela junção de pH dinâmico poderia produzir desempenho muito melhor do que a faixa de concentração on-line de proteínas intactas quando o volume de injeção da amostra foi de 25% do volume total capilar¹⁹.

Capilares neutra revestido de separação (por exemplo, poliacrilamida linear [LPA]) têm sido empregados para reduzir o EOF no capilar, diminuindo a separação CZE e ampliando a separação janela^20,21. Recentemente, o grupo Dovichi desenvolveu um procedimento simples para a preparação do revestimento de LPA estável na parede interna dos vasos capilares, utilizando persulfato de amónio (APS) como o iniciador e a temperatura (50 ° C) para a produção de radicais livres e polimerização²² . Muito recentemente, o grupo sol empregado a separação LPA-revestido capilar e o método de junção de pH dinâmico para a separação de CZE de proteínas intactas, atingindo uma amostra de microlitro-escala carregar volume e uma janela de separação 90-min¹⁹. Este sistema CZE abre as portas para usar CZE-MS/MS para proteômica em grande escala de cima para baixo.

CZE-MS requer uma interface altamente robusto e sensível ao casal CZE-MS. Três interfaces de CE-MS tem sido bem desenvolvido e comercializado na história da CE-MS, e eles são a bainha-fluxo co-axial interface²³, a interface sheathless utilizando uma ponta porosa como o emissor ESI²⁴e o electro-cineticamente bombeado bainha flow interface^25,26. A electro-cineticamente bombeada baseada em bainha-fluxo-interface CZE-MS/MS atingiu uma baixa zeptomole peptídeo deteção limite⁹, mais de 10.000 identificações de peptídeo (IDs) do HeLa celular proteome em um único executar¹⁴, uma rápida caracterização de proteínas intactas¹¹e análises altamente estáveis e reprodutíveis de biomoléculas²⁶. Recentemente, o capilar de separação LPA-revestido, o método de junção de pH dinâmico e a interface de fluxo electro-cineticamente bombeado bainha foram usados para em grande escala proteômica de cima para baixo de um proteome de Escherichia coli (e. coli)^{19 ,},²⁷. A plataforma CZE-MS/MS aproximou-se mais de 500 proteoform IDs em um único executar¹⁹ e quase 6.000 proteoform IDs através do acoplamento com tamanho-exclusão cromatografia (SEC)-SBST fracionamento²⁷. Os resultados mostram claramente a capacidade de CZE-MS/MS para proteômica em grande escala de cima para baixo.

Neste documento, um procedimento detalhado de usar CZE-MS/MS para proteômica de cima para baixo em grande escala é descrito. O sistema CZE-MS/MS emprega o capilar LPA-revestido para reduzir o EOF no capilar, o método de junção de pH dinâmico para o on-line concentração de proteínas, a interface de fluxo de bainha electro-cineticamente bombeado para acoplamento CZE-MS, um orbitrap massa espectrômetro para a coleção de espectros de MS e MS/MS de proteínas e um software de tombar (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform identificação e caracterização) para proteoform ID através do banco de dados pesquisa.

1. preparação da LPA revestimento na parede interna do capilar separação

1. Pré-tratamento do capilar
   1. Liberar um capilar de sílica fundida (120 cm de comprimento, 50 µm de diâmetro interno [ID], 360 µm de diâmetro exterior [overdose]) sucessivamente com 500 µ l de 1 M de hidróxido de sódio, água deionizada, ácido clorídrico 1 M, água deionizada e metanol grau de LC-MS usando uma bomba de seringa.
   2. Secar o capilar com gás de nitrogênio (10 psi, ≥ 12 h) e preencher o capilar com 50% (v/v) 3-(trimetoxissilil) metacrilato de propilo em metanol usando uma bomba de seringa. Selar as duas extremidades do capilar com borracha de silicone e incube-lo em temperatura ambiente pelo menos 24 h.
      Nota: Durante esta etapa, a parede interna do capilar é acrescida com C = C. Longer incubação resulta em melhor revestimento capilar devido a uma reação mais completa.
   3. Corte uma pequena porção (~ 5 mm) do capilar de ambos os lados com uma pedra de chicotada. Enxágue o capilar com metanol (500 µ l) usando uma bomba de seringa para limpar os reagentes não tenha reagidos. Seque o capilar com gás de nitrogênio (10 psi, ≥12 h).
2. Preparação do revestimento LPA
   Nota: Este procedimento é baseado em Zhu et al . ²² com pequenas modificações.
   1. Prepare uma solução de acrilamida (40 mg de acrilamida em 1 mL de água) e solução de (APS) de persulfato de amónio (5% [w/v] na água).
   2. Adicionar 2-3 µ l da solução APS a 500 µ l da solução de acrilamida, vórtice a mistura e desgaseificá-lo com gás de nitrogênio por 5 min remover o oxigênio na solução.
   3. Carregar a mistura para o pré-tratamento capilar usando um vácuo, selar as duas extremidades do capilar com borracha de silicone e incube-lo num banho de água a 50 ° C por 40 min.
   4. Retire uma pequena porção (~ 5 mm) do capilar de ambos os lados com uma pedra de chicotada. Empurre a solução não tenha reagida fora do capilar com água (200 µ l), usando a bomba de seringa.
      Nota: Certifique-se o polímero empurrado para fora do capilar é uma consistência de gel de agarose. Um passo mais longo de incubação (até ~ 45-50 min) pode resultar em um melhor revestimento capilar. Com períodos mais longos de reação, o capilar pode tornar-se bloqueada e alta pressão é necessária para empurrar para fora o polímero com água. Uma bomba HPLC pode ser usada para essa finalidade.

2. condicionamento do capilar com ácido fluorídrico

Atenção: Use regras de segurança adequadas durante o manuseio de soluções de ácido fluorídrico (HF). Todas as operações relacionadas com HF precisam ser feitas em uma capa de química. Antes de qualquer operação de HF, certifique-se que o gel de gluconato de cálcio 2.5% está disponível para uso em caso de exposição. Luvas duplas são necessárias, uma luva de nitrilo típico dentro e um pesado neoprene luva fora. Vestir um jaleco e óculos de segurança química. Após as operações de HF, separe resíduos líquidos e sólidos. O desperdício de HF líquido deve ser neutralizado imediatamente com uma solução de hidróxido de sódio de alta concentração para armazenamento temporário, antes da recolha de resíduos. Os resíduos sólidos de HF precisa ser armazenada temporariamente em um recipiente de plástico que está alinhado com duas grossos sacos Ziploc um galão plásticos e uma tampa. Tanto os resíduos sólidos e líquidos devem ser rotulados corretamente.

1. Queimar uma parte do capilar utilizando uma chama suave (por exemplo, isqueiro de bolso) para remover o poliimida-revestimento externo (1 cm de comprimento) cerca de 4 cm uma das extremidades do capilar. Gentilmente Limpe a parte queimada do capilar para remover a revestimento completamente poliimida.
   Nota: Proceda com cuidado, como a porção do capilar sem o revestimento de poliimida vai ser um pouco frágil.
2. Faça um furo pequeno na extremidade de um tubo de 200 µ l em torno do mesmo tamanho que o diâmetro exterior capilar para prender suficientemente o capilar no lugar, uma vez que é enfiada neste buraco. Segmento final do que é próximo a parte queimada pelo buraco até que a parte queimada no tubo capilar.
   Nota: É recomendável para testar o tamanho do buraco com o fim do capilar longe a parte queimada para assegurar o tamanho correto, como a parte queimada do capilar é frágil.
3. Adicione ~ 150 µ l de HF (48-51% solução em água) para o tubo de 200 µ l para que a solução de HF é sobre incompletamente a parte queimada no capilar. Incube o capilar na solução de HF, à temperatura de 90-100 min.
   Nota: É recomendável que um outro furo é criado na tampa do tubo e algum objeto pequeno (por exemplo, uma ponta pequena pipeta) é usado para segurar o tubo durante a incubação. A ponta da pipeta pode ser usada para perfurar a espuma ou alguma outra sólida plataforma do qual pode pendurar a câmara de reação, criando um ambiente seguro. Coloque papel toalha abaixo o tubo contendo HF e siga os procedimentos adequados no caso de um derrame.
4. Retire o tubo capilar e lavar o exterior com água desionizada para remover qualquer HF residual.
   Nota: Certifique-se que o diâmetro exterior do capilar na parte mais estreita da parte queimada agora é menor do que 100 µm, como deve ser.
5. Corte a parte gravada do capilar no meio da parte mais estreita, usando uma pedra chicotada para produzir um capilar de separação com menos de 100 µm no diâmetro externo em uma extremidade. Corte a extremidade não-gravadas do capilar para obter uma separação de 1m capilar.
   Nota: Descarte de resíduos de HF, de acordo com o protocolo institucional prescrito.

3. preparação das amostras

1. Preparação de uma mistura de proteína padrão
   1. Prepare uma mistura de proteína padrão contendo o citocromo c (Cyto.c, 12 kDa, 0,1 mg/mL), lisozima (14,3 kDa, 0,1 mg/mL), β-caseína (24 kDa, 0,4 mg/mL), mioglobina (16,9 kDa, 0,1 mg/mL), anidrase carbônica (CA, 29 kDa, 0,5 mg/mL) e albumina de soro bovino (BSA, kDa 66.5 1,0 mg/mL) na LC-MS classe água como uma solução.
      Nota: A solução pode ser aliquotadas e armazenado a-80 ° C para uso.
   2. Dilua a solução-mãe por um fator de 10 com uma solução de bicarbonato de amónio de 50mm (pH 8.0) em água de grau de LC-MS para análise CZE-MS.
      Nota: A solução de bicarbonato de amónio antes da utilização do filtro com um filtro de membrana (por exemplo, 0,2 µm de membrana nitrato de celulose e 50 mm de diâmetro).
2. Preparação de uma amostra de Escherichia coli
   1. Células de Escherichia coli (K-12 MG1655) de cultura em meio LB a 37 ° C, agitando a 225 rpm até o valor de OD600 se aproxima de 0,7. Coletar e. coli células através decentrifugação (3.283 x g, 10 min) e lavá-los várias vezes com tampão fosfato salino (PBS) para remover o meio.
   2. Suspender as células de Escherichia coli no tampão de Lise contendo 8 M ureia, inibidores de protease e 100 mM de amônio bicarbonato (pH 8.0) e ultrasonicate no gelo por 15 min, usando um disruptor celular ultra com um copo de chifre para lise celular completo.
      1. Definir o Ciclo de trabalho (%) para 50 e ajuste o Controle de saída de 7 para o disruptor celular ultra-sônico.
   3. Centrifugue o lisado a 18.000 x g durante 10 min. recolher o sobrenadante e descartar a pelota. Use uma pequena alíquota do sobrenadante para medição de concentração de proteína com o ensaio de bicinchoninic ácido (BCA).
      Nota: O lisado precisa ser diluído pelo menos por um factor de três para reduzir a concentração de ureia, inferior a 3 M para tornar-se compatível com o ensaio BCA. O ensaio BCA é executado com base no procedimento do fabricante.
   4. Misturar 1 mg de proteínas de e. coli com acetona gelada com uma relação de volume de 1:4 e manter a mistura a-20 ° C durante a noite para precipitar as proteínas.
      Nota: Execute todos os experimentos usando acetona numa vizinhança de química.
   5. Spin para baixo precipitado de proteínas (12.000 x g, 5 min) e remover o sobrenadante. Lave o pellet com acetona gelada novamente (mesmo volume como antes) e spin para baixo novamente.
   6. Remover o sobrenadante e permitir a pelota secar no bairro químico por alguns minutos.
      Nota: Não ressecar a pelota de proteína.
   7. Dissolver o precipitado proteínas de e. coli (1 mg) em 200 µ l de 8 M de ureia em bicarbonato de amónio de 100 mM (pH 8.0).
   8. Desnaturar, reduzir e alquilada a amostra.
      1. Incube a amostra a 37 ° C por 30 min desnaturar as proteínas.
      2. Reduza com ditiotreitol (DTT), adicionando 2 µ l de uma solução 1 M DTT (em bicarbonato de amónio de 100mm) para fazer a amostra e incubar a amostra a 37 ° C por 30 min.
      3. Alkylate as proteínas com iodoacetamide (IAA) adicionando 6 µ l de solução 1 M de IAA (em bicarbonato de amónio de 100 mM) para a amostra e incubar a amostra por 20 min em temperatura ambiente no escuro.
      4. Saciar o excesso IAA com TDT, adicionando 2 µ l de uma solução 1 M DTT e incubar durante 5 min à temperatura ambiente. Acidificar a amostra com solução de ácido fórmico (FA) para obter uma concentração final de FA de 1% (v/v).
         Nota: Redução e alquilação são realizadas para auxiliar o desdobramento das proteínas para fragmentação a jusante. Esses passos irão perder as informações das ligações de bissulfeto. Se o objetivo é estudar as ligações de bissulfeto sobre as proteínas, evite esses passos. Lembre-se de lidar com todas as soluções de ácido concentradas em uma capa de química.
   9. Do desalt a amostra com uma coluna de armadilha de C4 (por exemplo, 4mm do bilhete de identidade, 10 mm de comprimento, embalado com partículas 3 µm, tendo 300-Å poros) com um sistema HPLC. Usar um detector de UV no comprimento de onda de 254 nm para a deteção.
      1. Definir a taxa de fluxo da fase móvel de 1 mL/min. Activate a coluna nivelando-o com 80% (v/v) acetonitrila (ACN), 0,1% FA em água por 10 min e equilibrar nivelando-a com 2% (v/v) do Grupo ACN, 0,1% FA em água por 10 min.
      2. Carregar 500-µ g proteínas para a coluna e do desalt nivelando-os com 2% (v/v) do Grupo ACN, 0,1% FA em água por 10 min a uma taxa de fluxo de 1 mL/min.
      3. Eluir as proteínas com 80% (v/v) do Grupo ACN, 0,1% FA em água por 3 min em uma taxa de fluxo de 1 mL/min. Recolher o eluato e lyophilize-lo com um concentrador a vácuo.
         Nota: A coluna de armadilha de C4 pode ser usada para do desalt grandes quantidades de proteínas, mas não baixas microgramas de proteínas devido à perda de amostra possível. Para materiais de proteína limitada, considere o uso de pontas de pipetas com mídia de C4 para dessalinização de proteína. Tenha cuidado para não ressecar as proteínas quando liofilização a amostra.
   10. Dissolva a 500 µ g de proteínas (assumindo que não há perda de amostra durante a preparação da amostra) em 250 µ l de 50mm bicarbonato de amónio (pH 8.0) para experiências CZE-MS.

4. configuração do sistema CZE-MS/MS e análise das amostras

1. Set-up do sistema CZE
   1. Preparar um BGE contendo 5% ou 10% (v/v) de ácido acético (pH ~2.4 ou ~ 2.2) na LC-MS classe água. Colocar um frasco BGE que corresponda com a bandeja de tampão do mostruário CZE ~1.5 mL da BGE.
      Nota: Certifique BGE fresco cada semana e alterar a solução BGE no frasco todos os dias para evitar qualquer contaminação.
   2. Adicionar uma solução de amostra (5-200 µ l) para um tubo de inserção e colocar o tubo de inserção em um thatmatches do frasco de amostra com a bandeja de amostra do mostruário CZE.
   3. Carrega a amostra, a BGE e a separação capilar para o mostruário CZE.
      Nota: A linguagem utilizada neste protocolo com mais precisão reflete o uso de um mostruário particular (ver Tabela de materiais), mas os princípios podem ser aplicados a outros Rotating.
      1. Selecione a amostra carregar na página de controle manual do mostruário CZE. Carrega o frasco BGE na bandeja de tampão de mostruário, observando sua posição na bandeja de tampão. Carrega o frasco da amostra para a bandeja de amostra de mostruário, observando sua posição na bandeja de amostra.
         Nota: O instrumento pode ser operado no controle manual, clicando na imagem do instrumento para o Monitor do dispositivo na página principal do instrumento e selecione Manual sob o Controle direto.
      2. Carrega o capilar de separação para o mostruário CZE, usando a extremidade não-gravadas do capilar. Colocar o mostruário automático para a posição de alinhamento usando o controle manual. Segmento final do capilar não gravadas em um buraco que é usado para manter a separação capilar até não pode ser fisicamente enfiava ainda mais.
         Nota: neste caso, o fim do capilar é quase à mesma altura como o fim do eletrodo, e pelo menos 50 µ l da amostra é necessário no frasco de amostra para certificar-se de que o fim do capilar é imerso na amostra durante a injeção. Se o volume da amostra é baixa (ou seja, 5 µ l), a altura da extremidade do capilar precisa ser ajustada conforme descrito na etapa 4.1.3.2.1 de injeção.
         1. Ajuste a altura da extremidade do capilar de injeção se o volume da amostra for inferior a 50 µ l (ou seja, 5 µ l). Alterne o mostruário para modo de espera usando o controle manual. Digite a posição da amostra no sistema e mover o capilar com a amostra. Empurre a extremidade da injeção do capilar ainda mais até alcançar o fundo do frasco de amostra.
            Nota: neste caso, a injeção de amostra pode ser realizada com uma amostra de apenas 5 µ l no frasco.
      3. Continuando a usar o controle manual, irrigue o capilar com a BGE por 20 min, usando uma pressão de 20 psi.
2. Configuração da interface CZE-MS
   1. Puxar um vidro de borosilicato capilar (1 mm no o.d., 0,75 mm na identificação, 10 cm de comprimento) em dois emissores de electrospray com um orifício de 20-40 µm em o.d.
      Nota: Manter o comprimento do emissor electrospray como 4-5 cm e corte-o com uma chicotada pedra se necessário. Descarte de vidro de todos os resíduos em um recipiente de objectos cortantes. As configurações para obter dicas de 20 a 40 µm são como segue. Defina o calor de 498, a puxar a 5, a velocidade para 10, o atraso para 150 e a pressão para 200. Verificar o tamanho dos emissores com um microscópio antes do uso. Ajuste os parâmetros ligeiramente se necessário.
   2. Monte um fluxo comercial bainha electro-cineticamente bombeado interface (consulte a Tabela de materiais) para a frente do espectrômetro de massa. Encha o reservatório de tampão de bainha com um buffer que contém metanol a 10% (v/v) e 0,2% (v/v) FA em água de grau de LC-MS.
   3. Lave o T na interface com a bainha reserva via aplicando pressão manualmente com uma seringa. Segmento final 1-mm-diâmetro externo de um emissor de electrospray através de uma tubulação de manga e ligue o emissor com uma porta da Tatravés de um encaixe. Simplesmente lave o T manualmente novamente com uma seringa para encher o emissor com o buffer de bainha.
   4. Ajuste a distância entre o orifício do emissor e a entrada do espectrômetro de massa para ~ 2 mm com a ajuda da câmera que acompanha a interface. Aplica uma tensão de 2 a 2,2-kV no frasco de tampão a bainha por electrospray. Ajuste a tensão do pulverizador para alcançar um electrospray estável.
      Nota: Se não electrospray ou um instável electrospray for observado, verifique a interface para certificar-se de que não há nenhum grande bolha no emissor, o T, na tubagem que usados para conectar o frasco de tampão da bainha e o T. A distância entre o orifício do emissor e a entrada do espectrômetro de massa pode ser estimada grosseiramente comparando-a com a overdose de 1 mm do emissor. A tensão de pulverização depende do tamanho do emissor. Para emissores de 20 a 40 µm, 2-2,2 kV é bom o suficiente. Lembre-se sempre ter cuidado ao usar altas tensões.
   5. Desligar a tensão do pulverizador e delicadamente passe final gravado da separação capilar através de T para o emissor até que não pode ser empurrado ainda mais. Aplica uma pressão baixa (ou seja, 5 libras por polegada quadrada) na extremidade do capilar de injeção durante este processo para certificar-se de que não há nenhuma bolha no capilar.
      Nota: O capilar está ligado à T através de um tubo de manga e um encaixe. Ajuste a posição da extremidade gravada do capilar no emissor com a ajuda da câmera para dentro de 500 µm. A distância pode ser estimada grosseiramente comparando-a com a overdose de 1 mm do emissor.
   6. Pare a baixa pressão na extremidade do capilar de injeção. Lave o emissor um pouco com o buffer de bainha. Aplica novamente, 2-2,2 kV de tensão do pulverizador para testar o spray.
3. Set-up de um método CZE para injeção da amostra, separação, lavagem capilar e acionamento do alarme o espectrômetro de massa para aquisição de dados
   1. Selecione o novo método sob o menu drop-down de arquivo na tela principal instrumento para dar início a um novo método.
   2. Selecione a entrada como SV/EV, bandeja como amostra, pressão como 5 psi KV como 0 e a duração como 95 s para uma injeção de amostra.
      Nota: A amostra é injetada o capilar através de aplicação de pressão. O volume de injeção da amostra pode ser calculado com base no tempo de pressão e injeção usando a lei de Poiseuille. Por exemplo, 5 psi para uma injeção de amostra 95-s corresponde a cerca de 500 nL do volume de amostra-carregamento para uma separação de 1 m de comprimento capilar (identificação de 50 µm).
   3. Selecione os parâmetros para a separação de CZE e configurar parâmetros para desencadear a aquisição de dados.
      1. Conjunto de entrada como InV, bandeja como Buffer, pressão como 0 psi KV como 30 e duração como 4.200 s para a separação da amostra mistura padrão de proteína. Conjunto de entrada como InV, bandeja como Buffer, pressão como 0 psi KV como 20 e duração como 6.600 s para a separação da amostra do proteome de Escherichia coli .
         Nota: A tensão aplicada a separação pode ser ajustada com base na complexidade da amostra. Para obter exemplos de proteínas simples, 30 kV pode ser aplicado para acelerar a análise. Para amostras complexas, 20 kV é aplicado para abrandar a separação e adquirir mais espectros de MS/MS para proteoform IDs.
      2. Configure os parâmetros para desencadear a aquisição de dados em Eventos cronometrados. Definir a hora (s) como 0,0 e tipo como relé 1 para Ativar na etapa 1; Definir tempo (s) como 1.0 e tipo como relé 1 para desativar na etapa 2.
   4. Selecione a entrada como InV, bandeja como Buffer, pressão como 10psi KV como 30 e a duração como 600 s para irrigação capilar.
   5. Salve os arquivos de método para o CZE-MS e MS/MS experimentos.
4. Configuração do MS e MS/MS
   1. Configurar os parâmetros de MS e MS/MS para análise de proteína intacta usando um espectrômetro de massa quadrupolo íon trap (ver Tabela de materiais).
      Nota: O modo de íon positivo e maior energia colisão dissociação (HCD) para fragmentação são empregados.
      1. Ajustar as configurações do arquivo de música: ativar o modo de proteína intacta e usar uma pressão de caça com armadilhas de 0,2. Como a transferência de iões capilar temperatura de 320 ° C e o nível de RF de s-lente 55.
      2. Criar o arquivo de método de MS e MS/MS.
         1. Para MS completa, defina o número de microscans a 3, a resolução de 240.000 (em m/z 200), o valor de destino do ganho automático (AGC) de controle para 1E6, o tempo de injeção máxima de 50 ms e o intervalo de varredura para 600-2000 m/z.
      3. Por MS/MS, use aquisição de dados dependentes (DDA) para os oito íons mais intensos em um espectro completo de MS. Defina a janela de isolamento 4 m/z e a energia de colisão normalizada (NCE) para 20%. Defina o número de microscans para 1, a resolução para 120.000 (em m/z 200), o valor de destino do AGC para 1E5 e o tempo de injeção máxima de 200 ms.
      4. Defina o limiar de intensidade para provocar a fragmentação de 1E5 e os íons com um estado de carga superior a 5 a ser isolado por fragmentação. Ligue o excluir isótopos e definir a exclusão dinâmica de 30 s.
         Nota: O número de microscans por MS/MS pode ser aumentado para 3. Neste caso, um método de Top3 DDA pode ser usado para reduzir o tempo de ciclo.
   2. Configure uma conexão com fios entre o mostruário de CE e o espectrômetro de massa para o acionamento automático da aquisição de dados. Conecte uma extremidade de um fio para o contato de relé 1 A e 1 B do contato de relé na parte de trás do mostruário do CE. Conecte a outra extremidade do fio para Começar em.. - e Iniciar em + no lado do espectrômetro de massa.
5. Experimento de CZE-MS/MS e análise das amostras
   1. Aplicar 30 kV usando o controle manual da CE na extremidade de injeção de amostra e 2-2,2 kV no frasco de tampão de bainha usando a fonte de alimentação externa para testar a separação capilar e electrospray.
      Nota: A separação atual, neste caso, é em torno de 8-9 µA se ácido acético a 5% (v/v) é usado como a BGE.
   2. Configurar uma sequência de aquisição de dados no computador de espectrômetro de massa, selecionando uma nova sequência.
      1. Selecione o desconhecido como o tipo de amostra e especificar um nome de arquivo e caminho. Indica o método de MS deve ser usado para cada amostra executada sob Método de instrumento.
         Nota: Uma vez que existe um computador separado para controlar o mostruário de CE, a posição da amostra não precisa ser especificado aqui.
   3. Configure uma sequência de separação CZE no computador CE para indicar a posição do buffer, posição de amostra e o método CZE. Para iniciar uma nova sequência, selecione sequência sob o menu drop-down de análise na página principal do instrumento.
   4. Inicie o método de aquisição de dados no computador de espectrômetro de massa primeiro selecionando executar sequência (ou executar amostra para funcionamentos único). Em seguida, inicie a sequência de CE no computador de mostruário de CE.
      Nota: Quando a tensão de separação é na após a injeção da amostra, um sinal é enviado do mostruário de CE para o espectrômetro de massa para provocar a aquisição de dados. A separação atual irá diminuir no início durante a separação devido o empilhamento de amostra de junção de pH dinâmico. Em seguida, a corrente se recupera gradualmente.

5. banco de dados pesquisa dos arquivos brutos coletados com o Software de tombar

1. Transferi os arquivos RAW, incluindo os dados do MS e MS/MS, a partir do computador do espectrômetro de massa a um computador dedicado à pesquisa de banco de dados.
   Nota: Esses arquivos RAW podem ser grande e exigir um computador poderoso para alcançar uma pesquisa de banco de dados rápido.
2. Baixe ProteoWizard e tombar suite no computador dedicado à pesquisa de banco de dados.
   Nota: ProteoWizard e tombar suite são software open-source e pode ser encontrada on-line (ProteoWizard: http://proteowizard.sourceforge.net; Suíte de tombar: http://proteomics.informatics.iupui.e.,u/software/toppic/). UniProt bancos de dados são usados para pesquisas de banco de dados e podem ser encontrados no site UniProt.
3. Converta os arquivos RAW em arquivos de .mzML com msconvert, uma ferramenta de conversão de formato de arquivo do MS em ProteoWizard²⁸. Na GUI de msconvert (MSConvertGUI.exe), clique no botão Browse e selecione o arquivo RAW a ser convertido. Selecione mzML como formato de saída e manter todas as outras opções em seus valores padrão. Clique no botão Iniciar no canto inferior direito da interface gráfica.
4. Converta os arquivos de .mzML para .msalign arquivos com a ferramenta TopFD em tombar suíte²⁹.
   1. Na GUI de TopFD (topfd_gui.exe), clique no botão arquivo e selecione o arquivo de .mzML criado na etapa anterior. Mantenha os valores padrão dos parâmetros e, em seguida, clique no botão Iniciar no canto inferior direito da interface gráfica.
      Nota: TopFD converte precursor e fragmento clusters isotópicas para monoisotópico massas e identifica características proteoform possível em dados MS1 combinando clusters isotópica de precursor com semelhante monoisotópico massas e vezes perto de migração. Três arquivos serão gerados a partir de TopFD, incluindo um arquivo de ms1.msalign, um arquivo de ms2.msalign e um arquivo Feature. Os arquivos ms1.msalign e ms2.msalign contêm massas deconvoluted monoisotópico dos espectros MS1 e MS/MS, respectivamente. O arquivo Feature XML contém recursos de proteoform possível.
5. Realizar uma pesquisa de banco de dados com tombar (versão 1.1.3) em tombar suíte³⁰.
   1. No tombar GUI (toppic_gui.exe), clique no arquivo de banco de dados e selecione uma base de dados para pesquisa.
   2. Clique no arquivo de espectro e selecione o arquivo ms2.msalign gerado na etapa 5.4.1 como entrada. Selecione o arquivo de recurso MS1 e escolha o arquivo de Feature gerado na etapa 5.4.1.
   3. Conjunto carbamidomethylation de cisteína (C57) como uma modificação fixa devido ao tratamento IAA.
      Nota: Um arquivo de texto também pode ser criado com várias modificações fixas por um editor de texto. Em seguida, o arquivo de texto pode ser selecionado usando o botão de arquivo ao lado fixas modificações na GUI tombar.
   4. Selecione o recurso de banco de dados de engodo e, em configurações de corte, selecione FDR (taxa de falsa descoberta) no menu suspenso ao lado de nível do espectro. Defina o FDR para 0,01 no nível do espectro e 0,05 a nível proteoform.
      Nota: Tombar fornece várias opções para filtrar os resultados: nível de espectro FDR, FDR proteoform-nível ou ambos. O FDR é avaliada com base na abordagem de alvo-chamariz³¹.
   5. Deixe a função de gerar desmarcada e defina a tolerância de erro (ppm) para 15.
   6. Em Advanced Parameters, selecione 2 para o máximo número de deslocamentos em massa no menu drop-down. Definir a massa máxima shift (Da) das modificações desconhecidas para 500 promotor. deixar todos os outros parâmetros em seus valores padrão e clique no botão Iniciar no canto inferior direito da GUI.
      Nota: O software de tombar gera dois arquivos de texto resultantes. O arquivo com o sufixo. OUTPUT_TABLE contém a lista de jogos proteoform-espectro identificado (PrSMs) e um com um sufixo. FORM_OUTPUT_TABLE contém a lista de proteoforms identificados. Para cada PrSM, o software fornece informações gerais sobre o jogo, o padrão de fragmentação observada, íons de fragmento correspondente, e mudanças de massa detectada.

A Figura 1 mostra um diagrama do dinâmico baseados em pH-junção CZE-ESI-MS sistema usado no experimento. Uma longa ficha da amostra em um buffer de base é injetada uma LPA-revestido separação capilar preenchida com um ácido BGE. Após a aplicação de alta tensão I e II, os analitos na zona de amostra será concentrada através o método de junção de pH dinâmico. Para avaliar o desempenho do sistema CZE-MS, uma mistura de proteína padrão (citocromo c, lisozima, β-caseína, mioglobina, CA e BSA) normalmente é analisada. A representante electroferograma para a mistura de proteína padrão é mostrada na Figura 2. A mistura de proteína padrão normalmente é executada pelo menos em duplicado para avaliar a eficiência de separação e a reprodutibilidade do sistema. A eficiência de separação pode ser avaliada com o número de pratos teóricos de algumas proteínas, como mostrado na Figura 2B. A reprodutibilidade pode ser avaliada pelos desvios-padrão relativos de tempo de intensidade e migração de proteína. Figura 3 A mostra uma exibição de zoom-in de uma electroferograma da proteína Escherichia coli amostra analisada pela dinâmica baseados em pH-junção CZE-MS/MS. A intensidade de proteína nível normalizado (NL) deve estar na escala de 10⁸ se 1 µ g de proteínas de e. coli são carregados para a análise com um espectrômetro de massa quadrupolo íon trap. Zoom-in vista a electroferograma pode ser usada para avaliar a janela de separação do sistema. Neste caso, a janela de separação é de 80-90 min..B a Figura 3mostra um exemplo PrSM, incluindo a informação de proteoform geral correspondente sequência da proteína, padrão de fragmentação observada e modificações. O E-valor muito baixo (2.11E-48) e FDR espectral (0) sugerem a alta confiança do proteoform ID. O elevado número de íons de fragmento correspondente (60) mais indica a alta confiança do ID. O padrão de fragmentação observada mostra que a fragmentação do proteoform é altamente eficiente, cobrindo a termini e parte do proteoform meio. A clivagem do N-terminal de três aminoácidos (MTM) é determinada através da busca de banco de dados.

Figura 1 : Diagrama do sistema de dinâmicos baseados em pH-junção CZE-ESI-MS. A amostra é dissolvida em bicarbonato de amónio de 50 mM, pH 8. A BGE é 5% ou 10% (v/v) de ácido acético, pH ~2.4 ou ~ 2.2. Um capilar de LPA-revestido 1-m é usado para a separação. Uma interface de fluxo de bainha electro-cineticamente bombeado é usada para acoplar CZE-MS. Um espectrômetro de massa ion trap quadrupolo é usado. A alta voltagem eu (HV eu) é fornecida pela fonte de alimentação integrado o mostruário de CE para a separação. Alta tensão II (HV II) é fornecida por uma fonte de alimentação separada por electrospray. O espectrômetro de massa é castigo. A distância entre o orifício do emissor e a entrada do espectrômetro de massa é ~ 2 mm. A distância entre a extremidade do capilar gravado no emissor e o orifício do emissor é inferior a 500 µm. O tamanho do orifício do emissor electrospray é 20-40 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Dados de uma mistura de proteína padrão analisado pelo dinâmico baseados em pH-junção CZE-Sra. (A), este painel mostra uma pico base electroferograma. (B), este painel mostra o número de pratos teóricos (N) de três proteínas. O volume de injeção da amostra foi de 500 nL. HV 30 kV para separação e HV II foram 2,2 kV por electrospray. A BGE foi ácido acético a 5% (v/v), pH 2,4. A amostra foi de 50 mM de amônio bicarbonato (pH 8) e contém o citocromo c (0,01 mg/mL), lisozima (0,01 mg/mL), β-caseína (0,04 mg/mL), mioglobina (0,01 mg/mL), anidrase carbônica (CA, 0,05 mg/mL) e albumina de soro bovino (BSA, 0,1 mg/mL). Não há espectros de MS/MS foram adquiridos para a amostra de mistura de proteína padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Dados da e. coli proteomeanalyzed pelo dinâmico baseados em pH-junção CZE-MS/MS. Amostra de proteína (A), esta opinião mostra um zoom no painel a pico com base electroferograma da e. coli . (B) este painel mostra um exemplo que prsm identificado através da busca de banco de dados de tombar dos espectros de MS/MS adquiridas. As correspondente proteoform obter informações gerais, a sequência da proteína, observaram o padrão de fragmentação e apresentam-se modificações. Os íons de fragmento correspondente do PrSM individual também podem ser vistos, se necessário. Alta tensão 20 kV para separação e HV II foram 2,2 kV por electrospray. A BGE foi 10% (v/v) de ácido acético, pH ~ 2.2. A amostra foi de 50 mM de amônio bicarbonato (pH 8) e a concentração de proteína foi de 2 mg/mL. O volume de injeção da amostra foi de 500 nL. Um método DDA top8 foi usado para obter os dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para usar CZE-MS/MS para a caracterização de alta resolução de proteoforms em amostras da proteína simples e para a identificação em larga escala de proteoforms em amostras complexas proteome. Um diagrama do sistema CZE-ESI-MS/MS é mostrado na Figura 1. Existem quatro passos críticos no protocolo. Primeiro, a preparação do revestimento de alta qualidade LPA na parede interna da separação capilar é extremamente importante. Uma separação LPA-revestido capilar pode reduzir o EOF no capilar, ampliar a janela de separação de CZE e reduzir a absorção de proteína na sua parede interna¹⁹. A reação de polimerização para fazer o revestimento de LPA é realizada através do preenchimento capilar com uma mistura de acrilamida (monômero) e persulfato de amónio (iniciador de polimerização), seguido pelo aquecimento do capilar em um banho de água para acionar o reação de²². O tempo no banho de água é crítico. Um tempo muito curto de reação vai levar a uma reação incompleta e pobre do revestimento. Normalmente, permitimos a reação ao goup para 50 minutos, permitindo a reação proceder durante um período mais longo para um revestimento melhor. Com períodos mais longos de reação, o capilar pode tornar-se bloqueado e uma bomba de HPLC talvez precise ser usado para empurrar para fora o polímero dentro do capilar com água. Um LPA-revestido capilar pode ser usado continuamente por cerca de uma semana, com base em dados da literatura e nossa experiência de²².

O segundo passo fundamental é acoplamento CZE-MS com o fluxo de bainha electro-cineticamente bombeado CE-MS interface^25,26. A distância entre o fim da separação capilar no emissor ESI e o emissor do orifício afeta a sensibilidade do CZE-MS significativamente, e uma distância menor produz uma maior sensibilidade²⁵. O fim da separação capilar precisa ser entalhado com HF, para reduzir seu diâmetro exterior de 360 µm a menos de 100 µm, permitindo que o fim do capilar para ser empurrada perto do orifício do emissor. A distância entre o orifício do emissor e a entrada do espectrômetro de massa foi otimizada para alcançar a melhor sensibilidade e boa estabilidade²⁶. Normalmente mantemos a distância de cerca de 2 mm.

O terceiro passo crítico é o CZE-MS e MS/MS análise com o empilhamento dinâmico amostra on-line baseados em pH-junção¹⁹. O pH do tampão de amostra e a BGE precisa ser significativamente diferente para assegurar-se de amostra eficiente empilhamento. A concentração de proteína na amostra precisa ser adequado. Se a concentração de proteínas é muito alta, as proteínas podem ser precipitadas no capilar durante a amostra de empilhamento. As concentrações de proteína das amostras usadas para as figuras 2 e 3 podem ser consideradas como exemplos típicos. O último passo crítico é a busca de banco de dados com tombar para proteoform IDs³⁰. Várias etapas são necessárias para conversões de arquivo antes de que pode ser realizada a pesquisa de banco de dados com tombar. Um filtro FDR adequado é necessário para garantir a qualidade do proteoforms identificados. Normalmente usamos um 1% nível de espectro FDR para filtrar os resultados de pesquisa de banco de dados. Notamos que a iniciativa de proteômica de cima para baixo é um recurso muito bom para métodos de proteômica de cima para baixo e análise de dados software^32,33.

Temos de constatar que algumas partes do protocolo talvez precise ser modificado ligeiramente e um pouco de solução de problemas pode ser necessária. O tempo de polimerização, o banho de água para a preparação do revestimento LPA pode variar em diferentes laboratórios. O tempo para HF gravura da separação capilar pode precisar de ser ligeiramente modificado devido a uma temperatura diferente em diferentes laboratórios. Ao configurar a interface de CE-MS, certifique-se que de electrospray é estável antes de segmentação do capilar de separação para o emissor de electrospray. Se for observada nenhuma electrospray ou um electrospray instável, verificar a interface para certificar-se de que não há nenhum grande bolha no emissor, no Tou na tubagem que usados para conectar o frasco de tampão da bainha e o T. Além disso, a distância entre o orifício do emissor e a entrada do espectrômetro de massa pode afetar a estabilidade de electrospray e é geralmente cerca de 2 mm. A tensão de electrospray também pode influenciar a estabilidade do pulverizador. Para emissores de 20 a 40 µm, 2-2,2 kV é geralmente suficiente. Conforme descrito no parágrafo anterior, a concentração de proteína na amostra precisa ser adequado. Se a concentração de proteínas é muito alta, as proteínas podem ser precipitadas no capilar durante a amostra de empilhamento. Preste atenção para o perfil atual do computador de mostruário de CE. Se a corrente é zero no início da execução de CZE, significa que uma tomada de ar é injectada no capilar durante a etapa de injeção de amostra. Certifique-se que o volume da amostra no frasco é grande o suficiente. Se a corrente é normal no início e de repente se torna zero durante a execução, normalmente significa que a concentração de proteína é muito alta.

CZE-MS/MS, com base no presente protocolo permite a caracterização de alta resolução das amostras simples da proteína e a proteômica de cima para baixo em grande escala de proteomes complexo. Como exemplo, a MS CZE aproximou-se a caracterização de alta resolução de uma mistura de proteína padrão contendo seis proteínas¹⁹. Como mostrado na Figura 2, a MS CZE claramente separadas as seis proteínas com uma eficiência de separação de alta, revelou três formas de β-caseína e detectado muitas impurezas. Como outro exemplo, único tiro CZE-MS/MS reproducibly rendeu mais de 500 proteoform IDs e 190 IDs de proteína de proteome a Escherichia coli , usando apenas 1 µ g de proteínas de e. coli com um espectro-nível de 1% FDR¹⁹. A CZE-MS/MS melhorado o número de identificações de um proteome complexo pelo menos três vezes, comparadas com estudos anteriores de CZE-MS/MS de tiro a tiro de proteoform. Como mostrado na Figura 3, a CZE-MS/MS simultaneamente alcançou um volume de amostra-carregamento de 500-nL e uma janela de separação de 90 min para a análise da e. coli proteome¹⁹. O software de tombar pode fornecer informações abrangentes sobre os proteoforms identificados (Figura 3B). O sistema de CZE-MS/MS prevê Comunidade com uma ferramenta útil de proteomics proteômica de cima para baixo em grande escala e de alta resolução.

CZE-MS/MS ainda tem algumas limitações para proteômica profundo de cima para baixo. Apesar de demonstrar que o CZE-MS/MS pode chegar sobre IDs de 500proteoform partir do proteome de Escherichia coli em uma única corrida, o número de proteoform IDs do único tiro CZE-MS/MS só é aproximadamente 50% do que de estado-da-arte SBST-MS/MS^{34, 35}. Neste protocolo, apenas HCD é usado para fragmentação de proteínas, levando a coberturas de fragmentação limitada de proteoforms identificados. Várias melhorias podem ser feitas no protocolo CZE-MS/MS para melhorar o número e a qualidade do proteoform IDs do único tiro CZE-MS/MS. Em primeiro lugar, aumentar o comprimento da separação capilar deve fornecer uma janela mais ampla de separação, levando a mais proteoform IDs. Em segundo lugar, usando um espectrômetro de massa com um poder de resolução muito maior, mais rápido digitalizar taxa e vários métodos de fragmentação (por exemplo, HCD, dissociação de transferência de elétrons³⁶ [ETD],³⁷ e ultravioleta photodissociation [UVPD]³⁸ ) certamente irá melhorar tanto o número de proteoform IDs e as coberturas de fragmentação de proteoforms identificados.

Os autores não têm nada para divulgar.

Os autores agradecer o grupo de Heedeok Hong departamento de química, Universidade Estadual de Michigan, para gentilmente fornecer as células de Escherichia coli para os experimentos. Os autores agradecer o apoio do Instituto Nacional de General Medical Ciências, os institutos nacionais de saúde (NIH) através do Grant R01GM118470 (para X. Liu) e Grant R01GM125991 (a L. sol e X. Liu).