JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

Резюме

Здесь представлен протокол расследовать раннего воздействия амилоид β (значения) в головном мозге. Это показывает, что значения индуцирует Клатрин опосредованный эндоцитоз и распада аксональное роста шишки. Протокол является полезным при изучении раннего воздействия значения на конусы роста axonal и может способствовать предотвращению болезни Альцгеймера.

Аннотация

Амилоид β (значения) вызывает расстройства памяти в Альцгеймера (AD). Хотя терапии было показано, уменьшить значения уровней в мозгах пациентов AD, они не улучшают функции памяти. Поскольку значения агрегатов в головном мозге до появления нарушениями памяти, ориентации значения может быть неэффективным для лечения больных ад, которые уже проявляют дефицита памяти. Таким образом ниже по течению сигналов из-за значения осаждения должен быть заблокирован до развития AD. Значения индуцирует аксональной дегенерации, ведущие к срыву нейрональных сетей и нарушениями памяти. Хотя существует множество исследований о механизмах значения токсичности, источник значения токсичности остается неизвестным. Чтобы помочь определить источник, мы предлагаем новый протокол, использующий микроскопии, Гене transfection и живой клетки, imaging для исследовать ранние изменения, вызванные значения в конусы роста axonal культивировали нейронов. Этот протокол показало, что значения индуцированной Клатрин опосредованный эндоцитоз в аксональное роста шишки следуют краха конус роста, демонстрируя, что ингибирование эндоцитоза предотвращает значения токсичности. Этот протокол будет полезным при изучении ранних эффектов значения и может привести к более эффективной и профилактическое лечение AD.

Введение

Амилоид β (значения) месторождений находятся в мозге пациентов с болезнью Альцгеймера (AD) и считаются критическим причиной AD1 , нарушить нейрональных сетей, приводит к памяти нарушениями2,,34. Многие клинические наркотиков кандидатов было показано эффективно предотвращать производство амилоид β (значения) или удалить значения месторождений. Однако никто не преуспели в улучшение функции памяти в AD пациентов5. Значения уже сдали на хранение в головном мозге до начала расстройства памяти6; Таким образом уменьшение значения уровней в мозгах пациентов выставке нарушениями памяти могут оказаться неэффективными. Значения осаждения присутствует в доклинической AD больных; Однако эти пациенты редко представляют с нейронной дегенерации и памяти дефицита6. Существует временной лаг между значения осаждения и нарушениями памяти. Таким образом критически важной стратегией для предотвращения AD блокирует значения токсичности, сигнализации на ранних этапах AD, до развития дефицита памяти. Значения осаждения индуцирует аксона дегенерации7,8,9,10,11,12,13, которые могут привести к нарушению Нейронные сети и постоянное нарушение функции памяти. Многие исследования изучили механизмы значения токсичности; к примеру выродились аксоны AD мышей мозг показали увеличились autophagy14. Кальциневрина активации было сообщено как возможный механизм значения индуцированной аксональной дегенерации15; Однако прямой триггера аксональной дегенерации остается неизвестным.

Это исследование фокусируется на крах аксональное окончаний под названием конусы роста. Крах конусы аксональное роста может быть вызвана аксональное роста репелленты, например Семафорин 3A и Эфрины A516,,1718,19,20. Крах как дистрофические аксональное окончаний наблюдались в мозги AD пациентов21,22. Кроме того отказ функционирования конус роста может спровоцировать аксональной дегенерации23. Однако это неизвестно ли значения индуцирует рост конуса краха. Таким образом это исследование представляет Роман протокола соблюдать раннего воздействия значения в культивированный нейронов и исследовать значения индуцированной роста конуса краха.

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами для ухода и использования лабораторных животных на Sugitani кампусе университета Тояма и были утверждены Комитетом для животных ухода и использования лабораторных животных на Sugitani кампусе Университет Тояма (A2014INM-1, A2017INM-1).

1. крах Assay

  1. Поли-D-лизин покрытие
    1. Покройте 8-Ну культуры слайды с 400 мкл 5 мкг/мл поли D-Лизин (PDL) фосфат амортизированное saline (PBS) и инкубировать их при 37 ° C на ночь.
    2. Удаление решения PDL и Промыть лунки 3 раза с дистиллированной водой.
  2. Нейрон культуры24
    1. Фарш свежевыделенных коре головного мозга от эмбриональных день 14 (E14) ddY мышей с microscissors в среде культуры нейрон, содержащих сыворотки лошадь 12%, 0,6% глюкозы и 2 мм L-глютамин (средний A). Не добавляйте антибиотики.
      Примечание: В настоящем Протоколе, используется ddY мышь. Это штамм беспородных, широко используется в Японии. Этот протокол культуры нейрон может применяться также для крыс корковых нейронов7,25.
    2. Центрифуга тканей в 87 g x 3 мин.
    3. Удалите супернатант. Затем в Пелле, добавить 2 мл 0,05% трипсина и Инкубируйте 15 мин при температуре 37° C. Перемешать путем выстукивать каждые 5 мин.
    4. Добавьте 4 мл средний A и перемешать путем выстукивать.
    5. Центрифуга тканей в 178 g x 3 мин.
    6. Удалить супернатант и инкубировать тканей с 600 ед/мл DNase I и 0,3 мг/мл соевого ингибитор трипсина, растворенных в PBS 15 мин при температуре 37 ° C. Перемешать путем выстукивать каждые 5 мин.
    7. После инкубации добавьте 4 мл средний A и перемешать путем выстукивать.
    8. Центрифуга тканей в 178 g x 3 мин.
    9. После удаления супернатанта, добавить 4 мл среды A и нарезанных тканей с полированной пипетка Пастера.
    10. Фильтр порошкового тканей с сеткой размер пор 70 мкм. После фильтрации Вычислите плотность клеток с Горяева.
    11. Культура клетки в культуре 8-Ну слайд на 0,8 x 104 клетки/колодец с среднего A и поддерживать их в CO2 инкубатор с атмосферой увлажненные 10% CO2 при 37 ° C.
    12. После 4 ч культивирования замените питательной среды для одной содержащий дополнения 2% нейронов культуры, 0,6% глюкозы и 2 мм L-глютамин (средний B).
      Примечание: Чистоту нейронов был примерно на 75%, как было описано ранее26.
  3. Крах пробирного27
    1. Распустить коммерчески получил полноформатный амилоида β1-42 (Aβ1-42 в дистиллированной воде в концентрации 0,5 мм) и инкубировать при 37 ° C в течение 7 дней. После инкубации Храните агрегированных раствор Aβ1-42 в морозильной камере-30 ° C до использования.
      Примечание: Этот инкубации необходим для агрегирования и токсичность Aβ27,28,29,30.
    2. После 4 дней культуры нейронов, лечить скважин с 100 мкл новых средних B, содержащий 0,5 мкм статистическое решение (дистиллированная вода) Aβ1-42 или транспортного средства, за 1 ч.
      Примечание: Эффекты Aβ1-42 были доза зависим увеличилось от 0,1 до 5 мкм и достиг пика на 0,5 мкм, как описано ранее27. Аналогичные результаты можно наблюдать при Aβ1-42 лечения за 1 ч после 3 дней культуры нейрональных31.
    3. Удалите средство культуры и немедленно исправить нейроны с параформальдегида 4%, содержащий 4% сахарозы в ФБР за 1 ч при 37 ° C на горячей плите.
    4. После фиксации мыть нейронов 3 раза с PBS и смонтировать их с носителем водный монтажа. Сухой монтаж среднего на 4 ° C для 2-4 дней.
    5. Захват всей территории (7,8 х 9 мм2) каждой скважины с 20 X сухого объектива на инвертированным микроскопом.
    6. Классифицировать длинный невритов каждый нейрон в стадии 3 или 4, аксоны, как описано в32,33.
    7. Классифицировать конусы роста согласно следующим критериям: 1) аксональное роста конусов не хватает lamellipodia или 2), обладающие менее трех filopodia считаются рухнула конусы роста, как описано ранее,17.
      Примечание: Конусы здорового роста оцениваются как 0 точки; конусы рухнул роста оцениваются как 1 очко. Означать крах, которые рассчитываются баллы для каждого лечения.

2. амилоида β иммуноокрашивания

  1. Культура мыши корковых нейронов для 3 дней, как описано в шаге 1.2.
  2. Лечения с агрегированных Aβ1-42 (5 мкм) или автомобиль для 4 ч при 37 ° C в инкубатор CO2 .
  3. Без удаления средство, добавить равное количество параформальдегида 4%, содержащий 4% сахарозы в ФБР для каждой скважины и поддерживать культуру при 37 ° C на горячей плите на 5 мин.
  4. Решение заменить 400 мкл параформальдегида 4%, содержащий 4% сахарозы в ФБР и поддерживать при 37 ° C на горячей плите за 1 час. Этот протокол фиксации был изменен с предыдущего доклада34.
  5. Вымойте нейронов 3 раза с PBS.
  6. Блок с 5% нормальной козьего сыворотки в PBS.
  7. Инкубируйте нейронов с мыши анти амилоид β иммуноглобулина G (IgG) (1:50) и 1% альбумина bovine сыворотки в PBS на 4 ° C на ночь.
  8. Вымойте нейронов 3 раза с PBS.
  9. Инкубируйте нейронов с вторичное антитело проспряганное флуоресцирования (1: 400) и 1% альбумина bovine сыворотки в PBS при комнатной температуре в течение 2 ч.
  10. Вымойте нейронов 3 раза с PBS и смонтировать их с носителем водный монтажа.
  11. Фотосъемка флуоресценции и светлые области изображения с косой освещения с помощью 40 X сухого объектива на инвертированным микроскопом б.

3. аксональное иммуноокрашивания27

  1. Мыть нейронов 3 раза с PBS после фиксации искусственного нейрона, как описано в шаге 1.3.3.
  2. Инкубировать нейронов с мыши анти-tau-1 IgG (1: 500), кролик анти микротрубочек связанный протеин 2 (MAP2) (1: 500) IgG в сыворотке нормальный коза 5% и 0,3% t- octylphenoxypoly-этоксиэтанол в PBS на 4 ° C на ночь.
  3. Вымойте нейронов 3 раза с PBS.
  4. Инкубируйте нейронов с флуоресцентным конъюгированных вторичные антитела (1: 400) и 0,3% t- octylphenoxypolyethoxyethanol в PBS при комнатной температуре в течение 2 ч.
  5. Вымойте нейронов 3 раза с PBS и смонтировать с помощью среды водный монтажа.
  6. Захватить флуоресценции и дифференциальных изображения контрастность (DIC) вмешательства с помощью 20 × сухого объектива на инвертированным микроскопом а.

4. живой клетки изображений27

  1. Пальто, блюд на основе стекла с 500 мкл PDL (5 мкг/мл), как описано в шаге 1.1.1.
    Примечание: В настоящем Протоколе, были использованы на стеклянной основе блюда домашнего приготовления. Коммерчески доступных блюд на основе стекла может также использоваться для живых изображений. Домашние блюда на стеклянной основе были подготовлены следующим: 1) сделать отверстие около 1,4 мм в диаметре в центре 35-мм блюдо с удар рукой и 2) прикрепить стекло coverslip (диаметр 22 мм) к задней части блюдо с силиконом.
  2. Мыть тарелки с дистиллированной водой, как описано в шаге 1.1.2 и культура корковых нейронов в блюдо на основе стекла на 3 х 104 клетки/блюдо с средних A, как описано в шаге 1.2.
  3. После 4 дней культуры клеток, заменить средний 2 мл новой среды B и передачи блюдо инвертированный микроскоп поддерживать A. культуры в атмосфере увлажненные 10% CO2 при 37 ° C.

5. эндоцитоза эксперимент

  1. Культура мыши корковых нейронов, как описано в шаге 1.2.
  2. Четыре дня спустя, замените средний 100 мкл новой среды B, содержащий 20 мкм флуоресценции зонда мембраны за 1 мин.
  3. Добавьте 1 мкл 0,05 мм агрегированных Aβ1-42 (окончательный 0,5 мкм) или решения транспортного средства (дистиллированная вода) и микс, закупорить. Проинкубируйте втечение 20 мин.
  4. Удаление среды и Промыть лунки дважды с средний B, которая была подогретым до 37 ° C.
  5. Исправить, вымыть и смонтировать нейронов, как описано в шагах 1.3.3 и 1.3.4.
  6. Захват люминесцентных и DIC изображений с 63 X нефти объектива на а инвертированным микроскопом.
  7. Определить плотность области флуоресценции зонда позитивных мембраны в каждый конус здорового роста, используя образ программного обеспечения.

6. Гене Transfection

  1. Подготовьте корковых нейронов, как описано в шаге 1.2. После завершения шагов 1.2.1 для 1.2.10, центрифуга нейронов в 178 g x 3 мин.
  2. Удалить супернатант, добавить 4 мл Ca2 +-бесплатно и мг2 +-бесплатно Hanks сбалансированного солевого раствора (CMF-HBSS) и смешивать, закупорить.
  3. Центрифуга клетки на 178 g x 3 мин.
  4. Удалить супернатант, добавить 4 мл CMF-HBSS и смешивать, закупорить. Далее вычислить плотность ячеек, как описано в шаге 1.2.10.
  5. Передача 5 х 106 клеток 1,5 мл трубки и центрифуги в 1677 x g за 1 мин.
  6. Удалить супернатант, добавить 100 мкл раствора трансфекции с дополнением и 3 мкг плазмидной ДНК кодирования EGFP или EGFP-AP180 C-terminus и смешивать, закупорить.
  7. Передавать заверенные кювет выше решение (шаг 6.6) и transfect с electroporator, по словам производителя протокол.
  8. Сразу же после трансфекции добавить 500 мкл средних A в кювет и передать решение 1,5 мл с сертифицированным пипетки. Далее вычислить плотность ячеек, как описано в шаге 1.2.10.
  9. Культура клетки в культуре 8-Ну слайд на 0,8 x 104 клетки/хорошо, как описано в шагах 1.2.11 и 1.2.12.
  10. После 4 дней культуры клеток выполняют крах пробирного, как описано в шаге 1.3.

Результаты

В этом протоколе Aβ1-42 был инкубировали при 37 ° C для 7 дней перед использованием, потому что инкубации Aβ1-42 необходима для производства токсичных форм27,28,30,35. После этого инкубации агрегированной формы значения наблюдались (рис. 1A). Сообщается, что аналогичные инкубации Aβ1-42 производится фибриллярных форме значения36. После лечения с этой агрегированных Aβ1-42 иммуноокрашивания с антитело для токсичных олигомера значения35,37 была выполнена, и положительный пятнать был обнаружен на искусственный нейронов (рис. 1B). Учитывая вышесказанное этот протокол Инкубационная производит токсичных формы значения.

Несколько дней были необходимые для индукции аксональной дегенерации после значения экспозиции. События до аксональной дегенерации остаются неясными. Таким образом этот протокол был разработан для более глубокого понимания механизмов. Используя этот протокол, ранние явления, вызванные значения лечения были проанализированы. Корковых нейронов были культивировали в течение 4 дней. Длинная невритов в культивированный нейроны были определены как аксоны; они были подтверждены положительные иммуноокрашивания аксональное маркер, Тау-1, и отрицательные иммуноокрашивания дендритных маркера, MAP2 (рис. 2). После 1 h транспортного средства лечения конусы роста распространения lamellipodia и обрабатываются несколько filopodia. Эти линии были определены как конусы здорового роста. И наоборот 1 h Aβ1-42 лечения привело к усохшие роста шишки, которые разработаны не lamellipodia или filopodia. Эти линии были определены как свернутые роста шишки. Крах баллы были рассчитаны, как описано в шаге 1.3.7. Когда формы конусы роста были неясными, они были исключены из анализа. Aβ1-42 лечения привело к значительному увеличению распада оценка, соответствующий увеличить аксональное роста крах, когда по сравнению с распада оценка транспортного средства лечение роста шишки27.

Конусы аксональное роста наблюдались до и после лечения с Aβ1-42 (рис. 3). Клетки были сохранены в инвертированным микроскопом с атмосферой увлажненные 10% CO2 при 37 ° C. Изображения были захвачены каждые 5 мин. Как показано на рисунке 3, конусы роста рухнула между 21 и 26 мин после лечения Aβ1-42. Конусы роста были исключены из живых клеток изображений, если они не сохранить их здоровыми форму за 1 ч до какого-либо лечения.

Для визуализации раннего воздействия Aβ1-42-лечения, эндоцитоза был использован как в центре внимания этого анализа, потому что эндоцитоза ингибиторов может блокировать Aβ1-42-индуцированной роста конус крах27. Эндоцитоза был визуализирован с зондом мембраны флуоресценции (т.е.., Люминесцентную краску, которая связывает мембраны плазмы и спонтанно endocytosed). Предыдущие исследования показали, что конусы роста не разрушаются в 20 мин после Aβ1-42-лечения27; Таким образом конусы здорового роста были отобраны DIC изображений в транспортное средство или Aβ1-42-обработанные клетки после 20 мин. После Aβ1-42-лечение многочисленных флуоресцентных мембраны зонд позитивных puncta наблюдались в конус роста (рис. 4). Плотность флуоресценции мембраны датчика позитивных puncta в конусы роста был значительно увеличили27. Это позволяет предположить, что эндоцитоза конус Aβ1-42-индуцированной рост происходит до краха.

Для подтверждения роли эндоцитоза, плазмида ДНК кодирования EGFP-AP180 C-terminus был transfected в культивированный корковых нейронов. Клетки, выражая AP180 C-конечная избирательно ингибирует Клатрин опосредованный эндоцитоз38,39. Если выражение EGFP наблюдалось в клетки тела в нейронах, AP180 C-конечная считался выражаться на конус роста axonal нейрона. Transfection AP180 C-конечная заблокирован Aβ1-42-индуцированной роста конуса коллапс (рис. 5)27.

figure-results-4676
Рисунок 1 : Инкубация A Β1-42 агрегатов Aβ. (A) Aβ1-42 растворяют в дистиллированной воде в концентрации 0,5 мм и инкубировали при 37 ° C в течение 7 дней (после инкубации) или температуре-30 ° C без инкубации (не инкубации). Для каждого значения решения был разбавляют до 0,1 мм; затем 10 мкл каждого разбавленного раствора упали на стеклянных вставках и покрыты coverslips. Брайт поле изображения с косой освещения были захвачены с помощью инвертированного микроскопа B. шкалы бар = 20 мкм. (B) агрегированных Aβ1-42 или транспортного средства лечения на искусственный нейронов для 4 ч. После лечения, были исправлены нейронов и immunostained для токсичных значения олигомеров. Флуоресценции изображений (красный) и светлые области изображения с косой освещения (серый) отображаются. Шкалы бар = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-5907
Рисунок 2 : A Β1-42-индуцированной аксональное роста конуса крах. После Aβ1-42 - или транспортное средство лечение, были исправлены нейронов и immunostained Тау-1 (красный) и микротрубочек связанный протеин 2 (MAP2, зеленый). Флуоресценции и дифференциальных вмешательства контраст (DIC) изображения отображаются. Увеличенный вид областей интереса (ROI, прямоугольники) показаны ниже их соответствующие изображения. Белые бары масштаб = 50 мкм; чёрные полосы масштаб = 10 мкм. Эта цифра была изменена с Кубояма et al, 201527. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-6848
Рисунок 3 : Live визуализации ячейки до и после A Лечение β1-42. После 4 дней культуры клетки были переданы инвертированным микроскопом и были захвачены DIC изображения каждые 5 минут покадровой изображения отображаются. Цифры представляют минут: секунд после применения агрегированных Aβ1-42 (конечная концентрация, 0,5 мкм). Шкалы бар = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-7569
Рисунок 4 : Двадцать минут A Β1-42 лечения индуцированных эндоцитоза. Корковых нейронов были культивировали в течение 4 дней и относились с флуоресценции зонда мембраны. Затем нейроны рассматривались на 20 мин с Aβ1-42 или транспортного средства. Показываются изображения флуоресценции конусы роста. Желтые пунктирные линии представляют контуры конусы роста. Шкалы бар = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-8322
Рисунок 5 : Выражение AP180-C конечной блоков Aβ1-42-индуцированной коллапса. Через четыре дня после трансфекции EGFP (A, B) или EGFP-AP180 C-конечная (C, D); Aβ1-42 (B, D) или транспортного средства (A, C) был добавлен в корковых нейронов, за 1 ч. ОПК (верхняя панели) и флуоресценции (нижней панели) изображения отображаются. Стрелки указывают на конусы роста. Масштаб баров = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Наблюдение ранних явлений в конусы аксональное роста после лечения Aβ1-42 включен протокол, описанные в данном исследовании. Aβ1-42 индуцированной эндоцитоза в конусы аксональное роста в течение 20 мин, и крах конус роста наблюдалось в течение 1 ч лечения. Этот эндоцитоза вероятно опосредовано Клатрин. Используя этот протокол, для предотвращения краха конус Aβ1-42-индуцированной роста и аксональной дегенерации в культивированный нейронов27было подтверждено ингибирование Клатрин опосредованный эндоцитоз. Кроме того ингибирование Клатрин опосредованный эндоцитоз ослабленного Aβ1-42-индуцированной аксональной дегенерации и памяти дефицита в vivo27. Эти результаты показывают, что Клатрин опосредованный эндоцитоз является перспективным направлением терапевтических профилактики AD.

Этот протокол был разработан от краха анализов для роста axonal репелленты, например Семафорин 3A и Эфрины A516,,1718,19,20. Крах анализов были использованы в исследованиях, оценке развития нейронных сетей. Показали, что этот протокол может применяться к патологических анализа, особенно с участием механизмов объявления; Однако ограничение может быть, что примерно 40% роста шишки рухнула в здоровом состоянии. Этот процент выше, чем результаты от искусственный корень спинной ганглий нейронов, которые более широко используются в крах анализов16,,1718,19,20. Таким образом различия в типах клеток могут быть связаны с различиями в соотношениях крах. Крах соотношения, в этом исследовании согласуются с найденными в предыдущих исследованиях с нормальной культивировали корковых нейронов40,41. Кроме того Aβ1-42 индуцированной аналогичные уровни распада конус роста по сравнению с другими факторами, коллапс, например Семафорин 3A и Эфрины A527. Таким образом этот Протокол действителен для количественной оценки Aβ1-42-индуцированной роста конуса краха. Этот протокол фиксации имеет важное значение для поддержания формы конусы роста. Если клетки условно были исправлены с параформальдегида 4% при комнатной температуре, больше роста шишки могут рухнули из-за фиксации процедуры (данные не показаны). Кроме того буферы глютаральдегид и фиксации доступны для жесткой фиксации, как описано выше42; Однако глютаральдегид exhibits аутофлюоресценция, который является значительным препятствием для флуоресценции воображения.

Недавнее исследование с такой же протокол показал, что водный экстракт из корня Polygalae (корни Истод узколистный) ингибирует Aβ1-42-индуцированной эндоцитоза культивировали нейронов, помешали аксональной дегенерации и сокращение дефицита памяти в Трансгенные мыши модель рекламных31. Роман кандидатом для предотвращения объявление было обнаружено с настоящим Протоколом. Сочетание Гене transfection и живой клетки изображений в этом протоколе может показать другие сотовой события, найденных в аксонов и их терминалы до и после лечения значения, такие как Ca2 + изображений, микротрубочки динамики и динамика адгезии клеток, который по сообщениям, касающимся аксональное роста43,,4445. Этот протокол может помочь выявить более подробные механизмы значения токсичности и может помочь привести к предупреждению и/или лечения AD.

Раскрытие информации

Автор не имеет ничего, чтобы раскрыть.

Благодарности

Эта работа частично поддерживается научно-исследовательских грантов от JSP-страницы (KAKENHI 18K 07389), Япония, Такэда научный фонд, Японии и Кобаяси фармацевтическая Co. Ltd., Япония.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
ddY miceSLC
Eight-well culture slideFalcon354108
poly D lysineWako168-19041
Culture medium, Neurobasal mediumGibco21103-049
house serumGibco26050-088
glucoseWako049-31165
L-glutamineWako074-00522
0.05% trypsinGibco25300-054
DNase IWorthingtonDP
soybean trypsin inhibitorGibco17075-029
Filter with 70 µm mesh size, cell strainerFalcon352350
B-27 supplementGibco17504-044
CO2 incubatorAstecSCA-165DS
Amyloid β1-42Sigma-AldrichA9810
paraformaldehydeWako162-16065
sucrose Wako196-00015
Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mountpolysciences18606-20
Inverted microscope ACarl ZeissAxio Observer Z1 Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1
Objective Plan-Apochromat 20xCarl Zeiss420650-9901
Objective Plan-Apochromat 63xCarl Zeiss440762-9904
Objective, CFI Plan Apo Lambda 40XNikon
anti-MAP2 IgGAbcamab32454
anti-tau-1 IgGChemiconMAB3420
anti-amyloid β antibodyIBL10379clone 11A1
normal goat serumWako143-06561
bovine serum albuminWako010-25783
t-octylphenoxypolyethoxyethanolWako169-21105
goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594InvitrogenA11032
goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488InvitrogenA11029
hot plateNISSINNHP-M30N
cover glassFisher Scientific12-545-85
35 mm dishIWAKI1000-035
Silicone RTVShin-EtsuKE42T
hand punchRoper WhitneyNo. XX
Fluorescence membrane probe, FM1-43FXInvitrogenF35355
Ca2+- and Mg2+-free Hanks' balanced salt solutionGibco14175-095
Transfection solution, Nucleofector solutionLonzaVPG-1001
Electroporator, Nucleofector IAmaxa
Inverted microscope BKeyenceBZ-X710
Image software, ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/

Ссылки

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8 (6), 595-608 (2016).
  2. Dickson, T. C., Vickers, J. C. The morphological phenotype of beta-amyloid plaques and associated neuritic changes in Alzheimer's disease. Neuroscience. 105 (1), 99-107 (2001).
  3. Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
  4. Perl, D. P. Neuropathology of Alzheimer's disease. Mount Sinai Journal of Medicine. 77 (1), 32-42 (2010).
  5. Graham, W. V., Bonito-Oliva, A., Sakmar, T. P. Update on Alzheimer's Disease Therapy and Prevention Strategies. Annual Review of Medicine. 68, 413-430 (2017).
  6. Jack, C. R. Jr, et al. Hypothetical model of dynamic biomarkers of the Alzheimer's pathological cascade. Lancet Neurology. 9 (1), 119-128 (2010).
  7. Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Neuritic regeneration and synaptic reconstruction induced by withanolide A. British Journal of Pharmacology. 144 (7), 961-971 (2005).
  8. Tohda, C., Urano, T., Umezaki, M., Nemere, I., Kuboyama, T. Diosgenin is an exogenous activator of 1,25D3-MARRS/Pdia3/ERp57 and improves Alzheimer's disease pathologies in 5XFAD mice. Scientific Reports. 2, 535(2012).
  9. Jawhar, S., Trawicka, A., Jenneckens, C., Bayer, T. A., Wirths, O. Motor deficits, neuron loss, and reduced anxiety coinciding with axonal degeneration and intraneuronal Abeta aggregation in the 5XFAD mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 33 (1), e129-e140 (2012).
  10. Postuma, R. B., et al. Substrate-bound beta-amyloid peptides inhibit cell adhesion and neurite outgrowth in primary neuronal cultures. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1122-1130 (2000).
  11. Tohda, C., Nakada, R., Urano, T., Okonogi, A., Kuboyama, T. Kamikihi-to (KKT) rescues axonal and synaptic degeneration associated with memory impairment in a mouse model of Alzheimer's disease, 5XFAD. International Journal of Neuroscience. 121 (12), 641-648 (2011).
  12. Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature Neuroscience. 7 (11), 1181-1183 (2004).
  13. Wirths, O., Weis, J., Kayed, R., Saido, T. C., Bayer, T. A. Age-dependent axonal degeneration in an Alzheimer mouse model. Neurobiology of Aging. 28 (11), 1689-1699 (2007).
  14. Sanchez-Varo, R., et al. Abnormal accumulation of autophagic vesicles correlates with axonal and synaptic pathology in young Alzheimer's mice hippocampus. Acta Neuropathologica. 123 (1), 53-70 (2012).
  15. Wu, H. Y., et al. Amyloid beta induces the morphological neurodegenerative triad of spine loss, dendritic simplification, and neuritic dystrophies through calcineurin activation. Journal of Neuroscience. 30 (7), 2636-2649 (2010).
  16. Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32 (6), 1013-1026 (2001).
  17. Jurney, W. M., Gallo, G., Letourneau, P. C., McLoon, S. C. Rac1-mediated endocytosis during ephrin-A2- and semaphorin 3A-induced growth cone collapse. Journal of Neuroscience. 22 (14), 6019-6028 (2002).
  18. Luo, Y., Raible, D., Raper, J. A. Collapsin: a protein in brain that induces the collapse and paralysis of neuronal growth cones. Cell. 75 (2), 217-227 (1993).
  19. Nicol, X., Muzerelle, A., Rio, J. P., Metin, C., Gaspar, P. Requirement of adenylate cyclase 1 for the ephrin-A5-dependent retraction of exuberant retinal axons. Journal of Neuroscience. 26 (3), 862-872 (2006).
  20. Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436 (7053), 1020-1024 (2005).
  21. Benes, F. M., Farol, P. A., Majocha, R. E., Marotta, C. A., Bird, E. D. Evidence for axonal loss in regions occupied by senile plaques in Alzheimer cortex. Neuroscience. 42 (3), 651-660 (1991).
  22. Masliah, E., et al. An antibody against phosphorylated neurofilaments identifies a subset of damaged association axons in Alzheimer's disease. American Journal of Pathology. 142 (3), 871-882 (1993).
  23. Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 361 (1473), 1575-1592 (2006).
  24. Teshigawara, K., et al. A novel compound, denosomin, ameliorates spinal cord injury via axonal growth associated with astrocyte-secreted vimentin. British Journal of Pharmacology. 168 (4), 903-919 (2013).
  25. Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Withanoside IV and its active metabolite, sominone, attenuate A beta(25-35)-induced neurodegeneration. European Journal of Neuroscience. 23 (6), 1417-1426 (2006).
  26. Tanabe, N., Kuboyama, T., Tohda, C. Matrine Directly Activates Extracellular Heat Shock Protein 90, Resulting in Axonal Growth and Functional Recovery in Spinal Cord Injured-Mice. Frontiers in Pharmacology. 9 (446), (2018).
  27. Kuboyama, T., Lee, Y. A., Nishiko, H., Tohda, C. Inhibition of clathrin-mediated endocytosis prevents amyloid beta-induced axonal damage. Neurobiology of Aging. 36 (5), 1808-1819 (2015).
  28. Pike, C. J., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. In vitro aging of beta-amyloid protein causes peptide aggregation and neurotoxicity. Brain Research. 563 (1-2), 311-314 (1991).
  29. Uchida, N., et al. Yokukansan inhibits social isolation-induced aggression and methamphetamine-induced hyperlocomotion in rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 32 (3), 372-375 (2009).
  30. Pike, C. J., Burdick, D., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. Neurodegeneration induced by beta-amyloid peptides in vitro: the role of peptide assembly state. Journal of Neuroscience. 13 (4), 1676-1687 (1993).
  31. Kuboyama, T., Hirotsu, K., Arai, T., Yamasaki, H., Tohda, C. Polygalae Radix Extract Prevents Axonal Degeneration and Memory Deficits in a Transgenic Mouse Model of Alzheimer's Disease. Frontiers in Pharmacology. 8, 805(2017).
  32. Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
  33. Arimura, N., Kaibuchi, K. Neuronal polarity: from extracellular signals to intracellular mechanisms. Nature Reviews: Neuroscience. 8 (3), 194-205 (2007).
  34. De Felice, F. G., et al. Alzheimer's disease-type neuronal tau hyperphosphorylation induced by A beta oligomers. Neurobiology of Aging. 29 (9), 1334-1347 (2008).
  35. Izuo, N., et al. Toxicity in Rat Primary Neurons through the Cellular Oxidative Stress Induced by the Turn Formation at Positions 22 and 23 of Aβ42. ACS Chemical Neuroscience. 3 (9), 674-681 (2012).
  36. Fujiwara, H., et al. Uncaria rhynchophylla, a Chinese medicinal herb, has potent antiaggregation effects on Alzheimer's beta-amyloid proteins. Journal of Neuroscience Research. 84 (2), 427-433 (2006).
  37. Murakami, K., et al. Monoclonal antibody against the turn of the 42-residue amyloid beta-protein at positions 22 and 23. ACS Chemical Neuroscience. 1 (11), 747-756 (2010).
  38. Ford, M. G., et al. Simultaneous binding of PtdIns(4,5)P2 and clathrin by AP180 in the nucleation of clathrin lattices on membranes. Science. 291 (5506), 1051-1055 (2001).
  39. Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66 (3), 370-377 (2010).
  40. Ahmed, G., et al. Draxin inhibits axonal outgrowth through the netrin receptor DCC. Journal of Neuroscience. 31 (39), 14018-14023 (2011).
  41. Brennaman, L. H., Moss, M. L., Maness, P. F. EphrinA/EphA-induced ectodomain shedding of neural cell adhesion molecule regulates growth cone repulsion through ADAM10 metalloprotease. Journal of Neurochemistry. 128 (2), 267-279 (2014).
  42. Tojima, T., et al. Attractive axon guidance involves asymmetric membrane transport and exocytosis in the growth cone. Nature Neuroscience. 10 (1), 58-66 (2007).
  43. Ooashi, N., Futatsugi, A., Yoshihara, F., Mikoshiba, K., Kamiguchi, H. Cell adhesion molecules regulate Ca2+-mediated steering of growth cones via cyclic AMP and ryanodine receptor type 3. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1159-1167 (2005).
  44. Biswas, S., Kalil, K. The Microtubule-Associated Protein Tau Mediates the Organization of Microtubules and Their Dynamic Exploration of Actin-Rich Lamellipodia and Filopodia of Cortical Growth Cones. Journal of Neuroscience. 38 (2), 291-307 (2018).
  45. Kuboyama, T., et al. Paxillin phosphorylation counteracts proteoglycan-mediated inhibition of axon regeneration. Experimental Neurology. 248, 157-169 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

140

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

ISSN 1940-087X

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены

Мы используем файлы cookie для улучшения качества работы на нашем веб-сайте.

Продолжая пользоваться нашим веб-сайтом или нажимая кнопку «Продолжить», вы соглашаетесь принять наши файлы cookie.

Подробнее