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기사 소개

요약

여기 아 밀 로이드 β (Aβ)는 뇌에서의 초기 효과 조사 하기 위해 프로토콜 제공 됩니다. 이것은 clathrin 중재 된 endocytosis 및 axonal 성장 콘의 붕괴 유도 하는 Aβ 보여준다. 프로토콜 axonal 성장 콘에 Aβ의 초기 효과 공부에 유용 하 고 알 츠 하이 머 병의 예방을 촉진 수 있습니다.

초록

아 밀 로이드 β (Aβ)는 Alzheimer의 질병 (광고)에 메모리 장애를 발생합니다. 치료제 광고 환자의 두뇌에서 Aβ 수준을 줄이기 위해 표시 되었습니다, 비록 이러한 메모리 기능을 향상 되지 않습니다. Aβ 메모리 손상의 모양 전에 뇌에 집계, 이후 Aβ를 대상으로 수 있습니다 이미 메모리 적자 전시 광고 환자 치료에 대 한 효율적. 따라서, Aβ 증 착으로 인해 다운스트림 신호 광고 개발 하기 전에 차단 합니다. Aβ 신경 네트워크 및 메모리 손상의 방해로 이어지는 axonal 변성을 유도 합니다. Aβ 독성의 기계 장치에 많은 연구 들이 있더라도, Aβ 독성의 소스를 알 수 없는 남아 있습니다. 소스를 식별 하려면 우리는 현미경 검사 법, 유전자 transfection, 라이브 셀 이미징 교양된 뉴런의 axonal 성장 콘에 Aβ에 의해 발생 하는 초기 변화를 조사 하기 위해 사용 하는 새로운 프로토콜을 제안 합니다. 이 프로토콜은 Aβ 억제 endocytosis의 Aβ 독성을 방지 시연 clathrin 중재 된 endocytosis axonal 성장 콘 성장 콘 붕괴 뒤에 유도 밝혔다. 이 프로토콜은 Aβ의 초기 효과 공부에 도움이 될 것입니다 하 고 보다 효율적이 고 예방 광고 치료로 이어질 수 있습니다.

서문

아 밀 로이드 β (Aβ) 예금 Alzheimer의 질병 (광고) 환자의 뇌에서 발견 되 고 메모리 장애2,,34로 이어지는 광고1 신경 네트워크를 방해 하는의 중요 한 원인으로 간주 됩니다. 많은 임상 약물 후보 아 밀 로이드 β (Aβ) 생산을 효과적으로 방지 또는 Aβ 예금을 제거 표시 되었습니다. 그러나, 아무도 AD 환자5에 메모리 기능을 개선에 성공 했다. Aβ는 메모리 장애6;의 발병 전에 뇌에 이미 입금 됩니다. 따라서, 환자의 두뇌에서 Aβ 수준 감소 전시 메모리 장애 수 있습니다 효과. Aβ 증 착은 전 임상 광고 환자; 그러나, 이러한 환자는 거의 신경 변성 및 메모리 적자6제시. Aβ 증 착 및 메모리 장애 사이의 지연 시간입니다. 따라서, 광고의 예방을 위한 중요 한 전략 광고, 이전에 메모리 적자의 개발의 초기 단계 동안 신호 Aβ 독성을 차단 합니다. Aβ 착 유도 축 삭 변성7,,89,10,11,12,13의 중단으로 이어질 수 있는 신경 네트워크 그리고 메모리 기능의 영구 장애입니다. 많은 연구 조사 Aβ 독성;의 메커니즘 예를 들어 광고 쥐 두뇌의 퇴 화 한 축 삭 autophagy14증가 표시 되었습니다. Calcineurin 활성화 Aβ 유도 axonal 변성15;의 가능한 메커니즘으로 보고 되었습니다. 그러나, 직접 트리거 axonal 변성의 알 수 없는 남아 있습니다.

이 연구는 성장 원뿔 이라고 axonal 엔딩의 붕괴에 초점을 맞추고. Axonal 성장 콘의 붕괴 semaphorin 3A와 ephrin A516,17,18,,1920같은 axonal 성장 방수 제에 의해 발생할 수 있습니다. 축소 같은 dystrophic axonal 엔딩 광고 환자21,22의 두뇌에서 관찰 되었습니다. 또한, 성장 콘 기능 실패 axonal 변성23을 자극 수 있습니다. 그러나, 그것 아니다 알려진 Aβ 성장 콘 붕괴를 유도 하는 여부. 따라서,이 연구는 교양된 신경에 있는 Aβ의 초기 효과 관찰 하 고 Aβ 유도 성장 콘 붕괴를 조사 하는 새로운 프로토콜을 선물 한다.

프로토콜

모든 실험 관심과 도야마 대학 스기타 캠퍼스에서 실험 동물의 사용에 대 한 지침에 따라 실시 했다 및 동물 관리 및 사용의 실험실 동물의 스기타 캠퍼스에 대 한 위원회에 의해 승인 된 대학교의 도야마 (A2014INM-1, A2017INM-1).

1. 붕괴 분석 결과

  1. 폴 리-D-리 코팅
    1. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)에 5 μ g/mL 폴 리-D-라이 신 (PDL)의 400 μ와 8 잘 문화 슬라이드 코트 하 고 37 ° C에서 밤새 그들을 품 어.
    2. PDL 솔루션을 제거 하 고 세척 3 번 증류수와 우물.
  2. 신경 문화24
    1. 신경 문화 매체 12% 말 혈 청, 포도 당 0.6%, 그리고 2 mM L-글루타민 (중형 A) microscissors와 배아 하루 14 (E14) ddY 쥐에서 갓 고립된 대뇌 외피가 말하다. 항생제를 추가 하지 마십시오.
      참고:이 프로토콜 ddY 마우스 사용 됩니다. 이것은 일본에서 일반적으로 사용 되는 outbred 긴장 이다. 이 신경 세포 문화 프로토콜 쥐 대뇌 피 질의 뉴런7,25도 적용할 수 있습니다.
    2. 3 분 87 x g에서 조직 원심
    3. 제거는 상쾌한. 다음은 펠 릿 0.05 %trypsin 2 개 mL를 추가 고 37 ° c.에 15 분 동안 품 어 매 5 분을 활용 하 여 혼합.
    4. 활용 하 여 매체와 혼합의 4 mL를 추가 합니다.
    5. 178 x g 3 분에 조직 원심
    6. 상쾌한, 제거 하 고 품 어 어 0.3 mg/mL 콩 트립 신 억제 물에에서 녹아 있는 PBS 37 ° c.에 15 분 동안 600 U/mL DNase와 조직 매 5 분을 활용 하 여 혼합.
    7. 부 화, 후 두 드려서 중간 A와 섞어 4 mL를 추가 합니다.
    8. 178 x g 3 분에 조직 원심
    9. 제거한 후에 상쾌한, 매체 A의 4 mL를 추가 하 고 세련 된 파스퇴르 피 펫과 조직 triturate.
    10. 70 µ m 기 공 크기 메쉬 triturated 조직 필터링. 여과 후 한 hemocytometer 셀의 밀도 계산 합니다.
    11. 문화 8 잘 문화에서 셀 104 셀/잘 매체 A와 x 0.8에 슬라이드 하 고 37 ° c.에 10% CO2 의 습도 분위기와 CO2 배양 기에서 그들을 유지 하는 것
    12. 후 경작의 4 h, 0.6% 포도 당, 신경 문화와 2 mM L-글루타민 (매체 B)에 대 한 포함 한 2% 보충으로 문화 매체를 교체 합니다.
      참고: 뉴런의 순수성은 약 75%,26위에서 설명한 대로.
  3. 붕괴 분석 결과27
    1. 상업적으로 얻은 전장 녹말 체 β1-42 (Aβ1-42) 0.5 m m의 농도에서 증류수에 녹이 고 7 일 동안 37 ° C에서 품 어. 부 화 후 사용까지 사용-30 ° C 냉동 고에서 집계 된 Aβ1-42 솔루션을 저장 합니다.
      참고:이 외피는 집계 및 Aβ27,,2829,30의 독성에 필요 합니다.
    2. 신경 문화 4 일 새로운 매체 B의 100 μ와 우물, 치료 후 1 시간에 대 한 Aβ1-42 또는 차량 솔루션 (증류수) 집계 0.5 μ M를 포함.
      참고: Aβ1-42의 효과 했다 복용량 의존 5 μ M, 0.1에서 증가 하 고 앞에서 설명한270.5 μ M에서 정점. Aβ1-42 신경 문화31의 3 일 후 1 시간에 대 한 치료에 의해 때 비슷한 결과 관찰할 수 있습니다.
    3. 문화 매체를 제거 하 고 즉시 뜨거운 접시에 37 ° C에서 1 시간에 대 한 PBS에 4% 자당을 포함 하는 4 %paraformaldehyde 뉴런을 수정.
    4. 고정, 후 PBS로 3 회 신경 세척 하 고 수성 설치 매체와 함께 탑재. 2-4 일 동안 4 ° C에서 설치 매체를 건조.
    5. 각에 거꾸로 한 현미경 20 X 건조 목적 렌즈의 전체 지역을 (7.8 x 9 m m2)를 캡처하십시오.
    6. 앞에서 설명한32,33단계 3 또는 4로 축 삭, 각 뉴런의 긴 neurites를 분류 합니다.
    7. 다음 기준에 따라 성장 콘 분류: 1) axonal 성장 콘 lamellipodia 부족 또는 2) 3 filopodia를 가진 것으로 간주 됩니다 축소 성장 콘,17설명한 대로.
      참고: 건강 한 성장 콘; 0 점으로 득점 하 축소 된 성장 콘 1 점으로 득점 된다. 각 치료에 대 한 점수 계산 하는 붕괴를 의미 합니다.

2. 아 밀 로이드 β Immunostaining

  1. 1.2 단계에서 설명한 대로 3 일 동안 마우스 대뇌 피 질의 뉴런을 문화.
  2. 집계 된 Aβ1-42와 치료 (5 μ M) 또는 CO2 배양 기에서 37 ° C에서 4 h에 대 한 차량.
  3. 매체를 제거 하지 않고 4 %paraformaldehyde 포함 하는 각 음에 PBS에 4% 자당의 동일한 볼륨을 추가 하 고 5 분 동안 뜨거운 접시에 37 ° C에서 문화를 유지.
  4. PBS에 4% 자당을 포함 하는 4 %paraformaldehyde 400 μ와 솔루션을 교체 하 고 1 시간에 대 한 핫 플레이트에 37 ° C에서 유지. 이 기정 프로토콜 이전 보고서34에서 수정 되었습니다.
  5. 3 회 PBS 가진 뉴런을 씻어.
  6. PBS에서 5% 정상 염소 혈 청으로 차단 합니다.
  7. 마우스 방지 아 밀 로이드 β 면역 글로불린 G와 뉴런 (IgG) (1:50) 및 1% 소 혈 청 알 부 민 PBS에 4 ° C에서 밤새 품 어.
  8. 3 회 PBS 가진 뉴런을 씻어.
  9. 형광 활용 된 이차 항 체 (1:400)와 1% 소 혈 청 알 부 민 PBS에서 2 h에 대 한 실 온에서 뉴런을 품 어.
  10. 3 회 PBS 가진 뉴런을 세척 하 고 수성 설치 매체와 함께 탑재.
  11. 거꾸로 현미경 B.에 40 X 건조 대물 렌즈를 사용 하 여 형광 이미지와 간접 조명으로 밝은 필드 이미지 캡처

3. axonal Immunostaining27

  1. 1.3.3 단계에서 설명한 대로 교양된 신경 고정 후 PBS로 3 회 신경을 씻어.
  2. 마우스 반대로 tau-1 뉴런을 품 어 IgG (1: 500), 토끼 방지 microtubule 관련된 단백질 2 (MAP2) 5% 정상 염소 혈 청, 그리고 0.3 %t -octylphenoxypoly-ethoxyethanol PBS에 4 ° c 하룻밤에 IgG (1: 500).
  3. 3 회 PBS 가진 뉴런을 씻어.
  4. 형광 활용 된 이차 항 체 (1:400)와 0.3 %t -octylphenoxypolyethoxyethanol PBS에 2 h에 대 한 실 온에서 뉴런을 품 어.
  5. 3 회와 함께 PBS, 뉴런을 세척 하 고 수성 설치 매체를 사용 하 여 탑재.
  6. 거꾸로 현미경 대답에 20 × 건조 대물 렌즈를 사용 하 여 형광 및 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 이미지를 캡처

4. 라이브 셀 이미징27

  1. PDL의 500 μ와 함께 요리를 유리 코트 (5 μ g/mL), 1.1.1 단계에서 설명한 대로.
    참고:이 프로토콜에서 수 제 유리 기반 요리 사용 되었다. 상업적으로 이용 가능한 유리 기반 요리 또한 라이브 이미징에 대 한 사용할 수 있습니다. 수 제 유리 기반 요리 다음과 같이 준비 되었다: 1) 35 m m 접시의 중앙에 지름에서 약 1.4 m m 구멍을 만들어 손 펀치, 고 2) 실리콘 접시의 뒷면에 유리 coverslip (22 m m의 직경) 첨부.
  2. 1.1.2, 단계에서 설명한 대로 증류수를 가진 격판덮개를 세척 하 고 3 x 104 셀/접시 1.2 단계에서 설명한 대로 중간 A에서 유리 접시에 대뇌 피 질의 뉴런 문화.
  3. 세포 배양의 4 일의 새로운 매체 B, 2 mL와 전송 매체 대체 후 접시에 거꾸로 현미경 A. 유지 37 ° c.에 10% CO2 의 습도 분위기에서 문화

5. endocytosis 실험

  1. 1.2 단계에 설명 된 대로 마우스 대뇌 피 질의 뉴런을 문화.
  2. 4 일 후, 새로운 매체 1 분 20 μ M 형광 막 프로브를 포함 하는 B의 100 μ 매체를 바꿉니다.
  3. Pipetting으로 1 μ 0.05 m m 집계 Aβ1-42 (마지막 0.5 μ M) 또는 차량 (증류수) 솔루션 및 믹스를 추가 합니다. 20 분 동안 품 어.
  4. 매체를 제거 하 고 세척 매체 B 37 ° c에 미리 데워 되었습니다와 두 번 웰 스
  5. 해결 하 고 세척, 1.3.3, 1.3.4 단계에 설명 된 대로 뉴런을 탑재.
  6. 형광 및 거꾸로 한 현미경 대답에 오일 렌즈 X 63 DIC 이미지 캡처
  7. 이미지 소프트웨어를 사용 하 여 각 건강 한 성장 콘에 형광 막 프로브-긍정적인 영역의 밀도 계량.

6. 유전자 Transfection

  1. 1.2 단계에서 설명한 대뇌 피 질의 뉴런을 준비 합니다. 1.2.1 1.2.10 단계를 완료 한 후 3 분 동안 178 x g에서 뉴런 원심.
  2. 제거는 상쾌한, 캘리포니아2 +의 4 개 mL를 추가-무료 및 Mg2 +-행 크 스 균형된 소금물 (HBSS CMF), 자유롭고 pipetting으로 혼합.
  3. 178 x g 3 분에 셀 원심
  4. 제거는 상쾌한 CMF HBSS 4 mL를 추가 하 고 pipetting으로 혼합. 1.2.10 단계에서 설명한 대로 다음 셀 밀도 계산 합니다.
  5. 1.5 mL 튜브를 1 분 동안 1,677 x g에서 원심 분리기 5 x 106 셀을 전송 합니다.
  6. 제거는 상쾌한 보충과 transfection 솔루션의 100 μ와 인코딩 EGFP 또는 EGFP AP180 C-말단, DNA 플라스 미드의 3 μ g을 추가 하 고 pipetting으로 혼합.
  7. 인증된 베트를 위의 솔루션 (단계 6.6)를 전송 및 제조업체의 프로토콜에 따라 transfect는 electroporator와 함께.
  8. Transfection, 직후에 멧 매체 A의 500 μ를 추가 하 고 솔루션 인증된 피펫은 1.5 mL 튜브에 전송. 1.2.10 단계에서 설명한 대로 다음 셀 밀도 계산 합니다.
  9. 1.2.11 및 1.2.12 단계에 설명 된 대로 잘/104 셀, x 0.8에서 8 잘 문화 슬라이드에 세포 문화.
  10. 1.3 단계에서 설명한 대로 세포 배양의 4 일 후 붕괴 분석 결과 수행 합니다.

결과

이 프로토콜에서 Aβ1-42는 incubated 37 ° C에서 사용 하기 전에 7 일 동안 부 화 Aβ1-42의 독성 형태27,28,,3035생산 필요 했다 때문에. 이 부 화 후 Aβ의 집계 된 형태 (그림 1A)를 관찰 했다. Aβ1-42의 비슷한 인큐베이션 fibril 형태 Aβ36의 생산으로 보고 되었습니다. 치료 후이 집계 Aβ1-42와 함께, immunostaining Aβ,3537 의 유독한 올리고 머에 대 한 항 체와 함께 수행한, 그리고 교양된 뉴런 (그림 1B)에서 발견 되었습니다 긍정적인 얼룩. 위의 고려이 인큐베이션 프로토콜 Aβ의 독성 형태를 생성합니다.

몇 일 Aβ 노출 후 axonal 변성의 유도 필요 했다. Axonal 변성 이전 이벤트 불분명 남아 있습니다. 따라서,이 프로토콜 관련된 메커니즘을 더욱 이해 하 개발 되었습니다. 이 프로토콜을 사용 하 여, Aβ 처리에 의해 유도 된 초기 현상 분석 되었다. 대뇌 피 질의 뉴런은 4 일에 대 한 교양 했다. 교양된 신경에 있는 가장 긴 neurites axons;로 확인 된 이러한 axonal 마커, 타우-1, 그리고 MAP2 수지상 표식에 대 한 부정적인 immunostaining에 대 한 긍정적인 immunostaining에 의해 확인 되었다 (그림 2). 차량 치료의 1 시간 후 성장 콘 lamellipodia 확산 하 고 여러 filopodia를 처리 했다. 이러한 건강 한 성장 콘으로 확인 되었다. 반대로, Aβ1-42 치료의 1 시간 줄어든된 성장 콘, lamellipodia 또는 filopodia 개발 이끌어 냈다. 이러한 축소 된 성장 콘으로 확인 되었다. 1.3.7 단계에서 설명한 대로 축소 점수 계산 했다. 성장 콘의 명확 했다, 그들은 분석에서 제거 되었습니다. Aβ1-42 치료 해당 차량 취급 성장 콘27의 붕괴 점수에 비해 axonal 성장 붕괴를 증가 하는 붕괴 점수에 상당한 증가를 이끌었다.

Aβ1-42 (그림 3) 치료 전후 axonal 성장 콘 관찰 되었다. 37 ° c.에 10% CO2 의 습도 분위기와 거꾸로 한 현미경에서 세포 유지 이미지 마다 5 분을 점령 했다. 그림 3에서 보듯이 성장 콘 Aβ1-42 치료 후 21과 26 분 사이 붕괴. 성장 콘 라이브 셀 이미징 그들이 사전에 어떤 치료 1 시간에 대 한 그들의 건강 한 모양을 유지 하지 않은 경우에서 제외 했다.

Aβ1-42-치료의 초기 효과 시각화 하려면 endocytosis endocytosis 억제제 Aβ1-42-유도 된 성장 콘 붕괴27를 차단할 수 있습니다 때문에이 분석의 초점으로 사용 되었다. 형광 막 프로브 endocytosis 가시화 했다 (즉,., 플라즈마 세포 막에는 자연스럽 게 endocytosed 형광 염료). 이전 연구는 성장 콘 붕괴 하지 20 분 Aβ1-42-치료27; 후 나타났다 따라서, 건강 한 성장 콘 DIC 이미징에 차량 또는 Aβ1-42-대우 셀 20 분 후 선정 됐다. Aβ1-42-치료, 다음 수많은 형광 막 프로브-긍정적인 puncta 성장 콘 (그림 4)에서 관찰 되었다. 성장 콘에 형광 막 프로브-긍정적인 puncta의 밀도 크게 증가27이었다. 이 그 Aβ1-42-유도 된 성장 콘 endocytosis 붕괴 이전 발생 합니다 제안 합니다.

확인 하려면 endocytosis의 역할, EGFP AP180 C-말단 인코딩 DNA 플라스 미드 교양된 대뇌 피 질의 뉴런으로 페 했다. 선택적으로 AP180 C-말단을 표현 하는 세포 억제 clathrin 중재 된 endocytosis38,39. EGFP 식 신경 셀 시체에서 관찰 되었다, AP180 C-말단 신경의 axonal 성장 콘에 표현 될 고려 되었다. AP180 C-말단의 transfection 차단 Aβ1-42-유도 된 성장 콘 붕괴 (그림 5)27.

figure-results-2873
그림 1 : A의 부 화 Β1-42 집계 Aβ. (A) Aβ1-42 0.5 m m의 농도에서 증류수에 용 해 하 고 (후에 부 화), 7 일 동안 37 ° C에서 incubated 또는 보육 (보육) 없이-30 ° C에 저장. 각 Aβ 솔루션은 0.1 m m; 희석 다음, 각 희석된 솔루션의 10 μ 유리 슬라이드에 삭제 되었고 coverslips로 덮여. 간접 조명으로 밝은 필드 이미지는 거꾸로 한 현미경 B. 규모를 사용 하 여 캡처된 바 = 20 μ m. (B) Aβ1-42 집계 또는 차량 치료 4 h에 대 한 교양된 신경에. 신경 치료, 다음 고정 및 독성 Aβ 올리고에 대 한 immunostained. 형광 이미지 (레드) 고 밝은 필드 이미지 간접 조명 (회색)으로 표시 됩니다. 눈금 막대 20 μ m =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-3664
그림 2 : A Β1-42-유도 axonal 성장 콘 붕괴. 후 Aβ1-42-또는 차량-치료, 신경 고정 및 타우-1 (빨강) 및 microtubule immunostained 단백질 2 (MAP2, 녹색). 형광 및 차동 간섭 콘트라스트 (DIC) 이미지 표시 됩니다. 관심 (ROI, 사각형)의 영역의 확대 보기는 그들의 해당 이미지 아래 표시 됩니다. 스케일 바 화이트 = 50 μ m; 스케일 바 블랙 = 10 μ m. 이 그림에서 Kuboyama 외, 201527수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-4312
그림 3 : 라이브 셀 이미징 A 전후 Β1-42 치료. 문화의 4 일 후 세포는 거꾸로 한 현미경 전송 및 DIC 이미지 캡처된 모든 5 분 경과 이미지 표시 됩니다. 숫자 집계 Aβ1-42 (최종 농도, 0.5 μ M)의 신청 후 분: 초를 나타냅니다. 눈금 막대 = 10 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-4805
그림 4 : A의 20 분 Β1-42 치료 유도 endocytosis. 대뇌 피 질의 뉴런 교양 4 일 되었고 형광 막 프로브로 치료. 다음, 신경 Aβ1-42 또는 차량으로 20 분 동안 치료를 받았다. 성장 콘의 형광 이미지 표시 됩니다. 노란색 점선을 성장 콘의 아웃 라인을 나타냅니다. 눈금 막대 = 10 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

figure-results-5318
그림 5 : AP180 C terminus의 식 블록 Aβ1-42-유도 붕괴. 4 일 후 transfection EGFP (A, B) 또는 EGFP AP180 C-말단 (C, D); Aβ1-42 (B, D) 또는 (A, C) 차량 1 h. DIC (위 패널)에 대 한 대뇌 피 질의 뉴런에 추가 되었습니다 하 고 형광 (하단 패널) 이미지가 표시 됩니다. 화살표는 성장 콘을 나타냅니다. 스케일 바 = 10 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

이 연구에서 설명 하는 프로토콜 Aβ1-42 치료 후 axonal 성장 콘에 초기 현상의 관찰을 사용할 수 있습니다. Aβ1-42 유도 axonal 성장 콘 20 분 이내에 endocytosis 그리고 성장 콘 축소 치료의 1 시간 이내에 관찰 되었다. 이 endocytosis clathrin에 의해 아마 중재 했다. 이 프로토콜을 사용 하 여 억제 clathrin 중재 된 endocytosis의 Aβ1-42-유도 된 성장 콘 붕괴와 교양된 신경27axonal 변성을 방지 하기 위해 확인 되었다. 또한, clathrin 중재 된 endocytosis의 저해 감쇠 axonal 변성 Aβ1-42-유도 및 메모리 적자 vivo에서27. 이러한 결과 clathrin 중재 된 endocytosis 광고 방지를 위한 유망 치료 애비뉴 나타냅니다.

이 프로토콜 개발 되었다에서 축소 3A와 ephrin A516,17,,1819,20semaphorin 같은 axonal 성장 방수 제에 대 한 분석. 붕괴 분석 연구 평가 하는 신경 네트워크의 개발에에서 사용 되었습니다. 내가이 프로토콜 광고;의 메커니즘을 포함 하는 특히 그 병 적인 분석에 적용할 수 있는 그림 그러나, 제한 성장 콘의 약 40%는 건강 한 상태에서 축소 수 있습니다. 이 비율에서 더 일반적으로 사용 되는 교양된 지 루트 ganglion 신경에서 결과 분석16,,1718,,1920축소 보다 높은 수준 이다. 따라서, 셀 형식에 차이가 축소 비율에 차이 연결 될 수 있습니다. 이 연구에서 발견 축소 비율 일반 교양된 대뇌 피 질의 뉴런40,41와 이전 연구에서 발견 된 일치 했다. 또한, Aβ1-42의 성장 콘 3A와 ephrin A527semaphorin 같은 다른 붕괴 요소와 비교할 때 비슷한 수준 유도. 따라서,이 프로토콜은 Aβ1-42-유도 된 성장 콘 붕괴의 정량화에 적합. 이 기정 프로토콜은 성장 콘의 모양을 유지 해야 합니다. 경우 셀 통상 실 온에서 4 %paraformaldehyde 고정 했다, 더 많은 성장 콘 고정 절차 (데이터 표시 되지 않음)으로 인해 붕괴 수 있습니다. 또는,도 및 고정 버퍼 앞에서 설명한42; 단단한 고정을 위해 사용할 수 있습니다. 그러나,도 형광 이미징에 대 한 중요 한 장애물이 autofluorescence, 전시 한다.

동일한 프로토콜 최근 공부 했다 기 수 Polygalae ( Polygala tenuifolia의 뿌리)에서 물 추출 교양된 뉴런에 endocytosis Aβ1-42-유도 저해 axonal 변성 방지 및 메모리 적자 감소는 유전자 변형 마우스 모델 광고31의입니다. 광고 방지를 위한 새로운 후보자가이 프로토콜 발견 되었습니다. 유전자 transfection 및 라이브 셀 이미징이 프로토콜에서의 조합 캘리포니아2 + 영상, microtubule 역학, 세포 접착 역학, 등 Aβ 치료 전후 축 삭 및 그들의 터미널에서 발견 다른 셀룰러 이벤트를 표시할 수 있습니다는 보도 관련된 axonal 성장43,,4445입니다. 이 프로토콜 Aβ 독성의 자세한 메커니즘을 밝힐 수 있고 광고의 치료 및 예방으로 이어질 도움이 될 수 있습니다.

공개

저자는 공개 상관이 있다.

감사의 말

이 작품은 부분적으로 JSP에서 연구 보조금 지원 (KAKENHI 18 K 07389), 일본, 다케다 과학 재단, 일본, 그리고 고바야시 제약, 일본.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
ddY miceSLC
Eight-well culture slideFalcon354108
poly D lysineWako168-19041
Culture medium, Neurobasal mediumGibco21103-049
house serumGibco26050-088
glucoseWako049-31165
L-glutamineWako074-00522
0.05% trypsinGibco25300-054
DNase IWorthingtonDP
soybean trypsin inhibitorGibco17075-029
Filter with 70 µm mesh size, cell strainerFalcon352350
B-27 supplementGibco17504-044
CO2 incubatorAstecSCA-165DS
Amyloid β1-42Sigma-AldrichA9810
paraformaldehydeWako162-16065
sucrose Wako196-00015
Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mountpolysciences18606-20
Inverted microscope ACarl ZeissAxio Observer Z1 Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1
Objective Plan-Apochromat 20xCarl Zeiss420650-9901
Objective Plan-Apochromat 63xCarl Zeiss440762-9904
Objective, CFI Plan Apo Lambda 40XNikon
anti-MAP2 IgGAbcamab32454
anti-tau-1 IgGChemiconMAB3420
anti-amyloid β antibodyIBL10379clone 11A1
normal goat serumWako143-06561
bovine serum albuminWako010-25783
t-octylphenoxypolyethoxyethanolWako169-21105
goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594InvitrogenA11032
goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488InvitrogenA11029
hot plateNISSINNHP-M30N
cover glassFisher Scientific12-545-85
35 mm dishIWAKI1000-035
Silicone RTVShin-EtsuKE42T
hand punchRoper WhitneyNo. XX
Fluorescence membrane probe, FM1-43FXInvitrogenF35355
Ca2+- and Mg2+-free Hanks' balanced salt solutionGibco14175-095
Transfection solution, Nucleofector solutionLonzaVPG-1001
Electroporator, Nucleofector IAmaxa
Inverted microscope BKeyenceBZ-X710
Image software, ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/

참고문헌

  1. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8 (6), 595-608 (2016).
  2. Dickson, T. C., Vickers, J. C. The morphological phenotype of beta-amyloid plaques and associated neuritic changes in Alzheimer's disease. Neuroscience. 105 (1), 99-107 (2001).
  3. Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
  4. Perl, D. P. Neuropathology of Alzheimer's disease. Mount Sinai Journal of Medicine. 77 (1), 32-42 (2010).
  5. Graham, W. V., Bonito-Oliva, A., Sakmar, T. P. Update on Alzheimer's Disease Therapy and Prevention Strategies. Annual Review of Medicine. 68, 413-430 (2017).
  6. Jack, C. R. Jr, et al. Hypothetical model of dynamic biomarkers of the Alzheimer's pathological cascade. Lancet Neurology. 9 (1), 119-128 (2010).
  7. Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Neuritic regeneration and synaptic reconstruction induced by withanolide A. British Journal of Pharmacology. 144 (7), 961-971 (2005).
  8. Tohda, C., Urano, T., Umezaki, M., Nemere, I., Kuboyama, T. Diosgenin is an exogenous activator of 1,25D3-MARRS/Pdia3/ERp57 and improves Alzheimer's disease pathologies in 5XFAD mice. Scientific Reports. 2, 535(2012).
  9. Jawhar, S., Trawicka, A., Jenneckens, C., Bayer, T. A., Wirths, O. Motor deficits, neuron loss, and reduced anxiety coinciding with axonal degeneration and intraneuronal Abeta aggregation in the 5XFAD mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 33 (1), e129-e140 (2012).
  10. Postuma, R. B., et al. Substrate-bound beta-amyloid peptides inhibit cell adhesion and neurite outgrowth in primary neuronal cultures. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1122-1130 (2000).
  11. Tohda, C., Nakada, R., Urano, T., Okonogi, A., Kuboyama, T. Kamikihi-to (KKT) rescues axonal and synaptic degeneration associated with memory impairment in a mouse model of Alzheimer's disease, 5XFAD. International Journal of Neuroscience. 121 (12), 641-648 (2011).
  12. Tsai, J., Grutzendler, J., Duff, K., Gan, W. B. Fibrillar amyloid deposition leads to local synaptic abnormalities and breakage of neuronal branches. Nature Neuroscience. 7 (11), 1181-1183 (2004).
  13. Wirths, O., Weis, J., Kayed, R., Saido, T. C., Bayer, T. A. Age-dependent axonal degeneration in an Alzheimer mouse model. Neurobiology of Aging. 28 (11), 1689-1699 (2007).
  14. Sanchez-Varo, R., et al. Abnormal accumulation of autophagic vesicles correlates with axonal and synaptic pathology in young Alzheimer's mice hippocampus. Acta Neuropathologica. 123 (1), 53-70 (2012).
  15. Wu, H. Y., et al. Amyloid beta induces the morphological neurodegenerative triad of spine loss, dendritic simplification, and neuritic dystrophies through calcineurin activation. Journal of Neuroscience. 30 (7), 2636-2649 (2010).
  16. Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32 (6), 1013-1026 (2001).
  17. Jurney, W. M., Gallo, G., Letourneau, P. C., McLoon, S. C. Rac1-mediated endocytosis during ephrin-A2- and semaphorin 3A-induced growth cone collapse. Journal of Neuroscience. 22 (14), 6019-6028 (2002).
  18. Luo, Y., Raible, D., Raper, J. A. Collapsin: a protein in brain that induces the collapse and paralysis of neuronal growth cones. Cell. 75 (2), 217-227 (1993).
  19. Nicol, X., Muzerelle, A., Rio, J. P., Metin, C., Gaspar, P. Requirement of adenylate cyclase 1 for the ephrin-A5-dependent retraction of exuberant retinal axons. Journal of Neuroscience. 26 (3), 862-872 (2006).
  20. Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436 (7053), 1020-1024 (2005).
  21. Benes, F. M., Farol, P. A., Majocha, R. E., Marotta, C. A., Bird, E. D. Evidence for axonal loss in regions occupied by senile plaques in Alzheimer cortex. Neuroscience. 42 (3), 651-660 (1991).
  22. Masliah, E., et al. An antibody against phosphorylated neurofilaments identifies a subset of damaged association axons in Alzheimer's disease. American Journal of Pathology. 142 (3), 871-882 (1993).
  23. Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 361 (1473), 1575-1592 (2006).
  24. Teshigawara, K., et al. A novel compound, denosomin, ameliorates spinal cord injury via axonal growth associated with astrocyte-secreted vimentin. British Journal of Pharmacology. 168 (4), 903-919 (2013).
  25. Kuboyama, T., Tohda, C., Komatsu, K. Withanoside IV and its active metabolite, sominone, attenuate A beta(25-35)-induced neurodegeneration. European Journal of Neuroscience. 23 (6), 1417-1426 (2006).
  26. Tanabe, N., Kuboyama, T., Tohda, C. Matrine Directly Activates Extracellular Heat Shock Protein 90, Resulting in Axonal Growth and Functional Recovery in Spinal Cord Injured-Mice. Frontiers in Pharmacology. 9 (446), (2018).
  27. Kuboyama, T., Lee, Y. A., Nishiko, H., Tohda, C. Inhibition of clathrin-mediated endocytosis prevents amyloid beta-induced axonal damage. Neurobiology of Aging. 36 (5), 1808-1819 (2015).
  28. Pike, C. J., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. In vitro aging of beta-amyloid protein causes peptide aggregation and neurotoxicity. Brain Research. 563 (1-2), 311-314 (1991).
  29. Uchida, N., et al. Yokukansan inhibits social isolation-induced aggression and methamphetamine-induced hyperlocomotion in rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 32 (3), 372-375 (2009).
  30. Pike, C. J., Burdick, D., Walencewicz, A. J., Glabe, C. G., Cotman, C. W. Neurodegeneration induced by beta-amyloid peptides in vitro: the role of peptide assembly state. Journal of Neuroscience. 13 (4), 1676-1687 (1993).
  31. Kuboyama, T., Hirotsu, K., Arai, T., Yamasaki, H., Tohda, C. Polygalae Radix Extract Prevents Axonal Degeneration and Memory Deficits in a Transgenic Mouse Model of Alzheimer's Disease. Frontiers in Pharmacology. 8, 805(2017).
  32. Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. Journal of Neuroscience. 8 (4), 1454-1468 (1988).
  33. Arimura, N., Kaibuchi, K. Neuronal polarity: from extracellular signals to intracellular mechanisms. Nature Reviews: Neuroscience. 8 (3), 194-205 (2007).
  34. De Felice, F. G., et al. Alzheimer's disease-type neuronal tau hyperphosphorylation induced by A beta oligomers. Neurobiology of Aging. 29 (9), 1334-1347 (2008).
  35. Izuo, N., et al. Toxicity in Rat Primary Neurons through the Cellular Oxidative Stress Induced by the Turn Formation at Positions 22 and 23 of Aβ42. ACS Chemical Neuroscience. 3 (9), 674-681 (2012).
  36. Fujiwara, H., et al. Uncaria rhynchophylla, a Chinese medicinal herb, has potent antiaggregation effects on Alzheimer's beta-amyloid proteins. Journal of Neuroscience Research. 84 (2), 427-433 (2006).
  37. Murakami, K., et al. Monoclonal antibody against the turn of the 42-residue amyloid beta-protein at positions 22 and 23. ACS Chemical Neuroscience. 1 (11), 747-756 (2010).
  38. Ford, M. G., et al. Simultaneous binding of PtdIns(4,5)P2 and clathrin by AP180 in the nucleation of clathrin lattices on membranes. Science. 291 (5506), 1051-1055 (2001).
  39. Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66 (3), 370-377 (2010).
  40. Ahmed, G., et al. Draxin inhibits axonal outgrowth through the netrin receptor DCC. Journal of Neuroscience. 31 (39), 14018-14023 (2011).
  41. Brennaman, L. H., Moss, M. L., Maness, P. F. EphrinA/EphA-induced ectodomain shedding of neural cell adhesion molecule regulates growth cone repulsion through ADAM10 metalloprotease. Journal of Neurochemistry. 128 (2), 267-279 (2014).
  42. Tojima, T., et al. Attractive axon guidance involves asymmetric membrane transport and exocytosis in the growth cone. Nature Neuroscience. 10 (1), 58-66 (2007).
  43. Ooashi, N., Futatsugi, A., Yoshihara, F., Mikoshiba, K., Kamiguchi, H. Cell adhesion molecules regulate Ca2+-mediated steering of growth cones via cyclic AMP and ryanodine receptor type 3. Journal of Cell Biology. 170 (7), 1159-1167 (2005).
  44. Biswas, S., Kalil, K. The Microtubule-Associated Protein Tau Mediates the Organization of Microtubules and Their Dynamic Exploration of Actin-Rich Lamellipodia and Filopodia of Cortical Growth Cones. Journal of Neuroscience. 38 (2), 291-307 (2018).
  45. Kuboyama, T., et al. Paxillin phosphorylation counteracts proteoglycan-mediated inhibition of axon regeneration. Experimental Neurology. 248, 157-169 (2013).

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