軸索の成長円錐の破壊とマウスの培養神経細胞の初期のアミロイド β 効果の可視化

ここで、脳にアミロイド β (a β) の初期の影響を調査するためのプロトコルが表示されます。 これは、a β がクラスリン依存性エンドサイトーシスと軸索成長円錐の崩壊を誘発することを示しています。プロトコルは有用性軸索成長円錐の a β の初期の影響が、アルツハイマー病の予防を促進するかもしれない。

アミロイド β (a β) アルツハイマー病 (AD) のメモリ障害が発生します。治療は、AD 患者の脳内 a β レベルを減らすために示されている、ただしこれらはメモリ機能を改善しません。以来、メモリ障害の出現の前に脳内の a β を集約、a β をターゲットできないがあります既に記憶障害を示す AD 患者を治療するため効率的です。したがって、a β 沈着による下流シグナリングは、広告開発の前にブロックする必要があります。A β は、ニューロン ネットワークとメモリ障害の混乱につながる軸索変性を誘導します。A β 毒性のメカニズムに関する多くの研究がありますが、a β の毒性の原因は不明のまま。ソースを識別するために、顕微鏡、遺伝子導入、培養神経細胞の軸索の成長円錐における a β による初期の変化を調査するためのイメージングを使用して、新しいプロトコルを提案する.このプロトコルでは、a β は、エンドサイトーシスの阻害が a β 毒性を防止することを示す成長円錐の破壊、続いて軸索の成長円錐におけるクラスリン依存性エンドサイトーシスを誘導を明らかにしました。このプロトコルでは、a β の初期効果の研究に有用であるしより効率的かつ予防の AD 治療につながる可能性があります。

アミロイド β (a β) の預金はアルツハイマー病 (AD) 患者の脳で発見され、メモリ障害^2,3,4につながる神経のネットワークを混乱させる広告¹の重要な原因と考えられています。アミロイド β (a β) の生産を効果的に防ぐまたは a β の預金を削除する多くの臨床薬の候補者が示されています。しかし、どれも AD 患者⁵の記憶機能の改善に成功しています。メモリ障害⁶; 発症する前に脳に a β が沈着既にしたがって、患者の脳内の a β レベルを低下出展記憶障碍なく効果的かもしれません。A β 沈着がある臨床の AD 患者;しかし、これらの患者はほとんど神経変性とメモリの赤字⁶提示します。A β 沈着と記憶障害との間のタイムラグがあります。したがって、広告の防止のための重要な戦略は、記憶障害の開発の前に、広告の初期の段階でシグナル a β 毒性をブロックされています。A β の沈着を誘導する軸索変性^{7,8,9,10、11,12,13}の崩壊につながる可能性があります。ニューラル ネットワークとメモリ機能の永久的な障害。多くの研究は、a β 毒性のメカニズムを検討しました。たとえば、広告マウス脳の変性した軸索は、オートファジー¹⁴を増加するいると示されています。軸索変性の a β による¹⁵の可能なメカニズムとしてカルシニューリンの活性化が報告されています。しかし、軸索変性の直接のトリガーは不明のまま。

本研究は成長円錐と呼ばれる軸索終末の崩壊に焦点を当てています。軸索成長円錐の崩壊は、軸索の成長忌避剤、セマフォリン 3 a と ephrin A5^{16,17,18,19、}など²⁰によって引き起こされることができます。崩壊のような栄養障害による軸索終末は、AD 患者^21,22の脳で観察されています。さらに、成長円錐の機能の障害は、軸索変性²³を引き起こすことができます。しかし、a β が成長円錐の破壊を誘発するかどうかは知られています。したがって、本研究は、培養神経細胞における a β の初期効果を観察し、a β による成長円錐の破壊を調査する新しいプロトコルを提示します。

すべての実験ケアと富山大学杉谷キャンパスで実験動物の使用のためのガイドラインに従って実施し、動物と杉谷キャンパスで実験動物の使用委員会によって承認された、富山大学 (A2014INM 1、A2017INM 1)。

1. 崩壊アッセイ

1. ポリ-D-リジン コーティング
   1. コートを 5 μ g/mL ポリ-D-リジン (PDL) 400 μ l/8 ウェル文化スライドはリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と一晩 37 ° C でそれらを孵化させなさい。
   2. PDL のソリューションを削除し、蒸留水で 3 回洗浄します。
2. ニューロン文化²⁴
   1. 12% 馬血清、0.6% グルコースと 2 mM L-グルタミン (中 A) を含むニューロン培地の刀と萌芽期日 14 (E14) ddY マウスから新鮮単離の大脳皮質をミンチします。抗生物質を追加しないでください。
      メモ: このプロトコル ddY マウスが使用されます。これは、日本でよく使用されるザイモグラムのひずみです。この神経細胞培養のプロトコルをラット大脳皮質ニューロン^7,25の適用もできます。
   2. 3 分間 87 x g で組織を遠心します。
   3. 上澄みを除去します。その後、ペレットに 0.05% トリプシンの 2 mL 追加し、37 ° C で 15 分間インキュベート5 分ごとをタップしてミックスします。
   4. 軽くたたくことによって媒質 A とミックスの 4 つの mL を追加します。
   5. 3 分の 178 x g で組織を遠心します。
   6. 、上澄みを除去し、私は、0.3 mg/mL 大豆トリプシンインヒビターは 37 ° C で 15 分間溶解 PBS で 600 U/mL の組織を孵化させなさい5 分ごとをタップしてミックスします。
   7. インキュベーション後、軽くたたくことによって媒質 A とミックスの 4 つの mL を追加します。
   8. 3 分の 178 x g で組織を遠心します。
   9. 上清を除去した後媒質 A の 4 つの mL を追加し、洗練されたパスツール ピペットで組織をカップ刻んだ。
   10. 70 μ m 孔サイズ メッシュと摩砕のティッシュをフィルター処理します。濾過後、診断と細胞の密度を計算します。
   11. 文化 8 ウェル培養細胞 10⁴細胞/ウェル中 A × 0.8 でスライドさせ、37 ° C で 10% CO₂の加湿雰囲気と CO₂インキュベーターでそれらを維持
   12. 培養 4 h 後神経文化、0.6% グルコースと 2 mM L-グルタミン (培地 B) のサプリメントを 1 つ含む 2% に培養液を交換します。
       注: 神経細胞の純度は²⁶を前述のように約 75% をだった。
3. 崩壊試験²⁷
   1. 商業的得フルレングス アミロイド β 1-42 (Aβ1-42) 0.5 mM の濃度で蒸留水で溶解し、37 ° C で 7 日間インキュベートします。、孵化後使用するまで-30 ° C のフリーザーで集計 Aβ1 42 ソリューションを格納します。
      注: このインキュベーション集計と a β^27,28,29,30の毒性に必要です。
   2. 4 日間神経培養治療を新しい培地 B の 100 μ l/ウェルは後、は、1 h の Aβ1 42 または車両のソリューション (蒸留水) を集計 0.5 μ M を含みます。
      注: Aβ1 42 の効果が、用量依存的 0.1 から 5 μ M に増加し、0.5 μ M²⁷を前述のようにピークに達した。神経文化³¹の 3 日後 1 h の Aβ1 42 治療でと同様の結果が観測できます。
   3. 培を削除し、ホット プレート上の 37 ° C で 1 時間 PBS で 4% ショ糖を含む 4% パラホルムアルデヒドでニューロンがすぐに解決します。
   4. 固定後、3 回 PBS でニューロンを洗って水土台媒体でそれらをマウントします。2-4 日のための 4 ° C でメディアをマウントを乾燥させます。
   5. 倒立顕微鏡上の 20 X 乾燥対物レンズの各ウェルの全体の区域 (7.8 x 9 mm²) をキャプチャします。
   6. 前述した^32,33として段階 3 または 4 軸索、各ニューロンの長い神経突起を分類します。
   7. 次の基準に従って成長円錐の分類: ケラトサイトを欠けているまたは 2) よりも少ない 3 つの突起を有すると見なされます 1) 軸索成長円錐¹⁷を前述のように成長円錐を崩壊しました。
      注: 健全な成長円錐を 0 ポイントとして獲得しています。折りたたまれた成長円錐は、1 点として採点されています。各治療のためスコアの計算の崩壊を意味します。

2 アミロイド β 免疫染色

1. 手順 1.2 で 3 日間、マウス大脳皮質ニューロンの文化.
2. 集計 Aβ1 42 治療 (5 μ M) や CO₂インキュベーターで 37 ° C で 4 時間車。
3. メディアを削除せず各ウェルに PBS で 4% ショ糖を含む 4% パラホルムアルデヒドの等量を追加し、5 分間ホット プレート上の 37 ° C で文化を維持します。
4. ソリューションを 400 μ L の pbs は、4% ショ糖を含む 4% パラホルムアルデヒドに置き換えて、1 h のホット プレート上の 37 ° C で維持します。この固定プロトコルは、以前レポート³⁴から変更されました。
5. PBS にニューロンを 3 回洗います。
6. PBS で 5% ヤギ血清をブロックします。
7. ニューロン マウス抗アミロイド β 免疫グロブリン G (IgG) (1:50)、PBS の 4 ° C でウシ血清アルブミンを 1%、一晩インキュベートします。
8. PBS にニューロンを 3 回洗います。
9. 蛍光標識二次抗体 (1: 400) と PBS で 2 時間室温にウシ血清アルブミンを 1% のニューロンを孵化させなさい。
10. PBS で 3 回ニューロンを洗って水土台媒体でそれらをマウントします。
11. 倒立顕微鏡 B. 40 X 乾燥対物レンズを用いた蛍光画像と傾斜照明による明視野画像をキャプチャします。

3. 軸索染色²⁷

1. 1.3.3 の手順で説明するよう培養神経細胞固定後 PBS で 3 回ニューロンを洗ってください。
2. マウス抗 tau-1 ニューロンをインキュベート IgG (1: 500) ウサギ抗微小管関連タンパク質 2 (MAP2) 5% ヤギ血清と 0.3 %t - octylphenoxypoly-ethoxyethanol PBS で 4 ° c 一晩 IgG (1: 500)。
3. PBS にニューロンを 3 回洗います。
4. 蛍光標識二次抗体 (1: 400) および 0.3 %t - octylphenoxypolyethoxyethanol PBS で 2 時間室温で孵化させなさい。
5. PBS で 3 回ニューロンを洗って水土台媒体を使用してマウントします。
6. A. 倒立顕微鏡 20 × 乾燥対物レンズを用いた蛍光と差動干渉の対照 (DIC) 画像をキャプチャします。

4. ライブセル イメージング²⁷

1. PDL の 500 μ L とガラス ベースの料理をコート (5 μ g/mL)、1.1.1 の手順で説明されているようです。
   注: このプロトコルで自家製ガラス ベースの料理が使用されました。市販ガラス ベースの料理をライブ イメージングの使用もできます。自家製ガラス ベースの料理は次のように準備された: 1) 手パンチで 35 mm ディッシュの中央に直径約 1.4 mm の穴を作るし、2)、シリコーンが付いている皿の背面ガラス基板 (直径 22 mm) に取り付けます。
2. 1.1.2 の手順で説明するように、蒸留水でプレートを洗うし、3 x 10 の⁴セル/皿中、1.2 の手順で説明したようにガラス皿に皮質ニューロンの文化します。
3. 細胞培養の 4 日間は、新しい培地 B、2 mL と転送媒体を交換後に皿倒立顕微鏡 A. 維持加湿雰囲気 37 ° C で 10% CO₂の文化

5. エンドサイトーシス実験

1. 手順 1.2 マウス大脳皮質ニューロンの文化.
2. 4 日後は、新しい培地 B 20 μ M 蛍光膜プローブ 1 分を含むの 100 μ L で媒体を置き換えます。
3. ピペッティングで 1 μ 0.05 mM 集計 Aβ1 42 (最終的な 0.5 μ M) や車両 (蒸留水) ソリューションとミックスを追加します。20 分間インキュベートします。
4. メディアを取り出して、あらかじめ 37 ° C に加温されている培地 B で 2 回洗浄
5. 修正、洗浄、1.3.3 および 1.3.4 の手順で説明するようにニューロンをマウントします。
6. 蛍光と倒立顕微鏡 A の油対物レンズ × 63 DIC 画像をキャプチャします。
7. イメージ ソフトウェアを使用して各健全な成長円錐の蛍光膜プローブ陽性領域の密度を定量化します。

6. 遺伝子導入

1. ステップ 1.2 に従って、皮質ニューロンを準備します。1.2.1 に 1.2.10 の手順を完了すると、3 分の 178 x g でニューロンを遠心します。
2. 上澄みを除去、Ca^{2 +}の 4 つの mL を追加-無料と Mg^{2 +}-無料のハンクス平衡塩溶液 (CMF HBSS) のピペッティングで混ぜます。
3. 3 分の 178 x g で細胞を遠心します。
4. 上澄みを除去、CMF HBSS の 4 つの mL を追加し、ピペッティングで混ぜます。次に、手順 1.2.10 細胞密度を計算します。
5. 5 x 10 の⁶セルを転送すると、1.5 mL チューブと 1,677 × g で 1 分間遠心します。
6. 上澄みを除去サプリメントのトランスフェクション溶液の 100 μ L およびエンコーディング EGFP または C 末端 EGFP AP180 DNA のプラスミッドの 3 μ g を追加して、ピペッティングで混ぜます。
7. 認定キュベットに上記の解決 (手順 6.6) を転送し、製造元のプロトコルによると、遺伝子導入装置と transfect。
8. トランスフェクション、直後後キュヴェットに媒質 A の 500 μ L を追加し、ソリューションを認定ピペットと 1.5 mL チューブに転送します。次に、手順 1.2.10 細胞密度を計算します。
9. 1.2.11 と 1.2.12 の手順の説明に従って 10⁴細胞/ウェル、× 0.8 で 8 も培養スライドの細胞を培養します。
10. 手順 1.3 で説明した細胞培養 4 日後崩壊試験を実行します。

このプロトコルでは Aβ1 42 使用前に 7 日間の 37 ° C で培養された Aβ1 42 の孵化だった有毒フォーム^27,28,30,35の生産に必要なため。この後、a β の集計フォーム (図 1 a) を認めた.それは、線維状 a β³⁶Aβ1 42 のような孵化に生産が報告されています。この集計 Aβ1 42 治療後 a β^35,37の有毒なオリゴマーの抗体で免疫染色を行ったと培養神経細胞 (図 1 b) に陽性が検出されました。上記を考慮は、このインキュベーション プロトコルは、a β の毒性のフォームを生成します。

数日間 a β 暴露後の軸索変性の誘導の必要があります。軸索変性の前にイベントは不明します。したがって、このプロトコルはさらに関与するメカニズムを理解する開発されています。このプロトコルを使用すると、a β 治療による初期の現象を分析しました。皮質ニューロンは、4 日間培養しました。培養神経細胞の長い突起した軸索;これらは軸索のマーカー、タウ-1、および樹状突起のマーカー、MAP2 に負の免疫染色陽性染色によって確認された (図 2)。車両治療の 1 h 後成長円錐いたケラトサイトを広がり、いくつかの実験を処理します。これらは健康な成長円錐として識別されました。逆に、Aβ1 42 治療の 1 h は縮められた成長円錐は、ケラトサイトまたは糸状にない開発につながった。これらは、折りたたまれた成長円錐として識別されました。1.3.7 の手順の説明に従って崩壊スコアを算出しました。成長円錐の形状は明確ではなかった場合、彼らは分析から排除されました。Aβ1 42 治療は車両扱いの成長円錐形²⁷の崩壊スコアと比較した場合、軸索の成長崩壊の増加に対応する崩壊スコアの大幅な増加につながった。

軸索成長円錐は、Aβ1 42 (図 3) の治療前後に観察されました。37 ° C で 10% CO₂の加湿雰囲気と倒立顕微鏡で細胞が維持され画像は 5 分ごとに捕獲されました。図 3に示すように、Aβ1 42 治療後 21 と 26 分間成長円錐が崩壊しました。成長円錐は、ライブセル イメージング彼らは 1 時間の治療前の健康な形を保持されなかった場合から除かれました。

Aβ1-42-治療の初期の影響を視覚化するには、エンドサイトーシスは、エンドサイトーシス阻害剤は、Aβ1 42 誘起成長円錐崩壊²⁷をブロックできますのでこの分析の焦点として使用されました。エンドサイトーシスは蛍光膜プローブを可視化した(すなわち.、原形質膜に結合し、貪食では自発的に蛍光色素)。成長円錐が Aβ1-42-治療²⁷; 後の 20 分で折り畳むことを示した前の研究したがって、健康的な成長円錐は後の画像の車両- または Aβ1-42-扱われる細胞 20 分 DIC によって選ばれました。Aβ1-42-治療の後多数の蛍光膜プローブ肯定的な点は、成長円錐 (図 4) で観察されました。成長円錐の蛍光膜プローブ陽性涙点の密度は大幅に増加した²⁷だったこれは崩壊前に発生した誘起 Aβ1 42 成長円錐のエンドサイトーシスを示唆しています。

エンドサイトーシスの役割を確認するには、エンコーディング EGFP AP180 C 末端 DNA のプラスミッドは培養大脳皮質神経細胞にトランスフェクションだった。AP180 の C 末端を選択的に発現する細胞は、クラスリン介在性のエンドサイトーシス^38,39を抑制しました。EGFP 発現がニューロンの細胞体にみられた、AP180 の C 末端はニューロンの軸索成長円錐に表現されると考慮されました。AP180 C 末端のトランスフェクション ブロック²⁷Aβ1 誘起 42 成長円錐の崩壊 (図 5)。

図 1:A のインキュベーションΒ 1-42 a β を集計します。(A) Aβ1-42 の 0.5 mM の濃度で水に溶解し (インキュベーション) 後 7 日間 37 ° C で培養または潜伏 (インキュベーションなし) なし-30 ° C で保存します。各 a β ソリューションは 0.1 mM に希釈しました。その後、各希釈液の 10 μ L はスライド ガラス上にドロップされ coverslips で覆われています。傾斜照明による明視野画像は倒立顕微鏡 * スケールを使用して、キャプチャされたバー = 20 μ m。(B) 集計 Aβ1 42 または車両処理 4 時間培養神経細胞。治療の後、ニューロンが修正されましたと有毒な a β オリゴマーの immunostained。蛍光画像 (赤)、傾斜照明 (グレー) による明視野画像が表示されます。スケール バー = 20 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2:AΒ 1 42 誘導性軸索成長円錐の破壊。Aβ1-42- または車両-施術後は、ニューロンが修正され、タウ-1 (赤) と微小管の immunostained は蛋白質 2 (MAP2、緑) を関連付けた。蛍光および差動干渉の対照 (DIC) 画像が表示されます。(ROI、四角形) 関心領域の拡大ビューは、対応するイメージとおりです。ホワイト スケールバー = 50 μ m;黒のスケール バー = 10 μ m。この図は、2015年²⁷久保山らから変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: シス A 前後Β 1-42 治療。4 日間培養後、細胞は倒立顕微鏡に移され、DIC のイメージが捕獲された 5 分ごとにコマ撮りの画像が表示されます。数字は、集約された Aβ1 42 (最終濃度 0.5 μ M) の適用後分: 秒を表します。スケール バー = 10 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: A の 20 分Β 1-42 治療によるエンドサイトーシス。皮質ニューロンの 4 日間培養と蛍光膜プローブで治療します。その後、神経細胞は、Aβ1 42 または車で 20 分の扱われました。成長円錐の蛍光画像のとおりです。黄色の点線は、成長円錐の輪郭を表しています。スケール バー = 10 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 5: AP180 C 末端側の式ブロック Aβ1 42 崩落します。EGFP (a, B) か (C, D)、EGFP AP180 の C 末端のトランスフェクション後 4 日間1 h. DIC (上部パネル) の大脳皮質ニューロンに Aβ1 42 (B, D)、または (A、C) 車を追加し、蛍光 (底面) 画像が表示されます。矢印は、成長円錐を示します。スケール バー = 10 μ m。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

本研究では記述されているプロトコルには、Aβ1 42 治療後軸索成長円錐における初期現象の観察が有効になります。Aβ1 42 20 分以内の軸索の成長円錐におけるエンドサイトーシスと成長円錐の破壊処理の 1 h で観測されていた。このエンドサイトーシスによりクラスリン媒介おそらく。このプロトコルを使用して、クラスリン依存性エンドサイトーシスを抑制は、Aβ1 42 誘起成長円錐の破壊と²⁷培養神経細胞の軸索変性を防ぐために確認されました。また、クラスリン依存性エンドサイトーシスを抑制は Aβ1 42 誘発性の軸索変性と²⁷体内メモリの赤字を減衰します。これらの結果は、そのクラスリン依存性エンドサイトーシスが広告防止のための有望な治療上の道を示します。

このプロトコルが開発されたから軸索の成長忌避剤、セマフォリン 3 a と ephrin A5^{16,17,18,,1920}などのアッセイを折りたたみます。崩壊アッセイは、神経回路の発達を評価する研究に使用されています。私はこのプロトコルを病理学的解析、広告; のメカニズムを含む特にそれらに適用できることを示しています。ただし、制限は、成長円錐の約 40% が健全な状態で折りたたまれている可能性があります。この割合より一般的に使用される培養後根神経節ニューロンからの結果崩壊アッセイ^{16,17,18,19,20}より高いです。したがって、細胞の種類の違いは、倒壊率の違いにリンク可能性があります。本研究は、倒壊率が通常培養大脳皮質ニューロン^40,41の以前の研究で見つかったものと一貫性のあります。さらに、Aβ1 42 による成長円錐の破壊セマフォリン 3 a と ephrin A5²⁷などの他の崩壊要因と比較した場合の同じようなレベルです。したがって、このプロトコルは、Aβ1 42 誘起成長円錐の破壊の定量化のためです。この固定プロトコル成長円錐の形状を維持するために重要です。従来室温で 4% パラホルムアルデヒド固定した細胞場合より成長円錐固定プロシージャ (データは示されていない) のため倒れるかもしれない。また、グルタルアルデヒドと固定利用できるバッファーが剛体の固定のため上記⁴²; としてただし、グルタルアルデヒドを表わす蛍光、蛍光イメージングのための重大な障害であります。

同じプロトコルの最近の調査示した基数 Polygalae (イトヒメハギの根) からの水抽出物培養神経細胞における Aβ1 42 誘発性エンドサイトーシスを抑制し、軸索変性を防止し、メモリ赤字を削減、AD³¹トランスジェニック マウス モデル。広告防止のための新しい候補者は、このプロトコルで発見されています。遺伝子導入とこのプロトコルの生きているセルイメージ投射の組み合わせが Ca^{2 +}イメージング、微小管ダイナミクスと細胞接着などの a β 治療前後軸索と端末は、他の携帯電話のイベントを表示します。軸索に関連する報道によれば成長^43,44,45です。このプロトコルは、a β の毒性のより詳細なメカニズムを明らかにするを助けるかもしれないし、予防や AD の治療につながる可能性があります。

著者は、何を開示します。

この作品は、日本学術振興会からの研究補助金によって部分的に支持された (科研費 18 K 07389)、日本、武田科学振興財団、および小林製薬株式会社、日本。