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Un protocole d’enquêter sur les premiers effets de β amyloïde (Aß) dans le cerveau est présenté ici. Cela montre que le bêta-amyloïdes induit endocytose clathrine et effondrement des cônes de croissance axonale. Le protocole est utile dans l’étude des effets précoces de bêta-amyloïdes sur les cônes de croissance axonale et peut-être faciliter la prévention de la maladie d’Alzheimer.
Β amyloïde (Aß) provoque des troubles de la mémoire dans la maladie d’Alzheimer (ma). Bien que thérapeutique ont été montré pour réduire les concentrations de bêta-amyloïdes dans le cerveau des patients atteints de ma, ceux-ci ne s’améliorent pas les fonctions de mémoire. Regroupe les bêta-amyloïdes dans le cerveau avant l’apparition de troubles de la mémoire, ciblage Aβ peut être inefficace pour le traitement des patients atteints de ma qui présentent déjà des déficits de mémoire. Par conséquent, signalisation en aval en raison des dépôts de Aβ doit être bloquée avant le développement de l’AD. Aβ induit une dégénérescence axonale, conduisant à la perturbation des réseaux de neurones et de troubles de la mémoire. Bien qu’il existe beaucoup d’études sur les mécanismes de toxicité Aβ, la source de bêta-amyloïdes toxicité reste inconnue. Pour aider à identifier la source, nous proposons un protocole novateur qui utilise la microscopie, transfection du gène et imagerie afin d’étudier les changements précoces causées par les bêta-amyloïdes dans les cônes de croissance axonale des neurones en culture de cellules vivantes. Ce protocole a révélé que Aβ induite par endocytose clathrine dans les cônes de croissance axonale suivie d’effondrement de la croissance de cône, ce qui démontre que l’inhibition de l’endocytose empêche toxicité Aβ. Ce protocole sera utile pour étudier les premiers effets de la bêta-amyloïdes et peut conduire à un traitement plus efficace et préventif AD.
Dépôts d’amyloïde-β (Aβ) sont trouvent dans le cerveau des patients atteints de la maladie d’Alzheimer (ma) et sont considérés comme une cause essentielle de AD1 qui perturbent les réseaux neuronaux, conduisant à une déficience de mémoire pour2,3,4. De nombreux candidats-médicaments cliniques montrent à prévenir efficacement la production de β amyloïde (Aß) ou éliminer les dépôts de bêta-amyloïdes. Toutefois, aucun ont réussi à améliorer la fonction de mémoire dans AD patients5. Aβ est déjà déposé dans le cerveau avant l’apparition de déficiences de mémoire6; par conséquent, baisse des niveaux de bêta-amyloïdes dans le cerveau des patients présentant troubles de la mémoire peuvent être inefficaces. Dépôts d’Aβ sont présent dans Alzheimer préclinique ; Toutefois, ces patients présentent rarement neuronale dégénérescence et la mémoire déficits6. Il y a un décalage entre les dépôts de bêta-amyloïdes et troubles de la mémoire. Par conséquent, une stratégie essentielle pour la prévention des AD bloque toxicité Aβ signalisation durant les premiers stades de l’AD, avant l’apparition de déficits de mémoire. Dépôts d’Aβ induit axon dégénérescence7,8,9,10,11,12,13, qui peut conduire à une perturbation du réseaux de neurones et une déficience permanente d’une fonction mémoire. De nombreuses études ont étudié les mécanismes de la toxicité de l’Aß ; par exemple, les axones dégénérées de cerveaux de souris ont démontré avoir augmenté autophagie14. Activation de la calcineurine a été signalée comme un éventuel mécanisme de la dégénérescence axonale induite par l’Aß15; Cependant, la détente directe d’une dégénérescence axonale reste inconnue.
Cette étude se concentre sur l’effondrement des terminaisons axonales appelé cônes de croissance. L’effondrement des cônes de croissance axonale peut être causée par les répulsifs croissance axonale, type sémaphorine-3 a et éphrine-A516,17,18,19,20. Terminaisons axonales dystrophiques effondrement semblable ont été observées dans le cerveau des AD patients21,22. En outre, une défaillance du fonctionnement de cône de croissance peut provoquer une dégénérescence axonale23. Cependant, on ne sait pas si Aβ induit effondrement de cône de croissance. Par conséquent, cette étude présente un nouveau protocole pour observer les premiers effets de la bêta-amyloïdes dans les neurones en culture et enquêter sur effondrement de cône de croissance induite par l’Aß.
Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire au Campus de l’Université de Toyama Sugitani et ont été approuvés par le Comité pour animalier et Use of Laboratory Animals au Sugitani Campus de la Université de Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).
1. effondrement Assay
2. amyloïdes β Immunostaining
3. axones Immunostaining27
4. vivre la cellule imagerie27
5. l’endocytose Experiment
6. Transfection du gène
Dans ce protocole, Aβ1-42 est incubé à 37 ° C pendant 7 jours avant de l’utiliser, parce que l’incubation de Aβ1-42 était nécessaire pour produire des formes toxiques27,28,30,35. Après l’incubation, formes globales d’Aβ ont été observés (Figure 1 a). Il a été signalé que l’incubation similaire de Aβ1-42 produit la forme de fibrilles d’Aβ36. Après le traitement avec cette agrégée Aβ1-42, immunomarquage avec un anticorps pour l’oligomère toxique d’Aβ35,37 a été réalisée, et une coloration positive a été détectée sur les neurones en culture (Figure 1 b). Compte tenu de ce qui précède, le présent protocole d’incubation a produit les formes toxiques de bêta-amyloïdes.
Plusieurs jours ont été nécessaires pour l’induction de la dégénérescence axonale après exposition Aβ. Les événements antérieurs à une dégénérescence axonale demeurent incertains. Par conséquent, ce protocole a été élaboré pour mieux comprendre les mécanismes impliqués. Utilisant ce protocole, les phénomènes précoces induites par le traitement de bêta-amyloïdes ont été analysés. Les neurones corticaux ont été cultivés pendant 4 jours. Les neurites plus longues dans les neurones en culture ont été identifiés comme les axones ; ceux-ci ont été confirmés par immunomarquage positif pour le marqueur axonale, tau-1 et immunostaining négatif pour le marqueur dendritique, MAP2 (Figure 2). Après 1 h de traitement de véhicule, cônes de croissance avaient réparties lamellipodia et traitées plusieurs filopodes. Ceux-ci ont été identifiés comme des cônes de croissance saine. À l’inverse, 1 h de traitement Aβ1-42 a conduit à des cônes de croissance réduite, qui ne développé aucun lamellipodia ou filopodes. Ceux-ci ont été identifiés comme des cônes de croissance s’est effondré. Effondrement a été calculé comme indiqué au point 1.3.7. Lorsque les formes des cônes de croissance ne sont pas clairs, ils ont été éliminés de l’analyse. Aβ1-42 traitement a conduit à une augmentation significative dans la partition de l’effondrement, correspondant augmenté l’effondrement de la croissance axonale, par rapport à la partition de l’effondrement des cônes de croissance imprégnées de véhicule27.
Les cônes de croissance axonale ont été observées avant et après traitement avec Aβ1-42 (Figure 3). Les cellules ont été maintenues dans le microscope inversé avec une atmosphère humidifiée de 10 % de CO2 à 37 ° C. Des images ont été capturées toutes les 5 min. Tel qu’illustré à la Figure 3, les cônes de croissance s’est effondrée entre 21 et 26 min après traitement Aβ1-42. Cônes de croissance ont été exclus de l’imagerie de cellules vivantes si elles n’ont pas conservé leur forme saine pendant 1 h avant tout traitement.
Pour visualiser les premiers effets de Aβ1-42-traitement, endocytose a été utilisé que l’objectif de cette analyse, parce que les inhibiteurs de l’endocytose peuvent bloquer conique à croissance induite par l’Aβ1-42 effondrement27. Endocytose a été visualisée avec une sonde de membrane de fluorescence (i.e., un colorant fluorescent qui se lie à la membrane plasmique et est spontanément mégacaryocyte). Une étude antérieure a montré que les cônes de croissance ne pas s’effondrer à 20 min après Aβ1-42-traitement27; par conséquent, les cônes de croissance saine ont été sélectionnés par DIC imagerie en véhicule Aβ1-42-traités ou cellules après 20 min. Après Aβ1-42-traitement, nombreux examen de sonde séropositifs membranaires fluorescents ont été observés dans le cône de croissance (Figure 4). La densité de fluorescence membranaire sonde séropositifs examen dans les cônes de croissance était significativement accru27. Ceci suggère qu’endocytose de cône de croissance induite par l’Aβ1-42 se produit avant l’effondrement.
Pour confirmer le rôle de l’endocytose, un plasmide d’ADN codant EGFP-AP180 C-terminus a été transfecté dans des neurones corticaux cultivés. Les cellules exprimant l’extrémité C-terminale du AP180 sélectivement inhibées endocytose clathrine38,,39. Si expression EGFP a été observée dans le corps cellulaire dans le neurone, l’extrémité C-terminale du AP180 était censé être exprimée dans le cône de croissance axonale du neurone. Transfection du AP180 C-terminus bloqué la croissance induite par l’Aβ1-42 cône effondrement (Figure 5)27.
Figure 1 : Incubation des A Β1-42 agrégats Aβ. (A) Aβ1-42 a été dissous dans l’eau distillée à une concentration de 0,5 mM et incubés à 37 ° C pendant 7 jours (après incubation) ou conservés à-30 ° C sans incubation (pas d’incubation). Chaque solution Aβ a été diluée à 0,1 mM ; puis, 10 μL de chaque solution diluée était tombé sur lames de verre et recouvert de lamelles couvre-objet. Images de champ lumineux avec éclairage oblique ont été capturés à l’aide de microscope inversé B. échelle bar = 20 μm. (B) le traitement groupé Aβ1-42 ou véhicule sur des neurones cultivés pendant 4 h. Après le traitement, les neurones ont été fixés et immunocolorées pour des oligomères bêta-amyloïdes toxiques. Images de fluorescence (rouge) et des images de champ lumineux avec éclairage oblique (gris) sont indiqués. Echelle = 20 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : A Effondrement de cône de croissance axonale induite par β1-42. Après Aβ1-42 - ou véhicule-traitement, neurones ont été fixés et immunomarquage pour tau-1 (rouge) et les microtubules associated protein 2 (MAP2, vert). Fluorescence et différentiel interférences contraste (DIC) images sont affichées. Vue agrandie des régions d’intérêt (ROI, rectangles) figurent ci-dessous leurs images correspondantes. Blanc de barreaux d’échelle = 50 μm ; échelle noire = 10 μm. Ce chiffre a été modifié de Kuboyama et al., 201527. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Live imagerie cellulaire avant et après une Traitement β1-42. Après 4 jours de culture, les cellules sont transférées à un microscope inversé et DIC images ont été capturées chaque 5 min. Time-lapse images sont affichées. Les chiffres représentent les minutes : secondes après l’application d’agrégés Aβ1-42 (concentration finale, 0,5 μM). Echelle = 10 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Vingt minutes de A Traitement β1-42 induite par endocytose. Les neurones corticaux sont cultivés pendant 4 jours et traitement avec une sonde de membrane de fluorescence. Ensuite, les neurones ont été traités pendant 20 min avec Aβ1-42 ou véhicule. Image de fluorescence des cônes de la croissance sont affichées. Les lignes en pointillés jaunes représentent les contours des cônes de la croissance. Echelle = 10 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Expression du terminus AP180-C bloque effondrement induite par Aβ1-42. Quatre jours après la transfection d’EGFP (A, B) ou EGFP-AP180 C-terminale (C, D) ; Aβ1-42 (B, D) ou un véhicule (A, C) a été ajouté à des neurones corticaux pendant 1 h. DIC (panneaux supérieurs) et images de fluorescence (panneaux inférieurs) sont affichées. Les flèches indiquent les cônes de croissance. Barreaux de l’échelle = 10 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Le protocole décrit dans la présente étude a permis l’observation de phénomènes précoces dans les cônes de croissance axonale après traitement Aβ1-42. Aβ1-42 induite par endocytose dans les cônes de croissance axonale dans les 20 min et effondrement de cône de croissance a été observée dans 1 h de traitement. Cette endocytose a été probablement véhiculée par la clathrine. En utilisant ce protocole, l’inhibition de l’endocytose clathrine a été confirmée pour empêcher l’effondrement de cône de croissance induite par l’Aβ1-42 et la dégénérescence axonale dans les neurones en culture27. En outre, l’inhibition de l’endocytose clathrine atténuée Aβ1-42-induit une dégénérescence axonale et déficits de la mémoire en vivo27. Ces résultats indiquent qu’endocytose clathrine est une thérapeutique prometteuse pour la prévention de l’AD.
Ce protocole a été mis au point de s’effondrer dosages pour les répulsifs croissance axonale, tels que sémaphorine 3 a et éphrine-A516,17,18,19,20. Essais de l’effondrement ont été utilisés dans les études évaluant le développement des réseaux neurones. J’ai montré que ce protocole peut être appliqué à des analyses pathologiques, en particulier celles impliquant des mécanismes d’AD ; Toutefois, une limite peut être qu’environ 40 % des cônes de croissance s’est effondrée dans l’état sain. Ce pourcentage est plus élevé que les résultats de neurones des ganglions spinaux cultivées, qui sont plus couramment utilisés dans l’effondrement dosages16,17,18,19,20. Par conséquent, la différence de types de cellules pourrait être liée aux différences dans les ratios de l’effondrement. Les ratios de l’effondrement constatés dans cette étude étaient conformes à ceux trouvés dans les études antérieures sur les neurones corticaux cultivés normal40,41. En outre, Aβ1-42 induit des niveaux similaires de l’effondrement de cône de croissance par rapport aux autres facteurs de l’effondrement, comme sémaphorine 3 a et éphrine-A527. Par conséquent, ce protocole est valable pour la quantification de l’effondrement de cône de croissance induite par l’Aβ1-42. Ce protocole de fixation est important pour conserver la forme des cônes de croissance. Si les cellules ont été conventionnellement fixées avec 4 % de paraformaldéhyde à température ambiante, les cônes de croissance plus peuvent se sont effondrées en raison de la procédure de fixation (données non présentées). Alternativement, glutaraldéhyde et fixation tampons sont disponibles pour la fixation rigide, comme décrit précédemment42; Toutefois, le glutaraldéhyde pièces autofluorescence, qui est un obstacle important pour l’imagerie de fluorescence.
Une étude récente avec le même protocole a montré que l’eau extrait de Radix Polygalae (racines de Polygala tenuifolia) inhibe l’endocytose Aβ1-42-induit dans les neurones en culture a empêché une dégénérescence axonale et réduit les déficits de mémoire dans un modèle de souris transgénique de AD31. Un candidat pour la prévention de l’AD a été trouvé avec ce protocole. Une combinaison de transfection du gène et l’imagerie de cellules vivantes dans le présent protocole peut faire apparaître les autres événements cellulaires trouvés dans les axones et leurs terminaux, avant et après traitement de bêta-amyloïdes, telles que Ca2 + imagerie dynamique des microtubules et dynamique d’adhérence cellulaire, qui sont la croissance auraient été liés à axonale43,44,45. Ce protocole peut aider à révéler plus détaillée des mécanismes de toxicité Aβ et peut aider à mener à la prévention et/ou le traitement de la ma.
L’auteur n’a rien à divulguer.
Ce travail a été partiellement pris en charge par des subventions de recherche du JSPS (KAKENHI 18K 07389), Japon, Takeda (FNS), le Japon et Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd., Japon.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
ddY mice | SLC | ||
Eight-well culture slide | Falcon | 354108 | |
poly D lysine | Wako | 168-19041 | |
Culture medium, Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
house serum | Gibco | 26050-088 | |
glucose | Wako | 049-31165 | |
L-glutamine | Wako | 074-00522 | |
0.05% trypsin | Gibco | 25300-054 | |
DNase I | Worthington | DP | |
soybean trypsin inhibitor | Gibco | 17075-029 | |
Filter with 70 µm mesh size, cell strainer | Falcon | 352350 | |
B-27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
CO2 incubator | Astec | SCA-165DS | |
Amyloid β1-42 | Sigma-Aldrich | A9810 | |
paraformaldehyde | Wako | 162-16065 | |
sucrose | Wako | 196-00015 | |
Aqueous mounting medium, Aqua-Poly/Mount | polysciences | 18606-20 | |
Inverted microscope A | Carl Zeiss | Axio Observer Z1 | Connected with AxioCam MRm, Heating Unit XL S, CO2 Module S1, and TempModule S1 |
Objective Plan-Apochromat 20x | Carl Zeiss | 420650-9901 | |
Objective Plan-Apochromat 63x | Carl Zeiss | 440762-9904 | |
Objective, CFI Plan Apo Lambda 40X | Nikon | ||
anti-MAP2 IgG | Abcam | ab32454 | |
anti-tau-1 IgG | Chemicon | MAB3420 | |
anti-amyloid β antibody | IBL | 10379 | clone 11A1 |
normal goat serum | Wako | 143-06561 | |
bovine serum albumin | Wako | 010-25783 | |
t-octylphenoxypolyethoxyethanol | Wako | 169-21105 | |
goat anti-mouse IgG conjugated with AlexaFluor 594 | Invitrogen | A11032 | |
goat anti-rabbit IgG conjugated with AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
hot plate | NISSIN | NHP-M30N | |
cover glass | Fisher Scientific | 12-545-85 | |
35 mm dish | IWAKI | 1000-035 | |
Silicone RTV | Shin-Etsu | KE42T | |
hand punch | Roper Whitney | No. XX | |
Fluorescence membrane probe, FM1-43FX | Invitrogen | F35355 | |
Ca2+- and Mg2+-free Hanks' balanced salt solution | Gibco | 14175-095 | |
Transfection solution, Nucleofector solution | Lonza | VPG-1001 | |
Electroporator, Nucleofector I | Amaxa | ||
Inverted microscope B | Keyence | BZ-X710 | |
Image software, ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ |
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