Высок объём платформы для проверки Salmonella spp. /Shigella spp.

Salmonella spp.Shigella spp. являются общие патогенов, приписываемых понос. Здесь мы описываем платформу высокой пропускной способностью для проверки Salmonella spp. /Shigella spp., с помощью ПЦР в реальном времени в сочетании с гидом культуры.

Фекально оральным механизмом передачи острый гастроэнтерит возникает время от времени, особенно, когда люди, которые занимаются продовольствия и воды заражены Salmonella spp./Shigella spp. Золотой стандарт метод для обнаружения Salmonella spp./Shigella spp. прямым культура, но это является трудоемким и длительным. Здесь мы описываем платформу высокой пропускной способностью для Salmonella spp./Shigella spp. отбора, с использованием реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР) в сочетании с гидом культуры. Существует два основных этапа: ПЦР в реальном времени и руководствоваться культуры. Для первого этапа (ПЦР в реальном времени), мы объяснять каждый шаг метода: образец коллекции и предварительного обогащения, экстракции ДНК, ПЦР в реальном времени. Если результаты ПЦР в реальном времени является положительным, то проводится второй этап (управляемое культура): селективный культуры, биохимической идентификации и серологических характеристик. Мы также иллюстрируют представитель результаты, полученные от него. Протокол, описанные здесь будет ценной платформой для быстрого, конкретные, чувствительной и высок объём проверки Salmonella spp. /Shigella spp.

Диарея является до сих пор общей проблемой здравоохранения с высокой заболеваемостью глобально ставка^1,2. Хотя смертность является относительно низким, у некоторых больных показывают различные симптомы недель (например, сыпучих и водянистый стул, срочности, чтобы перейти к ванной комнате), которые делают социально-экономического воздействия очень высокий^3,4. Более серьезно некоторые пациенты даже может развиться синдром раздраженного кишечника, если оставить неочищенные⁵. Существуют различные виды бактерий, вирусов и паразитов, которые могут вызвать понос⁶. Salmonella spp. /Shigella spp. относятся к числу наиболее распространенных бактерий для передачи острый гастроэнтерит^7,8,9,10,11. Таким образом, многие графства изданы законы или правила для регулярных Salmonella spp. /Shigella spp. скрининг среди людей, которые будут обрабатывать пищу и воду. Например, правительство Китая издали законы для обязательного Salmonella spp. /Shigella spp. Скрининг один раз в год.

Метод золотого стандарта для Salmonella spp. / культуры бактерийShigella spp. обнаружения. Через культуры бактерий и последовательных биохимической идентификации и серологических характеристики мы можем определить виды бактерий, которые могли бы способствовать управлению вспышки болезни и противомикробные профилирования для оказания помощи в лечении больных ¹². Она также может помочь отследить источник инфекции во время Salmonella spp. /Shigella spp. вспышки¹³. Однако этот метод является трудоемким (требующие ручной работы) и времени (принимая несколько дней), особенно для тестирования большого числа образцов⁷. Кроме того жизнеспособных, но не culturable (VBNC) Salmonella spp. /Shigella spp.может существовать в некоторых образцах стула¹⁴. С учетом этих недостатков, многие лаборатории пытались разрабатывать новые методы для обнаружения Salmonella spp. /Shigella spp.^{15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25}. все эти методы используют ядерные кислоты амплификации тест (NAAT), среди которых полимеразной цепной реакции (ПЦР) является наиболее распространенным. Одним из основных ограничений этих NAAT на основе методов является, что Мертвые бактерии, даже бактериальных мусора содержащих неполные геномной ДНК, могут показать положительные результаты²⁶, который может во многом повлиять точный диагноз заболевания. Бланко et al. показали, что молекулярные пробирного очень чувствительна, не только жизнеспособные сальмонеллы в культурах, но и для частичного геномов и мертвых или неэффективных бактерий от прошлых инфекции или загрязнение²⁶. Таким образом следует разработать новые технологии.

Здесь мы описали новый метод сочетает NAAT на основе метода и культивирования. Как показано на рисунке 1, этот новый метод применяется в реальном масштабе времени PCR скрининг первого и затем положительные образцы отправляются для культуры бактерий и идентификации.

Протокол придерживается руководящих принципов, установленных Комитетом по этике исследований человеческого Чжухай Международный Travel здравоохранения центр. Пожалуйста, используйте стандартный стерильные операции во время эксперимента.

1. состав культуры средств массовой информации и подготовка

1. Подготовить питательный бульон: Растворить 1% Пептон, экстракт 0,3% говядины, 0,5% натрия хлорида, 0,1% раствор глюкозы в H₂O, настроить рН 7,5 и автоклава в 121 ° C в течение 15 мин.
2. Подготовка среднего селенит цистина: растворить Пептон 0,5%, лактоза 0,4%, 1% Na₂HCO₃, 0,4% водорода селенит натрия, 0,001% L-цистеин в H₂O, Отрегулируйте пэ-аш до 7.0 и варить 5 мин.
3. Подготовить ксилоза, лизин, Дезоксихолат агар (XLD) плита: растворите дрожжи 0,3% экстракт, 0,5% L-лизин, ксилоза 0,375%, 0,75% лактозы, 0,75% сахарозы, 0,5% натрия хлорида, 0,008% фенола красного, 0,68% натрия тиосульфат, железа цитрат аммония 0,08%, 0,25% натрия Дезоксихолат, 1,5%-агар в H₂O и скорректировать рН 7,4. Затем кипятить в течение 5 минут и залить его в 90 мм пластин.
4. Подготовьте пластину агар Хромогенный сальмонеллы : растворить агар 1,5%, 0,7% Пептон и дрожжевой экстракт, 1,29% выборочной реагента в H₂O. Затем кипятить в течение 5 минут и залить его в 90 мм пластин.
5. Подготовить питательный агар пластина: растворить 1% Пептон, экстракт 0,3% говядины, 0,5% натрия хлорида, 1,5%-агар в H₂O и скорректировать рН 7.3. Затем автоклава в 121 ° C в течение 15 минут и залить его в 90 мм пластин.
6. Подготовить плита агара (MAC) MacConkey: растворить Пептон 2%, 1% лактозы, 0,5% хлорида натрия, 0,5% соли желчных OX, 0,0025% нейтрального красного, 1,5% агар, Фиолетовый Кристалл 0,0001% в H₂O и скорректировать рН 7,2. Затем автоклава в 115 ° C в течение 20 минут и залить его в 90 мм пластин.

2. в реальном масштабе времени PCR

1. Сбор образцов
   1. Вставьте анальный тампоном в анус пациента 3-5 см в глубину и поворот 360° вокруг.
   2. Положите анальный тампоном в стерильных коллекции трубку. Марк образец идентификатора.
   3. Как можно скорее отправьте образца в лабораторию.
      Примечание: Образцы можно хранить при 4 ° C не более 24 ч.
2. Предварительное обогащение
   1. Добавьте 3 мл питательный бульон в каждом образце в коллекции трубки.
   2. Инкубируйте на 36 ° C в течение 6 ч в инкубаторе.
3. Пример смешения (опционально)
   1. Сбор 100 мкл каждого предварительного обогащения культуры и Смешайте 8-10 образцов 1 образца в 1,5 мл, если есть более чем 10 образцов.
   2. Марк должным образом.
4. Экстракции ДНК
   1. Центрифуга для предварительного обогащения культуры на 800 x g на 2 мин разрешить крупные частицы, чтобы успокоиться, и передачи супернатант новой трубки и центрифуги на 12000 x g 5 мин отбросить супернатант стремлением.
   2. 100 мкл раствора экстракции ДНК (0,01 М рН 8,0 трис-ЭДТА, 0,01% Nonidet P 40 (NP40)) в гранулы. Вихрь энергично за 1 мин.
   3. Варить при 100 ° C за 5 мин на сухую ванну.
   4. Центрифуга на 12000 g x 5 мин собирать супернатанта, с помощью новой трубки, которая будет шаблон для последующих анализ ПЦР в реальном времени.
5. ПЦР в реальном времени
   1. Настройка реакции смесь как следовать: для каждого образца, 12,5 мкл 2 x реакционной смеси, 0,4 мкм каждого праймера, 0,2 мкм каждый зонд (последовательности в таблице 1)²⁷, 5 мкл шаблона, подготовленную на этапе 2.4.4 и использовать ddH₂O до 25 мкл. всего объем.
   2. Велоспорт программу следующие установки: 95 ° C в течение 3 мин, затем 40 циклов 95 ° c 15 s, 55 ° C за 30 сек, 72 ° C для 34 s. собирать флуоресцентные сигналов от 6-карбоксильную флюоресцеином (FAM) и Hexachlorofluorescein (HEX) каналов на шаге удлинения (72 ° C) автоматически машиной флуоресцентные реального времени PCR.
   3. Выполняйте ПЦР в реальном времени на компьютере флуоресцентный ПЦР в реальном времени согласно инструкции инструмента.
   4. Перейдите к шагу 4 непосредственно и выпуск негативные сообщения, если отрицательные результаты происходят на каналах FAM/HEX, а это означает, что образцы являются негативными для Salmonella spp. /Shigella spp.
   5. Перейдите к шагу 3.1 или 3.2, если положительные результаты происходят в HEX или FAM каналах, что означает, что выборка может быть положительный результат на Salmonella spp. и/или шигеллезом spp., соответственно.
      Примечание: Если перемешивания образца была выполнена на шаге 2.3, то ПЦР в реальном времени на отдельных образцах, которые составляют тот позитивный должны выполняться отсеивать реальный положительный пример.

3. Руководствуясь культура

1. Salmonella spp. ПЦР положительный пример
   1. Селективный культура в среде
      1. Добавьте 100 мкл предварительного обогащения культуры в 5 мл среды селенит цистина в пробирке. Инкубируйте на 36 ° C для 18 – 24 часа в инкубаторе.
   2. Разделение культуры на плите
      1. Собирать один цикл культуры с микро цикла и распространилась на XLD пластины или сальмонеллы агар Хромогенный пластины. Инкубируйте на 36 ° C для 18-24 ч в инкубаторе.
   3. Биохимической идентификации
      1. Выберите подозрительные колонии на XLD пластины (розовый колонии с/без темного сердца; Темный колонии желтая колонии с/без темного сердца) или сальмонеллы агар Хромогенный пластины (фиолетовый или prunosus колонии, гладкая и круглый) (Рисунок 2).
      2. Предмет подозрительных колония для биохимической идентификации системы автоматической идентификации микроорганизмов, согласно инструкции инструмента.
   4. Серологический характеристика
      1. O антигена характеристика
         1. Добавьте одну каплю поливалентная sera антигена O на чистый слайд.
         2. Собирайте петлей колонии с микро петля и измельчить в sera.
         3. Перейдите к шагу 3.1.4.1.4, если это выглядит как течет песок, что означает, что колонии реактивной sera (рис. 3). В противном случае перейдите к шагу 3.1.4.1.5.
         4. Использование O антигена моновалентной сера повторить шаги 3.1.4.1.1 к 3.1.4.1.3, пока специфического антигена O характеризуется.
         5. Используйте Vi сера повторить шаги 3.1.4.1.1 к 3.1.4.1.3. Собирать те Vi сера реактивной колонии в трубку и варить при 100 ° C за 5 мин в сухом Бате. Центрифуги на 12000 g x 5 мин собирать гранул и повторите шаги 3.1.4.1.1 к 3.1.4.1.4, пока специфического антигена O характеризуется.
      2. H антигена характеристика
         1. Добавьте одну каплю антигена поливалентная Сера H на чистый слайд.
         2. Собирайте петлей колонии с микро петля и измельчить в sera.
         3. Перейдите к шагу 3.1.4.2.4, если это выглядит как течет песок, что означает, что колонии реактивной sera.
         4. Используйте H антигена моновалентной сера для специфического антигена H характеризуется повторите шаги 3.1.4.2.1 для 3.1.4.2.3.
            Примечание: Иногда сыворотки индукции может быть необходимо охарактеризовать второй этап H антигена. Если это так, должны выполняться следующие дополнительные шаги.
         5. (Необязательно) Добавьте одну каплю конкретных Сера H антигена на питательный агар пластину. Подождите, пока все sera поглощаются.
         6. (Необязательно) Собирайте петлей колонии с микро петля и распространение на пластину где поглощаются конкретных Сера H антигена. Инкубируйте на 36 ° C для 18-24 ч в инкубаторе.
         7. (Необязательно) Используйте H антигена моновалентной сера повторить шаги 3.1.4.2.1 к 3.1.4.2.3, пока второй этап антигена H характеризуется.
         8. Перейдите к шагу 4.
2. Шигеллы spp. ПЦР положительный пример
   1. Разделение культуры на плите
      1. Собирать один цикл предварительного обогащения культуры с микро цикла и распространилась на XLD пластины или MAC пластины. Инкубируйте на 36 ° C для 18 – 24 часа в инкубаторе.
   2. Биохимической идентификации
      1. Собирать подозрительных колонии на XLD пластины (гладкие, круглые, прозрачные и красные колонии) или MAC пластины (гладкая, круглые, прозрачные и бесцветные колонии с 2-3 мм в диаметре; Бактерии Shigella sonnei может быть больше и розовеет на свет как удлинение время инкубации) (Рисунок 4).
      2. Предмет подозрительных колония для биохимической идентификации системы автоматической идентификации микроорганизмов, согласно инструкции инструмента.
   3. Серологический характеристика
      1. Добавьте одну каплю Shigella spp. поливалентная sera на чистый слайд.
      2. Собирайте петлей колонии с микро петля и измельчить в sera.
      3. Перейдите к шагу 3.2.3.4 Если это выглядит как течет песок, что означает, что колонии реактивной sera.
      4. Использование Shigella spp. моновалентной сера повторить шаги 3.2.3.1 для 3.2.3.3 пока конкретных Shigella spp. характеризуется.
      5. Перейдите к шагу 4.

4. доклад

1. Выпуск позитивные или негативные отчеты по итогам выше.

Протокол был применен для проверки Salmonella spp. /Shigella spp. в анальный табурет образцы от людей, которые будут обрабатывать пищу и воду.

В реальном масштабе времени PCR шаг как показано на рис. 5A, был успешным амплификации в HEX канала, что означало, что смешанные образец был положительный результат на Salmonella spp. Затем Далее ПЦР в реальном времени было проведено на отдельных образцах, которые составляют позитивный характер. Как показано на рис. 5B, пример 2 был положительным. Таким образом пример 2 был выбран для экскурсии культуры Salmonella spp. На рис. 5Cбыл успешным амплификации в канале FAM, что означало, что смешанные образец был положительным для Shigella spp. Затем было проведено дальнейшее ПЦР в реальном времени и был найден образец 10 положительным (рис. 5D). Таким образом пример 10 был выбран для экскурсии культуры Shigella spp.

В сопровождении гида культуре Salmonella spp. были колонии розовый и фиолетовый колоний на XLD и сальмонеллы агар Хромогенный крышку, отдельно, как показано на рисунке 2. Затем эти колонии были подвергнуты биохимической идентификации на систему автоматической идентификации микроорганизмов. Результаты показали, что он был Salmonella spp., с неизвестных видов. Таким образом, серологических характеристика был выполненных (рис. 3) и он был реактивной O4, O12, Hb, H1, 2. Согласно схеме мелких белых-Кауфманн-Ле пример 2 наконец сообщалось как позитивные для сальмонелла паратифа B. Для экскурсии культуры Shigella spp., насчитывалось розовый красный и бесцветные колонии на XLD и MAC крышку, отдельно, как показано на рисунке 4. Затем эти колонии также были подвергнуты биохимической идентификации на систему автоматической идентификации микроорганизмов. Результаты показали, что бактерии Shigella sonnei. Для подтверждения его конкретный серотип, серологических характеристика был выполненных (рис. 3) и он был реагировать sonnei фазы II. Таким образом пример 10 Наконец сообщалось как позитивные Shigella sonneiэтапа II.

Рисунок 1 : Схема протокола. Две крупные шаги были показаны и разделенных тире линии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Представитель культуры результаты Salmonella spp. на XLD и сальмонеллы агар Хромогенный крышку. На табличке XLD там были розовые колоний с/без темного сердца, на сальмонеллы агар Хромогенный пластины, были фиолетовый колоний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Представитель серологических характеристика результат. Если колония была реактивной sera, он выглядел как течет песок (слева). В противном случае она была мутная (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Представитель культуры результаты Shigella spp. на XLD и MAC крышку. На табличке XLD, были красные колонии, на MAC пластины, были прозрачный и бесцветный колоний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5 : Представитель результаты ПЦР в реальном времени. (A) HEX канал для смеси образцов. (B) HEX-канал для отдельных образцов. (C) FAM канал для смеси образцов. (D) FAM канал для отдельных образцов. ПК: положительный контроль. NC: отрицательный контроль. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1: Грунты и зонды используются. Были предоставлены имя и последовательности грунтовки и зонды.

Начиная с Salmonella spp. /Shigella spp. часто связаны с пищевых отравлений и фекально оральным механизмом передачи острый гастроэнтерит^28,29 и обычной метод трудоемкий или времени ⁷, мы описываем платформу высокой пропускной способностью для Salmonella spp. /Shigella spp. скрининг, с использованием ПЦР в реальном времени в сочетании с гидом культуры.

Есть несколько шагов, которые требуют рассмотрения, чтобы максимизировать возможности этой платформы. Первый из них является шагом предварительного обогащения образцов в питательный бульон (шаг 2.2). Хотя без предварительного обогащения шаг необходим для образцов стула, собранные из этих пациентов с очевидные симптомы, как понос, и т.д., для образцов анальный тампоном, по-прежнему необходимо сделать шаг предварительного обогащения общего 6 h, когда собранные во время предварительной занятости физическое обследование для людей, которые будут обрабатывать пищу и воду, как эти люди были главным образом здоровым или по крайней мере бессимптомных взрослых. Если протокол применялся только для обнаружения Salmonella spp., затем предварительного обогащения могут проводиться в среде селенит цистина увеличить чувствительность. Вторым важным шагом является определение подозрительных колоний (шаг 3.1.3.1 и 3.2.2.1). Существует много помех фон флоры в образцах стула, которые могут маскировать выявление и изолирование целевой патогенов³⁰. Таким образом характеристика подозрительных колоний как определено в шаг 3.1.3.1 и 3.2.2.1 следует иметь в виду во время эксперимента. Третьим важнейшим шагом является серологический характеристика Salmonella spp. Поскольку большинство Salmonella spp. содержат второй этап для антигена H³¹, сыворотка индукции необходимо выполнить. Однако в сыворотке индукции не всегда успешно, и несколько раундов индукции может быть необходимо определить правильный второй этап H.

Протокол является весьма конкретные и чувствительной, как проверить наши предыдущие исследования²⁷. Высокая специфичность протокола свидетельствует его способности, в котором Salmonella spp. /Shigella spp. можно отличить от других смежных патогенов²⁷. Нижний предел обнаружения протокола составляет 10⁴ кое/мл и 10 кое/мл³ Salmonella spp. и Shigella spp., соответственно²⁷, которые сопоставимы с предыдущих докладах^{7,32 , 33 , 34}. как мы отмечали выше, чувствительность обнаружения Salmonella spp. может быть далее увеличена путем предварительного обогащения селенит цистина, если протокол применялся только для обнаружения Salmonella spp. Кроме того, протокол может увеличить позитивный курс на две складки и уменьшения рабочей нагрузки/средний оборот значительно время²⁷.

Подобно другим NAAT анализов, одним из основных ограничений протокола, по сравнению с методом культуры классический бактерий, является, что протокол может идентифицировать только Salmonella spp. /Shigella spp., в то время как другие общие бактерии, вызывая диарею опущенные⁷. В отличие от этого во время культуры классического бактерий, эти бактерии могут быть определены параллельно если они существуют. Еще одно ограничение протокола является то, что некоторые из Salmonella spp. /Shigella spp. не может быть идентифицирован по ПЦР в реальном времени из-за последовательности вариации²⁷. Однако если отрицательные результаты ПЦР в реальном времени для этих образцов от пациентов с очевидными клиническими симптомами, лаборантов следует обратить внимание и может проводить другие экспериментов для подтверждения результатов. Во время большой вспышки мы можем использовать один образец вместо проб имелось для первого раунда PCR скрининг.

В заключение, протокол, здесь может служить ценной платформой для проверки Salmonella spp. /Shigella spp.

Авторы не имеют ничего сообщать.

Эта работа была поддержана науки и технологии программы Чжухай, Китай (Грант номер 20171009E030064), науки и технологии программы Гуандун, Китай (Грант номер 2015A020211004) и науки и технологии программы общей администрации надзору за качеством, инспекции и карантину Китайской Народной Республики (Грант номер 2016IK302, 2017IK224).