沙门氏菌筛选的高通量平台.

沙门氏菌是腹泻的常见病原体。在这里, 我们描述了一个高通量平台, 用于筛选沙门氏菌spp./志贺氏菌pp. 结合引导培养。

急性胃肠炎的粪便-口腔传播不时发生, 特别是当处理食物和水的人感染沙门氏菌时. 沙门氏菌的金标准检测方法是直接培养, 但劳动强度大 , 耗时。在这里, 我们描述了一个高通量平台的沙门氏菌 spp/志贺氏菌筛选, 利用实时聚合酶链反应 (pcr) 结合引导培养。主要有两个阶段: 实时 pcr 和引导培养。对于第一阶段 (实时 pcr), 我们解释了该方法的每个步骤: 样本采集、预富集、dna 提取和实时 pcr。如果实时 pcr 结果为阳性, 则进行第二阶段 (引导培养): 选择性培养、生化鉴定和血清学表征。我们还说明了由此产生的代表性成果。这里描述的协议将是一个有价值的平台, 用于沙门氏菌的快速、特异、敏感和高通量筛选。

腹泻仍然是一个常见的健康问题, 在全球范围内发病率很高, 为^1,2。虽然死亡率相对较低, 但一些患者出现了数周的各种症状 (如大便松动、水汪汪, 紧急去洗手间), 这使得社会经济影响非常高^3,4.更严重的是, 一些患者甚至可能发展肠易激综合征^,如果不治疗5。有各种各样的细菌、病毒和寄生虫会引起腹泻^.沙门氏菌是传播急性肠胃炎 7^{、8、9、10、11}的最常见细菌之一。因此, 许多县颁布了法律或条例, 对处理食物和水的人进行定期沙门氏菌检查。例如, 中国政府每年颁布一次强制性沙门氏菌筛查法律.

沙门氏菌的金标准检测方法是细菌培养.通过细菌培养和连续的生化鉴定和血清学鉴定, 可以识别细菌的种类, 这可以促进疾病爆发管理和抗菌分析, 帮助患者治疗 "¹². 它还可以帮助追踪沙门氏菌疫情期间的感染源. 然而, 这种方法是劳动密集型的 (需要手动操作) 和耗时 (需要几天), 特别是用于测试大量的样品 7.此外,在一些粪便样本中可能存在可行但不可培养的沙门氏菌.鉴于这些缺点, 许多实验室试图开发检测沙门氏菌的新技术. ^{,19,20,21,22,23,24,25}. 所有这些方法都采用了核酸扩增试验, 其中最常见的是聚合酶链反应。这些基于 naat 的方法的一个主要局限性是, 死细菌, 甚至含有不完整基因组 dna 的细菌碎片, 可以显示出阳性的结果²⁶, 这可能会在很大程度上影响疾病的准确诊断。blanco等人表示, 分子检测是高度敏感的, 不仅对培养中可行的沙门氏菌, 而且对部分基因组和死细菌或过去污染的不可行细菌也是如此.因此, 应开发新技术。

在这里, 我们描述了一种结合基于 naat 的方法和培养的新方法。如图 1所示, 这种新方法首先应用实时 pcr 筛选, 然后发送阳性样本进行细菌培养和鉴定。

该协议遵循珠海国际旅游医疗中心人类研究伦理委员会制定的指导方针。请在实验过程中使用标准的无菌操作。

1. 文化媒体的构成与准备

1. 准备营养肉汤: 溶解1% 的肽, 0.3% 牛肉提取物, 0.5% 氯化钠, 0.1% 葡萄糖在 h2o, 调整 ph 值7.5, 并在121°c 高压灭菌15分钟。
2. 制备硒酸盐培养基: 溶解0.5% 肽, 0.4% 乳糖, 1%Na 2hco 3, 0.4% 钠硒酸钠,0.001% l-胱氨酸在 h2o, 调整 ph 值 7.0, 并将其煮沸5分钟。
3. 准备木糖、赖氨酸、脱氧胆碱酯琼脂 (xld) 板: 溶解0.3% 酵母提取物, 0.5% l-赖氨酸, 0.375% 木糖, 0.375 乳糖, 0.375 蔗糖, 0.5% 氯化钠, 0.008% 苯酚红, 0.375 硫酸钠, 0.375 柠檬酸铁铵, 0.08% 钠脱氧胆酸, 在 h2o 中占1.5%, 并将 ph 值调整为7.4。然后将其煮沸 5分钟, 倒入90毫米的盘子中。
4. 制备沙门氏菌色原琼脂板: 溶解1.5% 琼脂, 0.7% 肽和酵母提取物, 1.29 的选择性试剂在 h2o.然后将其煮沸 5分钟, 倒入90毫米的盘子中。
5. 准备营养琼脂板: 溶解1% 的肽, 0.3% 牛肉提取物, 0.5% 氯化钠, 1.5% 琼脂在 h2o, 并调整 ph 值为 7.3。然后在121°c 高压灭菌 15分钟, 并将其倒入90毫米板。
6. 准备 macconkey 琼脂 (mac) 板: 溶解2% 肽, 1% 乳糖, 0.5% 氯化钠, 0.5% ox 胆汁盐, 0.0025% 中性红, 1.5% 琼脂, 0.001% 晶紫罗兰色在 h2 o_,并调整 ph 值为7.2。然后在115°c 内高压灭菌 20分钟, 并将其倒入90毫米板。

2. 实时 pcr

1. 样品收集
   1. 将肛门棉签插入患者的肛门3-5 厘米深, 并将其旋转360°左右。
   2. 将肛门棉签放入无菌收集管中。标记示例 id。
   3. 尽快将样品送到实验室。
      注: 样品可在4°c 下存储不超过24小时。
2. 浓缩前
   1. 在收集管中的每个样品中加入3毫升的营养肉汤。
   2. 在36°c 时, 在孵化器中孵育6小时。
3. 样品混合 (可选)
   1. 收集每个浓缩前培养物的 100μl, 如果有10个以上的样品, 将1个样品的8-10 个样品混合到 1.5 ml 管中。
   2. 正确标记。
4. 脱氧核糖核酸提取
   1. 以 800 x 克离心浓缩前培养物 2分钟, 使大颗粒沉淀, 并以 12, 000 x 克的速度将上清液转移到新的管和离心机上 5分钟, 通过吸入丢弃上清液。
   2. 在颗粒中加入100μl 的 dna 萃取液 (0.01 m ph 8.0 tris-edta, 0.01% 非理想 p40 (np40))。涡旋用力1分钟。
   3. 在100°c 下在干浴中煮沸5分钟。
   4. 离心机以 12, 000 x 克的速度进行 5分钟, 使用新管收集上清液, 该管将成为后续实时 pcr 分析的模板。
5. 实时 pcr
   1. 将反应混合物设置如下: 对于每个样品, 加入125μl 的2x 反应混合物, 每个引物的 0.4μm, 每个探针的 0.2μm (表1中的序列)^,步骤2.4.4 制备的模板 27, 5μl, 并使用 ddh 2x_添加最多25μl 总计 体积。
   2. 设置循环程序如下: 95°c, 然后是40个周期95°c 为 15秒, 55°c 为 30秒, 72°c 为 34秒, 从 6-羧基荧光素 (fam) 和六氯氟化素 (hex) 通道收集荧光信号在伸长率步 (72°c)自动由荧光实时 pcr 机。
   3. 根据仪器的指令, 在荧光实时 pcr 机上执行实时 pcr。
   4. 直接转到步骤 4, 并发出负面报告, 如果发生负面结果的 fam/hex 通道, 这意味着样本是负的沙门氏菌 spp./志贺氏菌spp。
   5. 如果在 hex 和/或 fam 通道上出现阳性结果, 请转到步骤3.1 和 3.2, 这意味着样品可能对沙门氏菌和志贺氏菌分别呈阳性。
      注: 如果在步骤2.3 中进行了样品混合, 则应对构成阳性样品的单个样品进行实时 pcr 检查, 以筛选出真正的阳性样品。

3. 引导文化

1. 沙门氏菌pcr 阳性样品
   1. 媒介中的选择性文化
      1. 在试管中加入100μl 的浓缩前培养物, 加入5毫升的硒石基培养基。在36°c 的孵育18–24小时内的孵化器中。
   2. 在板上分离培养
      1. 收集一个带有微循环的培养环, 并扩散到 xld 板或沙门氏菌色原琼脂板上。在36°c 时, 在孵化器中孵育18-24。
   3. 生化鉴定
      1. 在 xld 板上选择可疑的菌落 (带/没有暗心的粉红色菌落; 黑暗的群体; 没有暗心的黄色群体) 或沙门氏菌的色素性琼脂板 (紫色或刺状菌落, 光滑和圆) (图 2)。
      2. 根据仪器的说明, 在自动微生物识别系统中对可疑群体进行生化鉴定。
   4. 血清学表征
      1. o 抗原特性
         1. 在干净的幻灯片上添加一滴 o 抗原多价血清。
         2. 收集一个循环的殖民地与微循环和研磨在血清。
         3. 如果它看起来像流动的沙子, 请转到步骤 3.1.4.1.4, 这意味着菌落对血清是反应性的 (图 3)。否则, 请转到步骤3.1.4.1.5。
         4. 使用 o 抗原单卵形血清重复步骤 3.1.4.1.1 3.1.4.1.3, 直到特定的 o 抗原被定性。
         5. 使用 gi sera 重复 3.1.4.1.1 3.1.4.1.3 的步骤。收集那些维血清反应菌落在管和沸腾在100°c 在干燥浴5分钟。以 12, 000 x 克的速度离心5分钟收集颗粒, 并重复步骤 3.1.4.1.1 3.1.4.1.4, 直到特定的 o 抗原被定性。
      2. h 抗原特性
         1. 在干净的幻灯片上添加一滴 h 抗原多价血清。
         2. 收集一个循环的殖民地与微循环和研磨在血清。
         3. 如果它看起来像流动的沙子, 就去 3.1.4.2.4, 这意味着殖民地对色拉是反应性的。
         4. 使用 h 抗原单卵性血清重复步骤 3.1.4.2.1 3.1.4.2.3, 直到特定的 h 抗原被定性。
            注: 有时可能需要血清诱导来表征第二阶段 h 抗原。如果是这样, 则应执行以下可选步骤。
         5. (可选)在营养琼脂板上加入一滴特异性 h 抗原血清。等待, 直到所有的血清被吸收。
         6. (可选)收集一个循环的菌落与一个微循环, 并传播到板上, 其中特定的 h 抗原血清被吸收。在36°c 时, 在孵化器中孵育18-24。
         7. (可选)使用 h 抗原单卵性血清重复步骤 3.1.4.2.1 3.1.4.2.3 直到第二阶段 h 抗原的特征。
         8. 转到步骤4。
2. 志贺菌pcr 阳性样品
   1. 在板上分离培养
      1. 用微循环收集浓缩前培养的一个回路, 并将其传播到 xld 板或 mac 板上。在36°c 的孵育18–24小时内的孵化器中。
   2. 生化鉴定
      1. 收集可疑的菌落在 xld 板 (光滑, 圆形, 透明和红色的殖民地) 或 mac 板 (光滑, 圆形, 透明和无色的殖民地, 直径2-3 毫米;随着孵育时间的延长, 松内志贺氏菌可能会变大, 变成浅粉色 (图 4)。
      2. 根据仪器的说明, 在自动微生物识别系统中对可疑群体进行生化鉴定。
   3. 血清学表征
      1. 在干净的幻灯片上添加一滴志贺氏菌多价血清。
      2. 收集一个循环的殖民地与微循环和研磨在血清。
      3. 如果它看起来像流动的沙子, 就去 3.2.3.4, 这意味着殖民地对色拉是反应性的。
      4. 使用志贺菌, 重复步骤 3.2.3.1 3.2.3.3, 直到特定的志贺氏菌。
      5. 转到步骤4。

4. 报告

1. 根据上述结果发布正面或负面报告。

该程序用于筛选处理食物和水的人的肛门粪便样本中的沙门氏菌。

在实时 pcr 步骤中, 如图 5a 所示, 在 hex 通道中进行了成功的扩增, 这意味着混合样品对沙门氏菌的治疗呈阳性。然后对单个样本进行了进一步的实时 pcr, 组成了阳性样本。如图 5b 所示, 样本2为正。因此, 选择样本2进行沙门氏菌的引导培养. 在图 5c中, fam 通道中有一个成功的扩增, 这意味着混合样品对志贺氏菌呈阳性。然后进行了进一步的实时 pcr, 发现样本10呈阳性 (图 5d)。因此, 选择样本10进行志贺氏菌的引导培养。

在沙门氏菌的引导培养中, xld 板和沙门氏菌色素性琼脂板分别有粉红色菌落和紫色菌落, 如图 2所示。然后在自动微生物鉴定系统上对这些菌落进行生化鉴定。结果表明, 沙门氏菌是沙门氏菌, 品种不明。因此, 进行了血清学表征 (图 3), 对 o4、o12、hb、h1 2 进行了反应。根据白考夫曼-勒小调计划, 样本2最终被报告为对副伤寒沙门氏菌 b 呈阳性。而对于志贺菌的引导培养, xld 板和 mac 板分别有粉红色的红色和无色菌落, 如图 4所示。然后对这些菌落进行了自动微生物鉴定系统的生化鉴定。结果表明, 这是shigella sonnei。为了证实其特定的血清型, 进行了血清学表征 (图 3), 并对松内二期进行了反应。因此, 样本10最终被报告为阳性的 shigella sonnei 第二阶段。

图 1: 协议的关系图.显示了两个主要步骤, 并以破折号线分隔。请点击这里查看此图的较大版本.

图 2: 在 xld 板和沙门氏菌色原琼脂板上有代表性的沙门氏菌培养结果.在 xld 板上, 有粉红色的菌落, 没有: 没有暗心, 而在沙门氏菌色原琼脂板上, 有紫色的菌落。请点击这里查看此图的较大版本.

图 3: 代表性的血清学表征结果.如果菌落对色拉有反应, 它看起来就像流动的沙子 (左)。否则, 就会混浊 (右)。请点击这里查看此图的较大版本.

图 4: 在 xld 板和 mac 板上具有代表性的志贺菌培养结果。在 xld 板上, 有红色菌落, 而在 mac 板上, 有透明和无色的菌落。请点击这里查看此图的较大版本.

图 5: 具有代表性的实时 pcr 结果.(a) 混合样品的 hex 通道。(b) 单个样品的 hex 通道。(c) 用于混合样品的 fam 通道。(d) 单个样品的 fam 通道。电脑: 正控制。nc: 负控制。请点击这里查看此图的较大版本.

表 1: 使用的引物和探针.提供了引物和探针的名称和序列。

由于沙门氏菌经常与食物中毒和急性胃肠炎的粪便-口腔传播有关, 常规方法要么劳动密集型, 要么耗时⁷、利用实时 pcr 与引导培养相结合, 描述了沙门氏菌筛查的高通量平台。

有几个步骤需要考虑, 以最大限度地提高该平台的能力。第一个是营养肉汤 (步骤 2.2) 中样品的浓缩前步骤。虽然从有明显症状的患者 (如腹泻等) 中采集的粪便样本不需要预浓缩步骤, 但在就业前采集的肛门擦拭样本仍需要一般6小时的浓缩前步骤对处理食物和水的人进行身体检查, 因为这些人主要是健康的或至少是无症状的成年人。如果该协议仅用于沙门氏菌的检测, 则可以在硒石半胱氨酸培养基中进行预浓缩, 以提高敏感性。第二个关键步骤是查明可疑的殖民地 (步骤3.1.3.1 和 3.2.2.1)。粪便样本中存在许多干扰背景菌群, 可能掩盖目标病原体的检测和分离30。因此, 在实验过程中, 应牢记步骤3.1.3.1 和3.2.2.1 中定义的可疑群体的特点。第三个关键步骤是沙门氏菌的血清学表征。由于大多数沙门氏菌含有 h 抗原³¹的第二阶段, 因此需要进行血清诱导。然而, 血清诱导并不总是成功的, 可能需要几轮诱导来确定正确的第二 h 期。

正如我们以前的研究²⁷所证实的那样, 该协议是非常具体和敏感的。该协议的高特异性表现在它的能力上,其中沙门氏菌和其他相关病原体的区别是 27.该协议的检测下限为 10^{4 chuml}和 10^{3 cfuml} , 分别为27, ^与以前的报告⁷,³²相当^,33,34. 如上所述, 如果该议定书仅用于沙门氏菌的检测, 则可通过硒石基斯汀预浓缩来进一步提高沙门氏菌检测的灵敏度. 此外, 该协议还可以将阳性率提高两倍, 显著降低工作负载/中位周转时间²⁷。

与其他 nat 检测类似, 与经典的细菌培养方法相比, 该协议的一个主要局限性是, 该协议只能识别沙门氏菌, 而其他常见的引起腹泻的细菌是省略⁷。相反, 在经典的细菌培养过程中, 如果存在这些细菌, 可以同时识别。该协议的另一个局限性是, 由于序列变异²⁷, 实时 pcr 无法识别沙门氏菌的一些. 然而, 如果出现阴性的实时 pcr 结果的患者与明显的临床症状, 实验室技术人员应注意, 并可能进行其他实验, 以确认结果。在大爆发期间, 我们可以使用单个样本而不是集合样本进行第一轮 pcr 筛选。

总之, 这里提供的协议可以作为沙门氏菌/志贺氏菌筛查的一个有价值的平台。

作者没有什么可透露的。

这项工作得到了珠海科技项目 (赠款编号 20171009e030064)、广东省科技项目 (赠款编号 2015a0202211004) 和综合管理科学技术计划的支持。中华人民共和国质量监督检验检疫局 (补助金编号 2016ik302, 2017ik224)。