Завод микробных взаимодействий: Транскрипционный анализ ответ Bacillus Mycoides картофель корень экссудаты

Цель Протокола, представленные здесь является изучение реакции транскриптомики endosphere изолированные Bacillus mycoides картофель корень экссудата. Этот метод способствует выявлению важных бактериальных генов, участвующих в завод микробных взаимодействий и в принципе применима к другим эндофитов и растений, с незначительными изменениями.

Полезные бактерии завод связанные играют важную роль в поощрении роста и предотвращения болезней растений. Применение rhizobacteria роста растений (PGPR) как Биоудобрения или биоконтроля агентов стал эффективной альтернативой использования обычных удобрений и может увеличить урожайность при низких затратах. Завод микробных взаимодействий зависит от хоста выделяется завод сигналов и реакцией расписка их связанные бактерий. Однако молекулярные механизмы как полезных бактерий реагировать их связанного растительного сигналы полностью не поняты. Оценка транскриптомики реакции бактерий на корень экссудата является мощный подход для определения экспрессии генов бактерий и регулирование rhizospheric условиях. Такие знания необходимо понимать основные механизмы, участвующие в завод микробных взаимодействий. Этот документ описывает подробный протокол для изучения реакции транскриптомики B. mycoides EC18, штамм, изолированные друг от друга от endosphere картофеля, картофель корень экссудата. С помощью последних технологий высокопроизводительного секвенирования этот протокол может выполняться в нескольких недель и производить массовых наборов данных. Во-первых мы собираем корень экссудата в стерильных условиях, после чего они добавляются в б. mycoides культур. RNA от этих культур изолированы с помощью метода фенол/хлороформ в сочетании с комплектом коммерческих и подвергли контроля качества инструмент автоматизированного электрофореза. После виртуализации, проводится анализ данных с помощью веб T-REx конвейера и определены группы дифференциально выраженной генов. Этот метод является полезным инструментом для содействия новым открытиям на бактериальных генов, участвующих в завод микробных взаимодействий.

Растения могут экссудата до 20% углерода, зафиксированной во время фотосинтеза через корни в ризосфере¹, т.е., узкая зона почвы возле корней. Из-за более высокую доступность питательных веществ ризосфере является подходящую среду обитания для различных микроорганизмов, включая поощрение роста растений бактерии. Экссудат корня содержат широкий спектр неорганических соединений как ионы, неорганических кислот, кислорода и воды. Однако большинство из корня экссудата формируется органических материалов, которые могут быть разделены низкомолекулярных соединений и высокомолекулярных соединений. Низкомолекулярных соединений относятся аминокислоты, органические кислоты, сахара, фенольные соединения, жирные кислоты и массив вторичных метаболитов. Высокомолекулярные соединения состоят из белков и слизь^2,3. Ризосфере микроорганизмов можно использовать некоторые из этих соединений как источника энергии для экономического роста и развития. Корень экссудата играют важную роль в формировании rhizobacterial сообщества, поскольку завод выпускал соединений в экссудата может повлиять на поведение связанных ризосферной бактерии, затрагивая экспрессии определенных генов.

Понимание бактериальных ответ на корень экссудата является ключевым шагом в расшифровке механизмы взаимодействия растений микроба. Как бактериальный ответ на завод микробных взаимодействий является продуктом экспрессии генов дифференциальных, могут изучаться с транскриптом анализа. С помощью этого метода, предыдущие исследования определили ряд важных генов, участвующих в завод микробных взаимодействий. В Pseudomonas aeruginosaгенов, участвующих в метаболизме, хемотаксис и тип II секрецию показывали реагировать сахарная свекла корень экссудата⁴. Вентилятор и др. ⁵ изучал транскриптомики профилирование б. amyloliquefaciens FZB42 в ответ на кукурузный корневой экссудата. Их результаты показывают, что, генов, сильно индуцированных корень экссудата, несколько групп участвуют в метаболических путях, касающиеся утилизации питательных веществ, хемотаксис, моторики и не рибосомной синтеза антимикробных пептидов и поликетиды.

Точность этих исследований зависит от коллекции корневых экссудата. Хотя несколько методов описал коллекцию корневых экссудат для различных целей, они требуют сложных инструментов или не выполняются в строго контролируемых условиях^6,,^7,8. Кроме того, ингибирующих ризосфере микроорганизмов могут влиять корень экссудата состав, влияя на завод проницаемости клеточных мембран и повреждения тканей корня, особенно в случае консорциумов микроорганизмов⁹. При расследовании микробной ответ на корень экссудаты, важно использовать четко определенных условиях для того, чтобы избежать изменения соединений от других микроорганизмов¹⁰. Кроме того высокое качество РНК требуется для РНК seq транскриптом исследования. Однако при работе с не модель бактериальных штаммов, стандартные протоколы или коммерческих комплекты обычно имеют низкую эффективность из-за неизвестных факторов или специальных роста свойства.

Протокол, описанные здесь была проверена с помощью б. mycoides, который является грамположительных, спорообразующих бактерий Фила Firmicute. Это повсеместно в ризосфере различных видов растений. Несколько свойств поощрение роста растений были зарегистрированы для этого вида, в том числе индукции систематического сопротивления (ISR) в сахарной свеклы¹¹, ингибирование затухания от возбудителя Pythium огурец¹², а также азота Фиксация в ризосфере подсолнечника¹³. Однако молекулярные механизмы взаимодействия с растения-хозяина не хорошо изучены.

Цель экспериментов, представленные здесь является изучение реакции транскриптомики изолированные endosphere B. mycoides картофель корень экссудата. Иными словами, протокол состоит из следующих этапов: во-первых, собирать картофель корень экссудата в стерильных условиях. Затем извлечь РНК высокого качества из бактериальных клетках, обработанных с корневой экссудата. Последним шагом является анализ данных, с помощью конвейера T-REx веб-¹⁴. Этот протокол был использован для идентификации генов б. mycoides , которые показывают изменения в уровнях выражения при контакте с корня экссудата и таким образом могли бы играть важную роль в завод микробных взаимодействий.

1. прорастания картофеля в стерилизованные условиях

1. Промойте поверхность картофеля с стерильной водой. Искупайте картофеля в 70% этанола, а затем в 3% гипохлорита натрия, 5 мин. Промойте его снова с стерильной водой, чтобы удалить любые оставшиеся гипохлорита натрия.
2. Подготовить материалы, необходимые для прорастания и выращивания клубней картофеля; стерилизовать пластиковые горшки, приживления корзины, вермикулита и воды путем автоклавирования их при температуре 121 ° C 20 мин.
   Примечание: Убедитесь, что все материалы, используемые, автоклавируемый. В противном случае используйте другие методы стерилизации.
3. Поставьте стерилизовать поверхности картофеля в приживления корзину и это в газобетона горшок, содержащие мокрой вермикулит.
4. Держите горшок в климатической камере при температуре 24 ° C в течение трех недель. Установите его на циклах 16 h света (120 мкмоль м^-2s^-1) и 8 h тьмы. Во избежание микробного загрязнения, используйте большие стеклянные волокна для покрытия горшок.

2. сбор картофеля корень экссудаты

1. Когда ростки прорастают, передачи корзину с весь картофель в стерилизованные стакан заполнены с 150 мл газобетона деионизированной воды, с картофелем клубни помещен чуть выше поверхности воды и корни погруженной в воду (см. Рисунок 1). Держите саженец в климатической камере и использовать те же параметры как и раньше [24 ° C; циклы 16 ч света (120 мкмоль м^-2s^-1), 8 h тьмы].
2. Со второго дня на сбор воды, содержащие экссудата и пополнить стакан с стерильных деионизированной водой. Выполнение выборки каждый день до седьмого дня после передачи саженец.
3. Храните каждый образец отдельно при 4 ° C. Для каждого образца, распространение 100 мкл на Лурия Бертани (LB; триптон 1%, 0,5% экстракт дрожжей, 0,5% NaCl) плита агара для проверки микробиологических загрязнений. Отбросить загрязненных образцов.
4. Объединить собранные образцы один саженец и сконцентрировать их, для них при-40 ° C до окончательный объем 150 мл.

3. рост бактерий

1. Полоска штамм B. mycoides от-80 ° C глицерин запас на плиту LB агар и инкубировать пластину на 30 ° C на ночь.
2. Прививок LB жидкой среде с одной колонии от плиты и расти в культуре в тряску инкубатор на 200 об/мин на ночь на 30 ° C.

4. лечение и выборки бактерий

1. Для сравнения кривая роста бактерий, угощали отрицательный контроль с корневой экссудаты, подготовьте серию флаконов, содержащих 50 мл жидкой среды LB. Добавить 0,5 мл на ночь бактериальной культуры все колбы и добавьте 0%, 5%, 10%, или 15% (v/v) корня экссудата или стерильной деионизованной воды в среднесрочной, соответственно.
2. Использование культуры с дейонизированной водой вместо корня экссудата как элемент управления. Измеряют оптическую плотность на 600 Нм (₆₀₀OD) каждые 1 час позже. Создание кривой роста путем построения значения₆₀₀ ОД против времени.
   Примечание: Мы увидели, что 10% экссудата корень не влияет на рост B. mycoides (см. Рисунок 2); Этот показатель был использован для РНК seq экспериментов.
3. Разбавить ночь культуры B. mycoides с 90 мл подогретым LB средних первоначального ОД₆₀₀ ~ 0.05 в 300 мл флакон. Добавить 10 мл корень экссудата в культуре и Инкубируйте на 30 ° C в течение 1 ч.
4. Используйте для лечения 10 мл стерильной деионизованной воды как элемент управления. Сбор от культуры клетки центрифугированием при 9000 x g на 2 мин при 4 ° C. Отбросить супернатанта и немедленно заморозить гранулы в жидком азоте, то храните его при температуре-80 ° C до использования.

5. РНК изоляции

Примечание: Перед началом изоляции, подготовить верстак, стойки и пипетки, очищая их раствором обеззараживания РНКазы (см. Таблицу материалы). Надевайте перчатки на все время и убедитесь, что все трубы, советы и решения РНКазы бесплатно. Всегда держите образцы на льду, когда это возможно.

1. Добавить 0,1% (v/v) диэтиловым pyrocarbonate (DEPC) ультрачистая вода (100 мкл DEPC в 100 мл раствора), смешайте это хорошо и держать его при комнатной температуре на ночь. Автоклав смесь для инактивации DEPC после лечения на ночь. Используйте этот DEPC-лечение ультрачистая вода для подготовки TE буфера [10 мм трис-HCl (рН = 8); 1 мм ЭДТА] и 10% раствор SDS (w/v).
2. Оттепель клетки окатышей на льду и приостановить в 400 мкл буфера TE (DEPC). Перенесите суспензий в 2 мл трубы колпачок.
3. Премикс 300 мкл хлороформ изоамилового спирта (24:1 v/v) и 300 мкл фенола (кислоты фенола, класс РНК) и дайте смеси настояться 5 мин. Возьмите 500 мкл органических верхнего этапа для добавления в ресуспензированы клетки. Затем добавьте 50 мкл 10% SDS и 0,5 г в стеклянных шариков (0,5 мкм) в трубку.
4. Плотно закройте крышку и поместить трубку в гомогенизатор мельницы (см. Таблицу материалы). Выполните 3 × 45 s пульс гомогенизации с интервалом 1 мин на льду.
5. Центрифугуйте образцы на 10 мин на 11000 x g (4 ° C) и передачи Верхний этап новой трубки.
6. 500 мкл хлороформ изоамилового спирта (24:1) на верхний этап шага 5.5 и центрифуги смесь для 5 мин на 11000 x g (4 ° C).
   Примечание: Следующие шаги были изменены инструкцией производителя Коммерческая стеклянных волокон на основе фильтра РНК изоляции комплект (см. Таблицу материалы).
7. Передать свежие трубки 500 мкл верхнего этапа, добавить 2 тома (1 мл) буфера lysis/привязки и смешайте его закупорить вверх и вниз.
8. Совместить фильтр и коллекции трубок (из комплекта изоляции РНК) и Пипетка смесь из шага 5.7 трубки фильтра. Центрифуга для трубы 15 s на 8000 x g и отмены потока через.
9. Приготовить 1,5 мл microcentrifuge трубы с 100 мкл буфера DNase, 10 мкл DNase I и 5 мкл битор РНКазы (см. Таблицу материалы). Добавить приготовленный раствор смеси на фильтр фильтр трубки и проинкубируйте его за 20-30 мин при температуре 15-25 ° C.
10. Выполните стирки согласно инструкции производителя. Используйте 50 мкл буфера для элюировать РНК.
11. Сохраните eluted РНК-80 ° c и поставьте пластиковые парафин фильм вокруг него. В то же время передать несколько микролитров образца 1,5 мл microcentrifuge трубки для выполнения проверки качества.

6. Проверка качества РНК и последовательности

1. Проверьте РНК с microvolume спектрофотометром.
   Примечание: Коэффициенты поглощения на 260/280 должна быть выше 1.8, и коэффициенты на 260/230 должна быть выше по крайней мере 1.8, предпочтительно выше 2.0.
2. Запуск, очищенный РНК в инструмент автоматизированного электрофорез с помощью анализа РНК рекомендовать комплекта (см. Таблицу материалы); число целостности РНК (Рин) должно быть по крайней мере выше 7, чтобы продолжить.
3. Использовать общее количество 3 мкг РНК за образец для создания библиотек с подготовкой библиотеки РНК-Seq комплекта (см. Таблицу материалы) следуя рекомендациям изготовителя.
   Примечание: Библиотека препараты были виртуализация на платформе высокопроизводительного секвенирования и паре конец чтений были получены.

7. анализ данных с помощью веб-конвейер T-REx

1. Выполнить, качество фильтрации с помощью FASTX-Инструментарий версия 0.0.13 (показатели качества Phred > 20). Трим сырье РНК-Seq считывает из адаптер последовательностей с помощью средства Trimmomatic.
   Примечание: Все ниже по течению анализы были основаны на чистый данных с высоким качеством.
2. Скачать базу данных генома ATCC 6462 NCBI B. mycoides (NCBI присоединение №: CP009692.1) и использовать его как ссылку генома для сопоставления чистого читает, используя Bowtie2/2.2.3.
3. Использование HTSeq v0.6.1 для подсчета числа читает сопоставляется каждый ген и читает за kilobase транскрипт на миллион сопоставленных читает (RPKM) каждого гена, основанный на длину гена и читает граф сопоставлен этот ген.
4. Для анализа данных по трубопроводу T-REx, используйте таблицу RPKM в качестве входных данных, а также три описательного файла: (i) файл факторы описать эксперимент в факторы, (ii контрасты файл, чтобы определить, какие факторы будут сравниваться для экспрессии генов дифференциальной и (iii) файл класса для описания групп генов интерес.
   Примечание: Описательный файлы формата in.txt. Примеры можно найти на веб-странице T-REx (http://genome2d.molgenrug.nl/). Подробная инструкция для анализа данных с помощью T-REx можно найти в предыдущей публикации, де Йонг и др. ¹⁴.

Завод связанные микроорганизмы могут положительно влияют рост растений и здравоохранения. Однако механизмы сложных взаимодействий между растениями и их микробной симбионтами полностью не поняты. Корень экссудата играют важную роль в регулировании деятельности rhizobacterial и поведение, и как правило постулируется, что микробная колонизация корней инициирует с привлечением микробов в корень экссудата. Целью этой работы было расследовать ответ транскриптомики rhizobacterial б mycoides для картофеля корень экссудата. Чтобы выполнить это, клубни картофеля были поверхности стерилизации и проросшие в газобетона вермикулит. Затем корневой экссудата были собраны, как показано на рисунке 1. Чтобы исключить возможность корень экссудаты, влияющих на рост бактерий, до 15% от корня экссудата были добавлены к B. mycoides культуры, и никаких изменений в росте был обнаружен во время измерения (рис. 2). Таким образом изменения выражения гена, наблюдаемые в данном исследовании не были вызваны скорее всего эффектов, связанных с ростом.

После сбора корень экссудата были добавлены B. mycoides культуры в соотношении 10% (v/v), и бактериальная всего РНК был изолирован как описано ранее. РНК затем подвергается проверки качества по автоматизированной электрофорез инструмент которого результаты показаны на рисунке 3. На рисунке 3а и 3B представляют РНК, изолированных от B. mycoides лечили корневой экссудата, а Рисунок 3 c и 3D РНК, изолированных от контрольной группы. Все образцы забил Рин значение выше 9 с две четкие полосы, соответствующий 16S и 23S субблоков РНК, демонстрируя, что высокое качество РНК была получена настоящим Протоколом.

После подготовки библиотека пара конец чтений были получены с помощью высокопроизводительного секвенирования платформы. Сырой РНК-Seq читает были обрезаны из последовательности адаптер и сопоставлены против ссылка последовательности генома. Из полученных данных был создан в таблице RPKM. Транскриптом анализ был выполнен с помощью конвейера T-REx. Коэффициент интенсивности участок всех генов, дифференциально выразил это показано на рисунке 4. По сравнению с элементом управления Добавление картофель корень экссудата индуцированной 715 гены дифференциально выражаться. Из тех 408 гены были upregulated, и 307 гены были downregulated¹⁵. Относительное изменение некоторых генов с измененное выражение перечислены в таблице 1.

Рисунок 1: схема процесса сбора картофеля корень экссудата. Материалы, используемые, газобетона и всхожесть выполняется в климатической камере. Вымойте клубней картофеля с стерилизации воды и баня в 2-3% NaOCl, за 5 мин ванны его в 75% этанола для еще 5 минут место картофель в корзину для газобетона и положить его в кастрюлю содержащие мокрой вермикулит. Растут картофель в климатической камере для 3-4 недели и затем передать корзину с Рассада картофеля в стакан. Сбор корня экссудата каждый день и пополнить стакан с водой стерилизовать. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: Рост кривая б mycoides с различной концентрации картофель корень экссудата. Штамм EC18 был выращен в жидкой среде LB с добавлением картофеля корень экссудата или стерильной H₂O. од₆₀₀ был измеряется каждый 1 час и заговор против времени. Все группы показывают аналогичные модели роста, указывая, что до 15% сложения экссудата корневого имеет не существенное воздействие на рост B. mycoides . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: Проверка качества РНК инструмент автоматизированного электрофорез. A и B представляют РНК, изолированных от B. mycoides относились с корневой экссудата и C и D представляют РНК, изолированных от контрольной группы. Все образцы РНК показывают две четкие полосы, соответствующие 23S и 16S рРНК и слабой 5S рРНК группа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: коэффициент интенсивности участок для визуализации выражение дифференциального гена РНК seq образцов б. mycoides в ответ на картофель корень экссудата. Фигура автоматически генерируется T-REx. Ось x представляет уровень выражения гена, и оси y представляет изменение преобразованы log2 раза. Гены вверх - и downregulated имеют положительные и отрицательные log2 соотношение значения. Точки в районе полосатый указывают генов, которые не являются значительно над или под выразил. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1: Список дифференциально выраженной генов корневой экссудата лечение группы по сравнению с элементом управления.

Завод микробных взаимодействий было предположить, чтобы определяться тонкое равновесие между бактерий и растений. Такого взаимодействия являются очень сложными и трудно изучать в природные системы, которая включает различных видов микроорганизмов, потенциально действуя как консорциумы. Этот документ описывает упрощенный протокол к изучению бактериальных ответ на корень экссудата в строго контролируемых условиях. Транскриптом профиль rhizobacteria, под воздействием корень экссудаты, содержится подробная информация о бактериальных адаптации в ризосфере нишу. Этот корень экссудата коллекции протокол не требует сложных процедур и специализированного оборудования. Однако все процедуры должны осуществляться в строго стерильных условиях и стерильности управления должны быть включены. Мы рекомендуем растет несколько клубней картофеля параллельно и сброса загрязненных те. Этот протокол может внести изменения, если в настоящее время изучаются другие виды растений. Важно использовать соответствующий метод стерилизовать любые семена/клубней, потому что они могут отличаться в терпимости к дезинфицирующим применяется.

Получив корень экссудата, РНК высокого качества должны быть изолированы от бактериальных клеток. Времени¹⁶различных реагентов и стандартные протоколы, которые основаны главным образом на фенол/хлороформ или метод Тризол. Коммерческих комплекты главным образом предназначены для модельных организмов, но менее применимы к другим. Этот Протокол изоляции РНК, который сочетает в себе метод фенол/хлороформе и РНК изоляции комплект преодолевает недостатки этих методов. Кроме того шарик избиение шаг включен для гомогенизации B. mycoides клетки, которые обычно накапливать в планктонных культуре. Потенциальное загрязнение ДНК удаляется путем дополнительных инкубации с DNase до элюции. Высокое число Рин предполагает изоляцию нетронутыми РНК. Таким образом этот протокол является особенно эффективным и сэкономить время для окружающей среды бактериальных штаммов.

После последовательности РНК, с T-REx, веб-статистического анализа трубопровода для РНК seq ген выражение данных¹⁴проводится анализ данных. Этот трубопровод является удобной для пользователей, особенно для биологов без ведома обширные биоинформатики. Входной файл является сырье РНК выражение уровня данных, например RPKM, фрагменты за kilobase за миллион сопоставленных читает (FPKM), сиг / миллион сопоставленных читает (CPM), или другие единицы выражение гена. Такие файлы значение выражения гена может быть порождена имеющихся средств, включая SAMtools¹⁷, BEDtools¹⁸и¹⁹NGS-Trex. Чтобы запустить анализ РНК seq, необходимы три других входных файлов. Эти файлы используются для определения факторов, которые описывают эксперименты и реплицирует, сравнение различных экспериментальных условиях и групп генов интерес. При передаче входных файлов, процесс анализа займет всего пару минут.

Несколько дифференциально выраженной гены EC18 B. mycoides , когда лечили корневой экссудаты, перечислены в таблице 1. Среди них изменяется выражение нескольких генов, кодирующих мембранные белки. Гены, относящиеся к заспорение или процесс проращивания дифференциально выражаются. Также изменения экспрессии генов, участвующих в заспорение B. subtilis когда совместно культивируемых с рисовых саженцев, потому что корень экссудата поставок энергии, необходимой для динамичного роста бактериальных клеток¹⁸. Выражение IclR transcriptional регулятора, которая связана с множественной лекарственной устойчивости и деградации ароматических соединений в почве бактерии, является upregulated. IclR удаления штамм rhizobacteria Klebsiella pneumoniae снизилась солюбилизация минеральных фосфатов, по сравнению с дикого штамма¹⁹. Несколько генов, связанных с метаболизма аминокислот и синтез стимулируются, хотя генов, участвующих в перевозке сахара, включая транспортер PTS Целлобиоза downregulated. Это предполагает, что штамм EC18 могут иметь метаболически предпочтение аминокислоты над сахара в ризосфере. Функция измененных генов может быть далее изучены в situ , сделав нокаутом или гиперэкспрессия мутантов. В резюме описанные здесь протокол позволяет быстро идентифицировать большое количество потенциально важных бактериальных генов, участвующих в завод микробных взаимодействий.

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Мы благодарим Jakob Viel за его полезные замечания и предложения. Мы также благодарим Анн де Йонг за его помощь в анализе биоинформатики. Yanglei-Йи и ли Жибо поддерживаются Советом стипендии Китая (CSC). Мы благодарим NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (тки-AF-15510) за их финансовую поддержку в предустановочный набор OPK.