植物と微生物の相互作用: ジャガイモ根分泌物に細菌 Mycoidesの転写応答

ここで提示されたプロトコルの目的は、ジャガイモ根分泌物への endosphere 分離細菌 mycoidesのトランスクリプトーム応答を勉強することです。このメソッドは、植物と微生物の相互作用に関与する重要な細菌の遺伝子の識別を容易にしは、原則として他のエンドファイトと植物で、細かな調整に適用されます。

プラント関連の有益な細菌は、成長を促進し、植物の病気を防止する重要な役割を果たします。生物肥料や防除剤として植物生育促進根圏細菌 (PGPR) のアプリケーションは従来の肥料の使用に効果的な代替となって、低コストで作物の生産性を高めることができます。植物・微生物相互作用はホスト植物分泌シグナルとここに至ってその関連細菌反応に依存します。しかし、どのように有益な細菌の分子機構は信号が完全に理解されていない、関連付けられている植物由来に応答します。根分泌物に細菌のトランスクリプトームの応答を評価する、細菌の遺伝子発現と根の条件の下で規制を決定する強力なアプローチです。そのような知識は、植物と微生物の相互作用に関与する基になるメカニズムを理解する必要です。本稿では、 B. mycoides EC18、ジャガイモの endosphere から分離されたジャガイモ根分泌物系統のトランスクリプトーム応答の研究に詳しいプロトコルについて説明します。最近の高スループット シーケンス技術の助けを借りて、いくつかの数週間、生産大規模なデータセットでこのプロトコルを実行できます。まず、 B. mycoides文化にその後追加された無菌条件下での根の分泌物を収集します。これらの文化からの RNA は、市販のキットと組み合わせるし、自動電気泳動装置による品質管理を受けるフェノール/クロロホルム メソッドを使用して分離されます。シーケンス処理の後 web ベースの T-レックス パイプラインでデータ解析が行われる、特異的発現遺伝子のグループが識別されます。このメソッドは、植物と微生物の相互作用に関与する細菌の遺伝子に新たな発見を容易にする便利なツールです。

植物は根圏¹,すなわち, 根に近い土の狭いゾーンに根を通して光合成中固定炭素の 20% まで滲出液を可能性があります。高い栄養アベイラビリティのため根は植物成長促進菌を含む、多様な微生物の適した生息地です。根の分泌物には、イオン、無機酸、酸素、水などの無機化合物の範囲が含まれています。ただし、根分泌物の大半は、低分子化合物と高分子量化合物に分けることができる有機材料によって形成されます。低分子量化合物には、アミノ酸、有機酸、糖、フェノール、脂肪酸、二次代謝産物の配列が含まれます。高分子量化合物は粘液と蛋白質の^2,の³から成っています。根圏微生物は、成長と開発のため、エネルギー源としてこれらの化合物のいくつかを使用できます。根分泌物分泌物の製造工場化合物根関連細菌の挙動に影響を与える特定の遺伝子の発現に影響を与えるので rhizobacterial コミュニティの形成に重要な役割を再生します。

根分泌物に細菌の応答を理解することは、植物と微生物の相互作用メカニズムを解読の重要なステップです。植物・微生物相互作用への細菌の応答は差動遺伝子発現の製品、トランスクリプトーム解析によって学ぶことができます。このメソッドを使用して、以前の研究は、植物微生物相互作用に関与するいくつかの重要な遺伝子を特定しました。緑膿菌、新陳代謝、走化性、およびタイプ II の分泌に関与する遺伝子はテンサイ根分泌物⁴に対応する示されていた。ファンら。⁵はトウモロコシ根分泌物に対して用いて B FZB42 のトランスクリプトームのプロファイル.その結果を示すこと、強く根分泌物によって誘導される遺伝子のいくつかのグループ栄養使用率、走化性、運動性、および非リボソーム合成抗菌ペプチドとポリケチドに関連する代謝経路に関与しています。

これらの研究の精度は、根分泌物のコレクションに依存します。ただし、いくつかの方法は、異なる目的のため根分泌物のコレクションを説明した、洗練された楽器を要求または制御された条件^6,7,8で実行されていません。また、根を阻害する微生物に影響を与えるルート滲出液組成植物細胞膜の透過性に影響を与える微生物⁹のコンソーシアムの場合は特に、根組織の損傷と。根分泌物に微生物の応答を調査するとき他の微生物¹⁰によって化合物の変質を避けるために明確に定義された条件を使用することが重要です。さらに、高品質の RNA が RNA シーケンス ベースのトランスクリプトーム研究必要です。しかし、非モデル細菌株を扱う場合、標準プロトコルまたは商業キット通常ある未知の要因または特別な成長プロパティによる低効率

ここで説明されているプロトコルは、Firmicute 門のグラム陽性、胞子形成菌であるB. mycoidesを用いて検証しました。様々 な植物の根圏におけるユビキタスです。いくつか植物成長促進プロパティは、テンサイ¹¹、枯病菌Pythiumキュウリ¹²として窒素の抑制の組織的な抵抗 (ISR) の誘導を含め、この種の報告されています。ヒマワリ根¹³で固定。しかし、宿主植物との相互作用の分子メカニズムはよく研究されていません。

ここで示した実験の目的は、ジャガイモ根分泌物への免震 endosphere B. mycoidesのトランスクリプトーム応答を研究することです。一言で言えば、プロトコルは次の手順で構成されています: 最初に、無菌条件下でジャガイモ根分泌物を収集します。その後、根分泌物細菌細胞から高品質の RNA を抽出します。最後の手順は、web ベースの T-レックス パイプライン¹⁴を使用してデータ分析です。このプロトコルは、根分泌物との接触時に発現レベルにシフトして表示し、したがって植物微生物相互作用に重要な役割を果たす可能性があります* mycoides遺伝子を識別するために使用されました。

1. 滅菌条件でジャガイモの発芽

1. 滅菌水とジャガイモの表面を洗い流してください。ジャガイモの 70% のエタノールで、3% ナトリウム次亜塩素酸、5 分間の入浴します。あらゆる残りのナトリウム次亜塩素酸を削除する滅菌水でもう一度すすぎます。
2. 種子の発芽と成長するジャガイモ塊茎; に必要な材料を準備します。プラスチックの鉢は、生着バスケット、バーミキュ ライトを殺菌し、20 分 121 ° C のオートクレーブによる水します。
   注: は、オートクレーブを使用されるすべての材料にされますを確認します。そうでなければ、他の殺菌方法を使用します。
3. 生着バスケットに表面殺菌したジャガイモを入れて、湿バーミキュ ライトを入れたオートクレーブ ポットでこれを置きます。
4. 3 週間気候室 24 の ° c のポットを維持します。16 h (120 µmol m^-2の^-1) 光と闇の 8 h の周期に設定します。微生物汚染を避けるためには、するのにには、鍋をカバーするのに大きいガラス繊維のボックスを使用します。

2. ジャガイモ根分泌物の収集

1. ジャガイモの塊茎が水の表面や根のすぐ上に配置が水に沈めて芽スプラウト、転送滅菌ビーカーに全体のポテトのバスケットのオートクレーブ脱イオン水 150 mL でいっぱいになる、(図 1参照)。気候室で苗し同じ設定を前に [24 ° C; 光 (120 µmol m^-2の^-1)、闇の 8 h の 16 h のサイクル] を使用します。
2. 2 日目から、分泌物を含む水を収集し、無菌純水でビーカーを補充します。サンプリングを実行毎日苗を転送した後 7 日目まで。
3. 4 ° C で個別に各サンプルを保存します。各サンプルの広がるルリア ベルターニカミラに 100 μ L (LB; 1% トリプトン、0.5% 酵母エキス、0.5 %nacl) 寒天培地微生物汚染をチェックします。汚染されたサンプルを破棄します。
4. 1 つの苗の収集のサンプルを組み合わせて、-40 ° C ~ 150 mL の最終巻でそれらを凍結乾燥によってそれらを集中します。

3. 成長する細菌

1. LB 寒天培地プレート、-80 ° C のグリセロール ストックからB. mycoidesひずみを連勝し、30 ° C でプレートを一晩インキュベートします。
2. 板から単一コロニーの LB 液体培地に接種し、30 ° C で一晩 200 rpm で揺れのインキュベーターで培養を成長

4. 治療と細菌のサンプリング

1. ネガティブ コントロールに根分泌物と扱われる細菌の成長曲線を比較するには、LB 液体培地 50 mL 含むフラスコのシリーズを準備します。すべてのフラスコに一晩培養 0.5 mL を追加し、0%、5%、10%、15% (v/v) 根滲出液または滅菌脱イオン水を媒体にそれぞれ追加します。
2. コントロールとして、根分泌物ではなく脱イオン水でカルチャを使用します。600 の光学濃度を測定 nm (外径₆₀₀) ごとの 1 時間後。外径₆₀₀値対時間をプロットして成長曲線を生成します。
   注: 根分泌物の 10% がB. mycoidesの成長に影響を及ぼさないとしました (図 2を参照)。この比率は、RNA シーケンス実験に使われました。
3. 90 mL の初期外径₆₀₀に予め温めておいた LB 培地で一晩B. mycoides文化を希薄化 〜 0.05 300 mL のフラスコの中。文化に根分泌物の 10 mL を追加し、30 ° c 1 時間インキュベートします。
4. 10 mL の脱イオン水を無菌治療をコントロールとして使用します。文化から 4 ° C で 2 分間 9,000 × g で遠心分離によって細胞を収集します。、上澄みを廃棄し、すぐにペレットを液体窒素で凍結、使用するまで-80 ° C で保存します。

5. RNA の隔離

メモ: 分離を開始する前に準備ワークベンチ、ラック、ピペット、RNase 除染液でそれらを洗浄によって (材料の表を参照してください)。すべての時間の手袋を着用し、すべての管、ヒント、およびソリューションは、RNase フリーかどうかを確認します。常に氷が可能なサンプルを保ちます。

1. 純水 (100 μ L の DEPC あたり 100 mL の溶液) にピロ炭酸ジエチルエステル (DEPC) の 0.1% (v/v) を追加、それを混ぜるし、室温で一晩を維持します。オートクレーブ一晩治療後、DEPC を不活性化する混合物。この DEPC 処理した純水を使用して TE バッファーを準備 [10 mM トリス-HCl (pH = 8) 1 mm EDTA] と 10 %sds (w/v) ソリューション。
2. 氷の上細胞ペレットを解凍し、各テ (DEPC) バッファーの 400 μ L を中断します。2 mL スクリュー キャップ チューブに懸濁液を転送します。
3. プレミックス 300 μ L のクロロホルム ・ イソアミル アルコール (24:1 v/v) とフェノール (フェノール酸、RNA 勾配) 300 μ L、5 分のために立つ混合物を許可します。再懸濁細胞に加える有機上部段階の 500 μ L を取る。チューブに 50 μ L の 10 %sds とガラスビーズ (0.5 μ m) の 0.5 g を加えます。
4. キャップをしっかりと閉めて、ビーズミル ホモジナイザーにチューブを配置 (材料の表を参照してください)。氷で 1 分間隔で 3 × 45 のパルス均質化を実行します。
5. 11,000 x g (4 ° C) で 10 分間のサンプルを遠心し、新しい管へ転送の上部の段階。
6. ステップ 5.5 から上部の段階にクロロホルム ・ イソアミル アルコール (24:1) 500 μ L を追加し、11,000 x g (4 ° C) で 5 分間混合物を遠心分離機します。
   注: 次の手順は、商業ガラス繊維フィルターを用いた RNA の隔離のメーカーの説明書から変更されたキット (材料の表を参照してください)。
7. 新鮮な管に上部の段階の 500 μ L を転送換/結合バッファーの 2 つの容積 (1 mL) を追加し、上下にピペッティングで混ぜます。
8. フィルターおよびコレクション チューブ (からの RNA 抽出用キット) を組み合わせて、ピペットのフィルター チューブに 5.7 のステップからの混合物。15 のチューブを遠心分離機 x g と流れを破棄 8,000 で s。
9. DNase バッファー、DNase の 10 μ L の 100 μ L で遠心チューブ 1.5 mL を準備・ RNase 阻害剤の 5 μ L (材料の表を参照してください)。フィルター チューブのフィルター上に調製した溶液のミックスを追加し、15-25 ° C で 20-30 分間インキュベート
10. 製造元の指示に従って洗濯の手順に従います。50 μ L の溶出バッファーを使用して、RNA を溶出します。
11. -80 ° C で溶離された RNA を保存し、その周りにプラスチック パラフィン フィルムを置きます。同時に品質チェックを実行する 1.5 mL 遠心チューブにサンプルの数マイクロリットルを転送します。

6. RNA の品質チェック ・ シーケンス

1. 微量分光光度計に RNA を確認してください。
   注: 260/280 吸光度比は 1.8、上はず、少なくとも 1.8、2.0 以上できれば上記 260/230 で比をはずです。
2. 実行お勧めします RNA 解析を用いた自動電気泳動装置で浄化された RNA キット (材料の表を参照してください)。RNA の整合性数 (鈴) は、続行する 7 の上以上でなければなりません。
3. ライブラリにある、RNA シーケンスの準備とライブラリを生成する RNA のサンプルあたり 3 μ g の合計量を使用 (材料の表を参照) をキット製造元の推奨事項に従います。
   注: ライブラリの準備された高スループット シーケンス プラットフォームでシーケンス処理し、ペアエンド リードが生成されました。

7. データによる Web ベースのパイプラインの T-レックス

1. FASTX ツールキット バージョン 0.0.13 を使用してフィルタ リング品質を実行 (> 20 の Phred 品質スコア)。Trimmomatic ツール アダプター系列から生の RNA シーケンス読み取りをトリムします。
   注: すべての下流解析は、高品質できれいなデータに基づいていた。
2. B. mycoides ATCC 6462 NCBI ゲノム データベースをダウンロード (NCBI 加盟号: CP009692.1) と Bowtie2/2.2.3 を使用してきれいな読み取りをマッピングするための参照ゲノムとして使用します。
3. 使用 HTSeq v0.6.1 読み取り数字をカウントするのには各遺伝子にマップされ、この遺伝子に遺伝子と読み取りカウントの長さに基づいて百万マップされたリード (RPKM) の各遺伝子の転写産物のプラスミドあたりの読み取り数。
4. T レックスのパイプラインによってデータの分析、3 つの説明的なファイルと同様に、入力として RPKM テーブルを使用: (i) 実験要因 (ii) 遺伝子発現要因を比較する対照ファイルを記述する要素ファイル、および (iii) 興味のある遺伝子のグループを記述するためのクラス ファイル。
   注: 説明のファイル、in.txt 形式です。例は、T-レックス (http://genome2d.molgenrug.nl/) の web ページで見つけることができます。T-レックスを用いたデータ解析の詳細な指示された de Jongら前の文書¹⁴。

プラント関連の微生物は、植物の成長と健康に積極的に影響します。しかし、植物と微生物の共生の間の複雑な相互作用のメカニズムは完全には理解されていません。根分泌物は rhizobacterial 活動と行動の調節に重要な役割を再生し、根分泌物に微生物の魅力と根の微生物のコロニー形成が開始されることを一般に仮定します。この作業の目的は、ジャガイモ根分泌物に rhizobacterial B. mycoidesのトランスクリプトームの応答を調査するためでした。これを満たすため、ジャガイモ塊茎は表面滅菌し、滅菌バーミキュ ライトで発芽しました。その後、図 1に示すように、根分泌物を集めました。B. mycoides文化に追加された 15% 根分泌物の細菌の成長にまで影響を与える根分泌物の可能性を排除するために、(図 2) の測定の時間の間に成長の変化が見つかりませんでした。したがって、本研究で観測された遺伝子発現変動可能性によって引き起こされなかった成長に関連する効果。

コレクションの後、根分泌物率 10% (v/v)、 B. mycoides文化に加え、細菌の総 RNA は、前述したように分離されました。RNA は、これの結果は、図 3に示す、自動電気泳動装置による品質チェックを実施しました。図 3Aと3B B. mycoides根分泌物の処理から分離された RNA を表し図 3および3 D RNA 制御グループから分離されました。すべてのサンプルは、高品質 RNA がこのプロトコルによって取得されたことを示す、16 s ・ 23 s RNA のサブユニットに対応する 2 つの明確なバンド 9 上記リン値を獲得しました。

ライブラリの準備の後ペア終了読み取りは高スループット シーケンス プラットフォームが得られました。RNA シーケンシャルな読み取りはアダプター シーケンスから削除され、参照ゲノム配列に対してマッピングします。結果として得られるデータの RPKM テーブルが生成されました。T レックスのパイプラインとトランスクリプトーム解析を行った。すべての特異的発現遺伝子の比強度プロットを図 4に示します。コントロールと比較してジャガイモ根分泌物の添加は 715 の遺伝子が発現を誘導しました。これらのうち、408 遺伝子誘導と 307 遺伝子だったダウンレギュ レート¹⁵。発現と遺伝子のいくつかの相対的な変化は表 1に示します。

図 1: ジャガイモ根分泌物のコレクションの処理スキーム。使用される材料はオートクレーブ、発芽は気候室で実行されます。滅菌水でジャガイモ塊茎を洗って 5 分でお風呂それ別 5 分場所 75% エタノール ジャガイモ オートクレーブ バスケットに、湿ったバーミキュ ライトを入れた鍋に入れて、2-3 %naocl にお風呂。3-4 週間、気候室でジャガイモを成長し、ビーカーにジャガイモ苗が付いているバスケットを転送します。毎日根分泌物を収集し、滅菌水でビーカーを補充します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: 成長曲線b. mycoidesのジャガイモ根分泌物の濃度の異なる。ひずみ EC18 ジャガイモ根分泌物の添加液 LB 培地で栽培されていたまたは滅菌 H₂o ・外径₆₀₀だったすべての 1 h を測定し、対時間をプロットします。すべてのグループが同様の成長パターンを示すまで示す根分泌物添加の 15% がないB. mycoides成長に重大な影響。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: 自動電気泳動装置による RNA 品質チェックします。AとBはそれぞれ対照群から分離された RNA 根分泌物とCとDを表す扱われるB. mycoidesから分離された RNA。すべての RNA サンプルは 23 秒と 16 s rRNA と弱い 5S rRNA バンドに対応する 2 つの明確なバンドを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: ジャガイモ根分泌物への応答のB. mycoidesの RNA シーケンス サンプルの差動遺伝子発現可視化比強度プロットします。図は、T-レックスによって自動的に生成されます。X 軸は遺伝子発現レベルを表し、y 軸は log2 変換フォールドの変更を。アップとダウンレギュ レート遺伝子は、正と負の log2 比値を持ちます。ストライプ領域内の点を示す遺伝子上または下-発現有意ではないです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

表 1: リスト コントロールと比較して根分泌物投与群の特異的発現遺伝子。

植物・微生物相互作用は、細菌と植物と細かく調整された平衡によって決定されるという仮説があります。このような相互作用は非常に複雑な勉強は難しい自然システムで構成されたコンソーシアムとして潜在的機能、多様な微生物種。本稿では、制御された条件下での根の分泌物に細菌の応答を研究する簡略化されたプロトコルについて説明します。根分泌物への露出に、根圏細菌のトランスクリプトームのプロファイルは、根圏のニッチに細菌の適応に関する詳細情報を示します。この根分泌物コレクション プロトコルは、複雑な手続きや専門的な機器は必要ありません。しかし、すべての手順は、厳密に無菌状態の下で遂行されなければならない、不稔コントロールを含める必要があります。並行していくつかのジャガイモ塊茎を成長し、汚染されたものを破棄することをお勧めします。他の植物種を検討されている場合、このプロトコルは変更することができます。適用殺菌剤耐性の異なる場合もありますので、任意の種子/塊茎を滅菌する適切なメソッドを使用することが重要です。

根の分泌物を取得すると、高品質の RNA は分離の細菌の細胞からをする必要があります。様々 な試薬とフェノール/クロロホルムまたは TRIzol 法に基づく主に標準のプロトコルは、時間のかかる¹⁶です。市販キット モデル有機体のほとんど設計されていますが、他の人にはほとんど当てはまりません。フェノール/クロロホルム法と RNA 抽出用キットを組み合わせたこの RNA の隔離のプロトコルでは、これらのメソッドの短所を克服します。また、ビーズのステップは通常浮遊培養で集約するB. mycoides細胞を均質に含まれています。潜在的な DNA 汚染が溶出する前に DNase と余分な孵化によって削除されます。高鈴の数は、そのまま RNA の隔離を意味します。したがって、このプロトコルは特に効率的で環境の細菌の緊張の時間節約です。

RNA シーケンス処理の後と T-レックス、RNA シーケンス遺伝子表現データ¹⁴web ベースの統計解析パイプライン データ解析が行われます。このパイプラインは豊富な生物情報学の知識がなくても生物学者にとって、ユーザーフレンドリーです。入力ファイルは、raw RNA 発現レベルなど、データ RPKM、百万のマップされたリードの (FPKM)、プラスミドごと百万マップリード (CPM)、または他の遺伝子の発現のユニットごとの数の断片です。SAMtools¹⁷、BEDtools¹⁸、NGS Trex¹⁹など使用可能なツールによってこのような遺伝子発現値ファイルを生成できます。RNA シーケンス解析を実行するために他の 3 つの入力ファイルが必要です。これらのファイルを使用して、実験し、複製し、様々 な実験条件および興味の遺伝子のグループ間の比較を記述する要素を定義します。入力ファイルがアップロードされると、解析プロセスは数分を取るだけ。

B. mycoides EC18、根の分泌物と扱われる場合の複数の発現遺伝子の表 1のとおりです。その中で、いくつか遺伝子膜蛋白質の発現が変更されます。胞子形成関連遺伝子または発芽工程が発現されます。胞子形成に関与する遺伝子の発現も枯草菌における変更時共同培養苗、根分泌物¹⁸細胞の細菌のダイナミックな成長に必要なエネルギーを供給するため。IclR 転写レギュレータは、多剤耐性と土壌細菌の芳香族化合物の分解に関連する場合の式は、誘導です。IclR 削除根圏細菌クレブシエラ菌は、野生型株¹⁹に比べ、無機リン酸塩可溶化を減少しています。アミノ酸の代謝や合成に関連するいくつかの遺伝子が刺激される, セロビオース PTS トランスポーターを含む糖輸送に関わる遺伝子、ダウンレギュ レート。これは、そのひずみを示唆している EC18 根圏における糖のアミノ酸の代謝好みがある可能性があります。変更された遺伝子の機能はノックアウトまたは過剰発現変異することによって,その場でさらにすることができます。要約すると、ここで説明されているプロトコルは植物と微生物の相互作用に関与する可能性のある重要な細菌の遺伝子の数が多いすばやく識別できます。

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

ありがとうヤコブ ベールを脱いだ彼の有用なコメントや提案。また、アン de Jong はバイオインフォマティクス解析に彼の助けに感謝我々。Yanglei 李 Zhibo Li によって中国奨学金委員会 (CSC) をサポートしています。私たちは NWO TTW Perspectief プログラム Back2Roots に感謝 (TKI-AF-15510) OPK を金融支援。