Выявление и количественная оценка Plasmodium falciparum в водный красных кровяных клеток, ослабленных общее отражение инфракрасной спектроскопии и многомерного анализа данных

Здесь мы представляем собой протокол для выявления и количественной оценки Plasmodium falciparum в зараженных водный красных кровяных клеток, используя аттенуированные полного отражения инфракрасного спектрометра и анализа многомерных данных.

Мы демонстрируем метод количественной оценки и выявления паразитов в водный красных кровяных телец (эритроцитов), используя простой benchtop ослабленных общее отражение Фурье преобразование инфракрасного (ATR-FTIR) спектрометра в сочетании с (многомерный анализ данных MVDA). 3D 7 P. falciparum были культивировали 10% паразитемии кольцо стадии паразитов и используется для всплеска эритроциты свежие доноров изолированы для создания разрежения серии между 0-1%. 10 мкл каждого образца были помещены на центр ATR алмазов окна для получения спектра. Образец данных лечился улучшить соотношение сигнал-шум и для удаления воды, и затем вторая производная был применен для решения спектральной функции. Данные затем были проанализированы с использованием двух типов MVDA: первый анализ главных компонент (PCA) чтобы определить любые промахи и затем частичной регрессии методом наименьших квадратов (PLS-R) построить модель количественной оценки.

Малярия является одним самых разрушительных болезней нашего времени; более половины населения живет на риск в эндемичных регионах и он непропорционально бремя бедных^1,2,3,4. Большая часть этого вопроса является бессимптомных носителей и ранней стадии пациентов, которые выступают в качестве резервуаров для комаров векторов⁵, вызывая пики инфекции во влажных сезонов и позволяет ему сохранять в общинах. Малярия вызывается пять Plasmodium паразитов, наиболее смертоносной из которых является P. falciparum , который приводит к наиболее тяжелая форма болезни².

В настоящее время методов для диагностики малярии менее совершенны. Оптическая микроскопия, текущего золотого стандарта, может определять только 62-88 паразитов/мкл в зависимости от используемого метода⁶. Кроме того, из-за интенсивность и высокие навыки, необходимые, в многих регионах микроскопия misdiagnoses > 50% случаев, особенно с низкой паразитемии уровней², которые можно непосредственно отнести отсутствие ресурсов в этом районе и результаты в злоупотребление противомалярийных препаратов. Другие 2 основные диагностические методы являются диагностические экспресс-тесты (БДТ), которые используют антитела для обнаружения и анализы полимеразной цепной реакции (ПЦР), которые являются дискриминационными и количественно паразитов из ДНК. В настоящее время БДТ только способны обнаруживать P. falciparum и P. vivax по крайней мере 100 паразитов/мкл крови, что приводит к редких форм этого заболевания лечить. ^{7 , 8} в отличие от этого, анализы ПЦР дискриминацию и количественно разных видов плазмодия чувствительность 0.0004-5 паразитов/мкл крови. Однако он требует дорогостоящих реагентов, оборудования и технических навыков и таким образом не подходит для области применения.

Очень чувствительной, надежной и доступной техника имеет важное значение для улучшения диагностики раз и таким образом улучшение результатов лечения пациентов и возможность ликвидации болезни. Ослабленная общее отражение Фурье-спектроскопии преобразования (ATR-FTIR) предлагает потенциальным решением этой проблемы. Предыдущие работы показал, что возможности для выявления и количественной оценки P. falciparum в метаноле фиксированной мазков крови, достижение пределов обнаружения из < 1 паразитов/мкл крови (< 0,0002% паразитемии)⁹, которая сопоставима с методами ПЦР. Недавние исследования показали, что это возможно для выявления и количественной оценки паразитов водных проб и таким образом устранить на этапе фиксации. Однако такие факторы, как водяной пар, спектральные шума и обработки данных необходимо принимать во внимание для достижения оптимальных результатов¹⁰.

Этот протокол имеет целью показать новых пользователей как приобрести ATR-FTIR спектры и подготовить модель регрессии для обнаружения P. falciparum от водных проб эритроцитов (РБК)¹⁰.

Пожалуйста проконсультируйтесь с соответствующим безопасности листы (MSDS) и искать соответствующую подготовку по биобезопасности уровня 2 (BSL-2). Все культивирования шаги должно быть сделано в кабинете BSL-2 с помощью асептической техники, значит, есть риск воздействия вредного УФ-излучения от дезактивации шаги, игла палку травм и потенциального воздействия на биологические и инфекции, если паразит культуры вводит любых травм. Кроме того запасов крови от банков крови только экранированные для некоторых заболеваний и потенциал для распространения кровь болезней является потенциальный риск. Добиваться немедленной медицинской помощи в возникновении травмы.

1. Подготовка и измерение 3D 7 серии разрежения паразит Plasmodium falciparum

Примечание: Plasmodium sp. культура является весьма чувствительным. Использовать свежие/оставшийся реагентов и регулярно кормить паразитов, изменив средств массовой информации. Кормовых культур, ниже 5% паразитемии каждый второй день; кормить культур между 6-10% паразитемии один раз или два раза в день; и кормить культур между 11-20% до 4 раза в день. Паразиты, которые начинают голодать теряют форму и начать контракт. В таком случае кормить и разбавленных немедленно, изменив СМИ и добавив запасов RBCs. сбор донорской крови в пробирки, содержащие гепарина как антикоагулянт и меру в течение первых 6 ч.

1. Культура в общей сложности 30 мл 7 3D штамм Plasmodium falciparum паразитов согласно стандартному протоколу до тех пор, пока паразитемии достигает 10% кольца.
2. Синхронизация паразитов
   1. 11 ч после shizogeny в жизненный цикл паразита, Ресуспензируйте культуры и передачи в 50 мл Конические трубки с помощью автоматических дозаторов.
   2. Центрифуга культуры на 300 – 400 x g и стандартных лабораторных условиях (25° C и 100 кПа) за 5 мин.
   3. Удалите супернатант составление с пипеткой или с помощью пипетки Пастера придает вакуум не нарушая гранулы. Выбросите отходов СМИ в Блич 10% раствор.
   4. Медленно добавьте 12 – 15 мл 4% раствора сорбитол Пелле, с использованием автоматических дозаторов и смесь культуры, укупорки и инвертирование трубку до тех пор, пока культура является однородной.
   5. Инкубируйте культуры при 37 ° C 15 мин.
   6. Центрифуга культуры на 300 – 400 x g и стандартных лабораторных условиях за 5 мин.
   7. Как описано в шаге 1.2.3 Удалите супернатант.
   8. Добавить 10-15 мл 0,9% физиологического раствора в гранулах и перемешать решения укупорки и инвертирование трубку до тех пор, пока культура является однородной.
   9. Повторите шаги 1.2.6–1.2.8 дважды больше, чтобы вымыть все остатки сорбитол.
3. Подготовка серии разрежения паразитемии
   1. Вымойте фондовой RBCs как шаги 1.2.6–1.2.9.
   2. Центрифуга для культуры в стандартных лабораторных условиях, фондовая RBCs на 300 – 400 x g 5 мин и отбросить супернатанта как шаг 1.2.3.
   3. Этикетке microcentrifuge трубы как 0%, 0,010%, 0,025%, 0,075%, 0,100%, 0,250%, 0.750% и 1.000% и добавьте 0 мкл, 1 мкл, 2.5 мкл, 7,5 мкл, 10 мкл, 25 мкл, 75 мкл и 100 мкл культуры соответственно с помощью пипетки 0,2-20 мкл.
   4. Добавьте 100 мкл, 99 мкл, 97,5 мкл, 92,5 мкл, 80 мкл, 75 мкл, 0 и 25 мкл запасов RBCs трубки помечены 0%, 0,010%, 0,025%, 0,075%, 0,100%, 0,250%, 0.750% и 1.000%, соответственно.
   5. Центрифуга свежие донорской крови, собранные в антикоагулянт трубы на 1200 x g и стандартных лабораторных условиях за 10 мин.
   6. Удаление плазмы, составление с пипетки и отменяя как описано в шаге 1.2.3.
   7. 900 мкл изолированных эритроцитов в каждую пробирку microcentrifuge и тщательно перемешать, инвертирование 10 x.
4. Спектральные приобретение
   1. Использование сопровождающих спектральных приобретения программы, нажмите кнопку «Настройки документа» и задайте параметры сбора данных на следующие: 128 сканирование для фона; 32 сканирование для образца; и резолюцию 8/см в диапазоне Максимальная образец документа.
   2. Установите температуру ATR-ФУРЬЕ-спектрометр за рекомендации изготовителя или на ночь.
   3. Очистите кристалл, нежно очистка круговыми движениями с помощью Линт бесплатно салфетки, смоченной ультрачистая вода. Затем тщательно высушите другой свободный протрите Линт.
   4. Возьмите измерения фон воздуха, нажав кнопку «Фон измерение». Каждые 20 минут, чистый кристалл как шаг 1.4.3 и повторите это измерение.
   5. Откройте жить, нажав кнопку «Предварительный просмотр». Соблюдайте плоская, горизонтальная базовых, указывающее, что кристально чист.
   6. Пипетка 10 мкл деионизованной воды непосредственно на середине кристалла и нажмите кнопку «Мера образец». Повторите измерение этой воды после каждого пятого образца.
   7. Сухие кристалл, с использованием Линт бесплатно wipe и нежные круговые движения.
   8. Пипетка 10 мкл пример и нажмите кнопку «Мера образец».
   9. Очистите Хрустальный между образцами как шаг 1.4.3.
   10. Повторяйте до тех пор, пока 3 реплицирует приобретаются, убедившись в случайном порядке образцов и реплицирует.

2. многомерных данных анализа (MVDA)

Примечание: Данные лечение должно быть сделано за весь набор данных для того, чтобы избежать шума и добавления вершины-биологического происхождения. В отличие от анализа над биологически соответствующих регионов: 2980-2800/см и 1750-850/см.

1. Обработка данных
   Примечание: Две программное обеспечение, например, Matlab (далее Программное обеспечение 1) и X Группировальная машина (далее Программное обеспечение 2) используются в качестве примеров для MVDA. Программное обеспечение 1 имеет возможность выполнять MVDA без добавления графического интерфейса пользователя (GUI). Однако рекомендуется приобрести GUI (Таблица материалов). Следующие инструкции когда ссылаясь на программное обеспечение 1 будет предположить, что в сочетании с коммерчески доступных инструментов GUI, и прилагается пример сценария обработки данных.
   1. Откройте программное обеспечение для анализа соответствующих многомерных данных, нажмите кнопку «Импорт данных» и выберите тип файла для анализа.
      1. В программное обеспечение 1 Ввод «Анализ» в окно команд, чтобы открыть графический интерфейс. Щелкните правой кнопкой мыши поле X, чтобы найти «Импорт данных».
      2. В программное обеспечение 2 перейдите на вкладку «Файл», чтобы найти «Импорт».
   2. Импорт образцов, вода и базовые спектры как наборы данных в рабочую область, выбрав все спектры в каждом наборе отдельно и нажав «Открыть» и дать каждому набору короткое имя, например, «Ват» для набора воды спектров.
   3. Выберите новую таблицу/матрица, нажав кнопку «Новая матрица/вектор» и генерировать вектор n × 1, где n — это количество выборок. Ввод паразитемии каждого образца и дать имя «Паразитемии» вектор.
      1. В программное обеспечение 1 нажмите кнопку «Новая переменная» в окне командной строки.
      2. В программное обеспечение 2 щелкните значок «Новый Matrix».
   4. Печать данных, нажав кнопку «Печать данных значок». Осмотрите спектры для водяного пара эффектов, нажав кнопку «Масштаб» и масштабирование на 1800-1400/см; наиболее четко прослеживается как короткий, резкий, узкие пики вдоль склонов в Амида я и амидной группы II.
   5. В случае экстремальных водяного пара откройте вкладку Правка/предварительного-процессных данных и выберите пункт «Сглаживание». Уменьшить шум и/или сильной водяной пар взносов путем сглаживания образца и воды спектры с использованием до 25 точек сглаживания или использовать метод коррекции водяного пара.
   6. Правильно-горизонтальные базовый с помощью базовой коррекции алгоритма, если это уместно, на вкладке Правка/предварительного-процессных данных же шаге 2.1.4.
   7. Средняя спектров воды и скопируйте матрица размера m n × эквивалентна образца набора данных строки и сократить его до 70% интенсивности, умножив его на 0,7.
      1. В программное обеспечение 1 сделать это в окне команд, вводя следующий сценарий «AverageWater=mean(WaterDataset)». Затем скопировать вставить строки соответствует образец набора данных. Чтобы уменьшить интенсивность, ввод «AverageWater70 = AverageWater * 0,70».
   8. Вычтите среднее воды спектров от каждого образца спектра.
      1. В программное обеспечение 1, сделать это в окне команд путем ввода следующего сценария «WaterCorrectedData = SampleDataset-AverageWater70».
   9. Откройте вкладку Правка/предварительного-процессных данных, чтобы применить второй производной функции и затем нормализовать данные, выбрав функцию одной нормальной варьировать (SNV) и означает центр данных.
      1. В программное обеспечение 1 сделайте это в одном дыхании. Сначала выберите «Дериватив» и 25 точек ввода сглаживания, полином порядка 3 и производной порядка на образце с помощью 25 точек сглаживания и функцию Савицкий Голея. Затем выберите «SNV» и «Означает центр». Нажмите кнопку «Хорошо/применить».
   10. Откройте вкладку Правка/предварительного-процессных данных и в «Столбец переменные», выберите 2980-2800/см и 1750 – 850/см, убедившись, что галочкой только их коробки.
2. Анализ данных
   1. Анализ основных компонентов (PCA)
      1. Нажмите кнопку «анализ | Разложение» и выберите PCA.
         1. В программное обеспечение 1 нажмите кнопку «Создать модель».
         2. В программное обеспечение 2 PCA методы ввода. Ввод оптимальное количество основных компонентов (шт.) - в этой работе, 7 - и максимум 100 итераций и выберите перекрестной проверки для проверки метода. Нажмите «Запустить».
      2. Наблюдать за предел доверия 95%, пунктирная кольцо, на участке счеты между PC1 и PC2.
      3. Марк образца спектры с количеством баллов, которые происходят вне предела как потенциальных останцы, используя «Выберите спектры инструмент».
      4. Если отмеченные спектры имеют высокие значения² Hotellings T и высокой остатков Q исключить их из дальнейшего анализа.
   2. Частичный метод наименьших квадратов регрессии (PLS-R)
      1. Нажмите кнопку «анализ | Регрессия» и выберите «PLS-R».
         1. В программное обеспечение 1, щелкните правой кнопкой мыши блока Y и выберите вектор «паразитемии | Построить модель».
         2. В программное обеспечение 2 PLS-R методы ввода. Выберите векторный «Паразитемии» как ссылка на «Y» и образец набора данных как «X набора данных» и выберите перекрестная проверка как метод проверки. Нажмите «Запустить».
      2. Анализ модели регрессии. Значения R² над 0,80 и Корень среднеквадратичной ошибки перекрестной проверки (RMSECV) значения, которые меньше, чем 0.1% паразитемии являются приемлемой модели.
      3. Анализ вектора регрессии и идентификации биологических групп.

Участок частично наименьших квадратов (PLS-R) и его ассоциированных регрессии вектор, Рисунок 1a и 1b соответственно, показывают, что сигнал от паразитов являются достаточно отличаются от БС, которые они могут использоваться для формирования модели линейной регрессии, чтобы использоваться для Прогнозирование паразитов в будущих наборах данных.

Надежный, линейная модель PLS-R был сгенерирован с значение R-квадрат 0,87 и корень означает квадрат ошибки (RMSECV) перекрестной проверки паразитемии 0,13%, Рисунок 1a. Повышение уровня паразитемия главным образом связаны с полосы нуклеиновой кислоты, особенно 1042, 1083 1226/см, которые назначаются ν(C=O) от РНК рибоза, ν_s(PO^{4 -}) и ν(PO^{4 -}) соответственно и группе формы Основная часть отрицательных регрессии вектора. Это потому, что эритроциты имеют ядро и таким образом нуклеиновые кислоты сильные показатели для паразитов. Кроме того группа 1226/см указывает, что структура имеет форму B-ДНК, который подчеркивает важность измерения в водный состояние¹². В отличие от паразитов потребляют РБК компонентов, прежде всего гемоглобина, и таким образом в неинфицированных RBCs ожидается высокий белок соотношение липидов как указано бандами липидов на 2913, 2879 и 1397 см^-1 и 1631 и 1555 см^-1 от Амида, я и амидных II режимы^12,13.

Отдельных групп ясно показывают, что сигналы являются истинной биологических групп вместо дифференциация на основе ложных полос-биологического происхождения, таких как водяного пара, которые представляют как узкие и интенсивных полос. В частности присутствие ДНК полос, Таблица 1, можно непосредственно приписываемых паразита^11,12,13. В общем вектор регрессии может интерпретироваться аналогичным образом к нагрузкам в PCA. Группы должны хорошо коррелируют с полосы и сдвиги в оригинальные спектров.

Рисунок 1: PLS-R регрессия участок, (), эритроциты, шипами между 0-1% паразитемии и связанные регрессии коэффициент, (b). Регрессия участок демонстрирует способность модели для прогнозирования паразитемии каждого образца, с известным паразитемии на оси x и предсказал паразитемии на оси y. Коэффициент регрессии описывает вклад каждой группы прогнозирования возможности модели, тем более интенсивными группа больше способствует модель, и таким образом как паразит изменяет химический состав крови. Воспроизведены и изменение от Мартин, м. и др. ¹⁰ с разрешения Королевского общества химии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1: назначения полос коэффициент регрессии PLS-r на спектры малярии шипами БС. В PLSR паразитемии значение, связанное с спектра вычисляется путем умножения препроцессированный спектра вектор регрессии. Таким образом вектор регрессии изображает важность и направление Инфракрасном диапазонах в регрессии. Потому что спектры были предварительно с помощью второй производной, отрицательные полос связаны с выше паразитемии в то время как позитивные полос связаны с низкой паразитемии. Воспроизведены и изменение от Мартин, м. и др. ¹⁰ с разрешения Королевского общества химии.

PLS-R модель находится под наблюдением многомерный метод, который находит линейную связь, Y = bX + E, между прогнозирования переменными X (здесь, поглощения на каждом волновое) и непрерывной переменной Y (здесь, на уровень паразитемии). Короче говоря, модель сочетает в себе переменные в X, чтобы создать новый набор скрытых переменных (ПЗ), которые захватывают дисперсии на X коррелирует с Y и вычисляет вектор регрессии (b), умноженное на новый спектр результаты в оценке значения y. Сила модели могут быть взяты из двух значений: значение R² и значение Корень среднеквадратичной ошибки крест проверки (RMSECV). Бывший описывает линейность модели и, таким образом, надежность (чем ближе он лучше 1) и данные для моделей с значение R² меньше чем 0,8 должны рассматриваться тщательно промахов и шумных данных. Значение RMSECV описывает ошибку, в котором может быть сделан прогноз. Это всегда лучше попробовать и свести к минимуму число насколько это возможно, убедившись в том исключить останцы, внимательно рассматривая данные и убедившись, что там уже столько биологических реплицирует как можно скорее.

Таким образом, важно, что хорошее качество данных приобретаются для построения модели. Подготовка серии разрежения является критически важным; конкретно, убедившись, что каждый образец РБК как однородных, насколько это возможно. С помощью пипетки для разработки и извлечения RBCs несколько раз во время вращая или нежно стряхивая конец пробки microcentrifuge 5 – 10 раз, можно будет избежать несоответствий. В том же ключе важно также, чтобы очистить Хрустальный между выборками для предотвращения загрязнения. С помощью ультра-чистой воды и Линт бесплатно салфетки для чистки кристалл и проверка, что базовый плоский гарантирует, что существует без остатков, которые будут загрязнять следующее измерение образца.

Количество биологических образцов, необходимых для модели, которая применима в поле — по крайней мере 30% условие, которое проверяется с набором данных из такого же числа. Этот значительный объем будет принимать значительную сумму для генерации и таким образом это ограничение технику. Однако как более образцов правильно проанализированы они могут быть добавлены к Прогностическая модель и укрепить его. Таким образом после того, как установлено, модель может стать более точным и может оправдать усилия, необходимые для его настройки.

В зависимости от окружающей среды и инструментария, на которой проводятся измерения могут возникнуть некоторые дополнительные вопросы. Если излучение не полностью заключен в документе, означает либо суставы не герметичные или окно ATR взаимозаменяемы с другими образца отсеков, этанола и водяного пара может загрязнить спектры. Этанол появляется как сильный острый полоса вокруг 1070/см ¹⁴. Этого можно избежать путем измерения пространства, свободного от этанола и дезинфекции инструмента, только когда все измерения проводятся. Паров воды вызвано изменениями в атмосфере и выглядит как небольшой острые положительные и отрицательные пики вокруг 1400 – 1800 выход и 3200-3600/см. Это может быть решена путем увеличения частоты измерений фона и Очистка инструмента с азотом. В тех случаях, где очистка недоступна и водяного пара все еще достаточно сильны сглаживания алгоритмов и водяного пара компенсации могут добавляться к предварительной обработки данных для их удаления.

Этот метод имеет много перспектив для будущего диагностики и результатов лечения пациентов. Во-первых метод в целом очень прост для реализации в том, что образец необходимо только накапаны на кристалл ATR, а затем можно измерить непосредственно и ввода в модель, снижая вероятность ошибки пользователя. Это позволит устранить потребность в высококвалифицированных микроскописта света, который в настоящее время в некоторых регионах Африки отсутствуют². Благодаря простоте, также устраняется потребность в дорогостоящих реагентов и оборудования и таким образом будут диагностические практически бесплатно для пациентов, которая является основным ограничением для ПЦР. Эта комбинация приведет к росту числа пациентов, поступающих для диагностики гораздо раньше и таким образом улучшение результатов лечения пациентов. Этот метод имеет потенциал для чрезвычайно высоким деликатные моменты, которые позволят преодолеть низкой чувствительности БДТ и сможет обнаружить что бессимптомных носителей раньше и таким образом может использоваться как метод скрининга. Кроме того технология имеет потенциал, чтобы быть использованы для других заболеваний, кровь Борне или иным образом, где несколько микролитров или мкг может применяться к кристалл.

Однако в пример модели есть много вещей, которые необходимо решить, прежде чем он может применяться в поле. Перекрестная проверка является одной из-за низкого количества биологических реплицирует и что не идеально; а с отдельной проверки, набор для проверки модели вместо намного лучше. Кроме того RMSECV довольно высока, здесь делает более низкого уровня количественного определения ненадежных. Увеличение числа реплицирует улучшит это значение и должно быть сделано до применения этого метода в поле. Это подтверждается в лабораторных испытаниях⁹, где RMSECV был намного ниже из-за большего размера выборки. В дополнение к этому увеличивая интервал диапазона и точек также улучшит это значение. Для дальнейшего улучшения диагностических возможностей, дикого штаммов P. falciparum следует использовать, как 3D 7 лаборатории штамм P. falciparum и могут представлять различные химический состав из-за различия в фенотипе.

Авторы не имеют ничего сообщать.

Финансирование авторам было предоставлено Австралийский исследовательский совет (стипендий FT120100926 будущее в BRW), национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии (Грант программы и старший стипендий для ИГБ; Начале карьеры стипендии JSR; Инфраструктуры для научно-исследовательских институтов поддержки схемы Грант института Burnet), и оперативной инфраструктуры правительство викторианской государственной поддержки Грант института Burnet. Мы признаем, что г-н Финлей хвостовик для инструментальной поддержки.