熱帯熱マラリア原虫減衰全反射赤外分光法と多変量データ解析による水溶液赤い血球での検出と定量

ここでは、検出及び減衰全反射赤外分光光度計と多変量解析を使用して感染した水溶液赤い血液細胞で熱帯熱マラリア原虫の定量化のプロトコルを提案する.

多変量データ解析 (と共に簡単な卓上型減衰全反射フーリエ変換赤外 (ATR FTIR) 分光計を使用して定量法と水溶液中の赤い血球 (赤血球) の寄生虫の検出を示すMVDA)。3 7マラリア10% 寄生リング ステージ寄生虫に培養、希釈に 0-1 の間にシリーズを作成する分離された新鮮なドナーの赤血球をスパイクに使用 %。10 μ L 各サンプルのスペクトルを取得する ATR ダイヤモンド ウィンドウの中央に置かれました。信号対雑音比を改善するために、水の寄与を削除するサンプル データが扱われ、二次導関数はスペクトルの特徴を解決に適用されます。データは、MVDA の 2 種類を使用して行った: 最初主成分分析 (PCA) とを決定する任意の飛び地、偏最小 2乗回帰 (PLS-R) 計量化モデルを構築します。

マラリアは私達の時間の最も破壊的な病気の中で、します。半分以上の人口の流行地における生活し、貧しい^1,2,3,4の過度に負担。問題の大部分は無症候性キャリアと初期段階患者蚊ベクトル⁵のための貯蔵所として機能するぬれた季節の間に感染症のスパイクを引き起こすとのコミュニティを保持することができます。マラリアは、最も致命的なうちはマラリア病²の最も深刻な形を引き起こす 5 つの原虫が原因です。

現在、マラリアの診断技術は完璧未満です。光学顕微鏡法の現在のゴールド スタンダードのみ 62 88 寄生虫/μ L 使用方法⁶によってを検出できます。集約と高スキルが必要、多くの地域の顕微鏡検査の誤診のためさらに、> 50% 例, 低 parasitaemia との特にそれらレベル²地域で資源との結果の欠如に直接帰することができます。抗マラリア薬の誤用。主な診断の他の 2 つの方法は、検出、およびポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) アッセイの識別し、DNA から寄生虫を定量化するための抗体を利用した迅速診断テスト (RDTs) です。現在、RDTs は放置されている疾患のより稀な形態の結果として血の少なくとも 100 の寄生虫/μ L のp. の vivax マラリアを検出することができるのみ。^7,8対照的に、PCR の試金の識別し、定量化 0.0004 5 の感度でマラリア原虫の異なる種の血液の寄生虫/μ L。しかし、それは高価な試薬、機器、技術的なスキルを必要としては現場への適用のために適していなかった。

機密性の高い、信頼性と手頃な価格の技術は診断時間従って患者の転帰の改善と病気の除去を可能を改善するために不可欠です。減衰全反射フーリエ変換 (ATR FTIR) 分光法では、この問題の潜在的なソリューションを提供しています。前作は検出し、メタノールの検出限界を達成する血膜を固定でマラリアを定量化することが可能だったことを示している < 1 寄生虫/μ L の血液 (< 0.0002% 寄生)⁹PCR 法と対等であります。最近の研究では、検出および水溶液試料中の寄生虫を定量化し、従って固定ステップを排除することが可能であるを示しています。ただし、水蒸気、スペクトルのノイズやデータ処理などの要因は、最適な結果¹⁰の考慮する必要があります。

このプロトコルは、ATR FTIR スペクトルを取得および水溶液赤い血球 (RBC) サンプル¹⁰からマラリアの検出のための回帰モデルを準備する方法を示しています新しいユーザーを目指しています。

適切な製品安全性データ シート (MSDS) に相談し、適切なバイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) 訓練を求めてください。BSL 2 キャビネットの無菌技術を使用して、除染の手順、針棒の傷害、および潜在的な生物学的ばく露と感染から有害な紫外線放射への露出の危険がある場合の意味で養殖のすべての手順を行う必要があります寄生虫文化任意の傷害に入ります。さらに、血液銀行から株式の血がのみ特定の疾患や血液疾患の広がりのための潜在的な危険であります。危害の発生で緊急医療援助を求めます。

1. 調製及び測定 3 7 の熱帯熱マラリア原虫寄生希釈系列

注:マラリア原虫の sp文化は非常に敏感です。新鮮な/有効期限内の試薬を使用して、メディアを変更して、寄生虫を定期的にフィードします。フィードの寄生率 5% 以下文化すべての 2 日目。6-10% 寄生一度か二度日の間文化をフィードします。文化の間に 1 日 4 回まで 11-20% をフィードします。餓死し始めている寄生虫がその形状を失うし、契約を開始します。このような場合は、フィードし、メディアを変更する抗凝固剤と最初の 6 時間以内の測定としてヘパリンを含む採血管の在庫赤血球。 収集ドナー血液を追加することによってすぐに希釈します。

1. 文化 3 7 の 30 mL の合計株標準プロトコルによると熱帯熱マラリア原虫の寄生虫は、寄生率 10% リングに達するまでします。
2. 寄生虫の同期
   1. 寄生虫のライフ サイクルに shizogeny 後 11 h では、文化や自動ピペットを使用して 50 mL の円錐管に転送を再懸濁します。
   2. 300-400 x g と標準的な実験条件 (25 ° C と 100 kPa) 5 分で文化を遠心します。
   3. ピペットで策定またはペレットを邪魔せずに真空に取り付けるパスツール ピペットを使用して上清を削除します。廃棄メディアを破棄すると、10% の漂白剤の解決策に。
   4. ゆっくりと自動ピペットを使用してペレットに 4% ソルビトール溶液 12-15 mL を加え、キャッピング、文化が均質になるまでチューブを反転して文化を混ぜます。
   5. 15 分の 37 ° C で文化を孵化させなさい。
   6. 300-400 x g と 5 分の標準的な実験室の条件で文化を遠心します。
   7. 1.2.3 のステップで説明されているように上清を削除します。
   8. ペレットに 0.9% 生理食塩水 10-15 mL を加え、キャッピング、文化が均質になるまでチューブを反転してソリューションを混ぜます。
   9. 手順 1.2.6–1.2.8 ソルビトールのすべての残党を洗ってさらに 2 回を繰り返します。
3. 寄生率希釈系列の作製
   1. 手順 1.2.6–1.2.9 のように株式の赤血球を洗浄します。
   2. 標準的な実験室の条件、5 分の 300-400 x g でストック赤血球で文化を遠心し、ステップ 1.2.3 のように上澄みを廃棄します。
   3. 0%、0.010%、0.025%、0.075%、0.100%、0.250%、0.750%、1.000% としてマイクロ遠心チューブ用のラベル、0 μ、1 μ L、2.5 μ L、7.5 μ、10 μ、25 μ L、75 μ L、それぞれ 0.2 20 μ L ピペットを使用するカルチャの 100 μ L を追加します。
   4. それぞれ 100 μ L、99 μ L、97.5 μ L、92.5 μ L、80 μ L、75 μ L、株式赤血球の 25、0 μ L をチューブ ラベル 0%、0.010%、0.025%、0.075%、0.100%、0.250%、0.750%、1.000% に追加します。
   5. 1,200 x g と 10 分標準実験室の条件で凝固管で集められた新鮮なドナー血を遠心分離機します。
   6. ピペットの策定と 1.2.3 のステップで説明したようの破棄によってプラズマを削除します。
   7. 各微量遠心チューブに孤立した赤血球の 900 μ L を加え、10 x の反転によって徹底的に混ぜます。
4. スペクトル取得
   1. 付随するスペクトル取得プログラムを使用して、「楽器セットアップ」をクリックして、データ コレクションのパラメーターを次のように設定: 128 スキャン背景;サンプルの 32 スキャン楽器の最大サンプル範囲にわたって 8/cm 解像度。
   2. 製造元の推奨あたり ATR FTIR 分光計の温度を設定または一晩します。
   3. 無料おしりふきは超純水水で湿らせた lint を使用して円動きで優しくスクラブして結晶をクリーニングします。別の糸くず無料ワイプを使用して徹底的に乾燥します。
   4. 「バック グラウンド測定」をクリックして空気のバック グラウンド測定を行います。20 分毎ステップ 1.4.3 のように結晶をきれいにしこの測定を繰り返します。
   5. ライブ ビューを開くには、「プレビュー」をクリックします。結晶がクリーンであることを示すフラット、水平方向のベースラインを確認します。
   6. 結晶の中に直接脱イオン水の 10 μ L をピペットし、「測定サンプル」をクリックして。すべての 5 番目のサンプル後この水の測定を繰り返します。
   7. 糸くず無料ワイプと穏やかな円動きを使用して結晶を乾燥させます。
   8. サンプルの 10 μ L をピペットし、「測定サンプル」をクリックして。
   9. 1.4.3 の手順とサンプル間結晶をきれいに。
   10. サンプルと複製の両方の順序をランダムに確かめる 3 複製が取得されるまで、手順を繰り返します。

2. 多変量解析 (MVDA)

注: データ処理は、データセット全体をノイズと非生物起源の峰の追加を避けるために行う必要があります。対照的に、生物学的関連性の高い地域にわたって分析: 2980-2800/cm と 1750-850/cm。

1. データの処理
   注: 2 つのソフトウェア、例えばMatlab (今後ソフトウェア 1 と呼ばれる) と修復装置 X (今後ソフトウェア 2 と呼ばれる) は、MVDA の例として使用されます。ソフトウェア 1 は、グラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) の添加せず MVDA を実行する能力を持っています。ただし、GUI (資材表) を購入することをお勧めします。ソフトウェア 1 を参照すると仮定するとき次の手順市販の GUI ツールボックスと共に、データの治療例を掲載いたしました。
   1. 適切な多変量データ解析ソフトウェアを開く、「データのインポート」をクリックし、分析用にファイルの種類を選択します。
      1. 1、ソフトウェアの GUI を開くコマンド ウィンドウに「分析」を入力します。「データのインポート」を見つけるために X ボックスを右クリックします。
      2. 2、ソフトウェアの「インポート」を検索する「ファイル」タブをクリックします。
   2. 個別に各セットですべてのスペクトルを選択し「開く」をクリックすると、ワークスペース データ セットとしてサンプル、水およびベースラインのスペクトルにインポートし、短い名前、例えば、 'ワット' 水のスペクトルのデータセットの各セットを与えます。
   3. 「新しい行列/ベクトル」をクリックしてして新しいテーブル/マトリックスを選択し、、n はサンプル数 n × 1 ベクターを生成します。各サンプルの寄生率を入力、名前 '寄生' ベクトルを与えます。
      1. ソフトウェア 1、「新しい変数」コマンド ウィンドウでをクリックします。
      2. 2、ソフトウェアの「新しい表」アイコンをクリックします。
   4. 「プロット データ アイコン」をクリックしてデータをプロットします。1800-1400/cm; 上でズームを「ズーム」をクリックして水蒸気の影響のスペクトルを調べる最も明確に観察されるアミドの斜面に沿って短い、鋭い、狭いピークとして私とアミド II バンド。
   5. 極端な水蒸気の場合、データ編集/前プロセス タブを開き、「スムージング」を選択します。平滑化の最大 25 ポイントを使用してサンプルと水のスペクトルの平滑化による騒音や強い水蒸気の貢献を軽減または水蒸気訂正メソッドを使用します。
   6. 2.1.4 の手順で同じデータ編集/前プロセス タブの下で、適切な場合、ベースライン補正アルゴリズムを使用して適切な非水平ベースライン。
   7. 水のスペクトルの平均サンプル データセットと同じ n × m マトリックスに行をコピーして 70% の濃度に 0.7 を乗じてそれを減らします。
      1. ソフトウェア 1、コマンド ウィンドウで"AverageWater=mean(WaterDataset)"の次のスクリプトを入力することで行います。サンプル データ セットに一致する行をコピー-貼り付けし。入力強度を減らすためには、「AverageWater70 = AverageWater * 0.70」.
   8. 各サンプル スペクトルから平均水のスペクトルを減算します。
      1. ソフトウェア 1 のようにコマンド ウィンドウで次のスクリプトを入力することで"WaterCorrectedData = SampleDataset AverageWater70」。
   9. 2 番目の派生関数を適用と単一正規変量 (SNV) 関数を選択することによって、データを正規化し、センターのデータを意味データ編集/前プロセス タブを開きます。
      1. 1、ソフトウェアの 1 つの移動で行います。「誘導体」と平滑化、3 多項式の次数とスムージングの 25 得点、サビツキー ・ ゴーレイ関数を使用して設定サンプルにデリバティブ順序の入力 25 ポイントを選択最初します。「SNV」と「センター平均」選択します。「大丈夫/適用」をクリックします。
   10. 編集/前プロセス データ] タブを開き、「列変数」のボックスのみがチェックされていることを確認することによって 2,980-2,800/cm と 1,750-850/cm を選択します。
2. データ分析
   1. 主成分分析 (PCA)
      1. クリックして"分析 |分解"と選択 PCA。
         1. ソフトウェア 1、「モデルの作成」をクリックします。
         2. ソフトウェア 2、PCA メソッドを入力します。-のこの仕事は、7 - 主成分 (Pc) の最適な数を入力し、最大で 100 回反復と、検証メソッドの [クロス検証。「実行」をクリックします。
      2. 95% 信頼限界、PC1 と PC2 間スコア プロット上の破線リングを観察します。
      3. 制限外スペクトル「選択ツール」を使用して潜在的な外れ値として発生するスコアを持つサンプル スペクトルをマークします。
      4. マークのスペクトルがある高 Hotellings T²値と残差 Q 高除外するそれらさらに分析から。
   2. 偏最小 2乗回帰 (PLS-R)
      1. クリックして"分析 |回帰"と選択"PLS R"。
         1. ソフトウェア 1、Y ブロックを右クリックし、ベクトルを選択"寄生率 |モデルの構築」。
         2. ソフトウェア 2、PLS R メソッドを入力します。「Y 基準」、サンプル データセットとして「X データ セット」と検証方法として [クロス検証としてベクトル「寄生」を選択します。「実行」をクリックします。
      2. 回帰モデルを分析します。R²値 0.80 と寄生率 0.1% 未満クロス検証 (RMSECV) 値の二乗平均平方根誤差は、許容可能なモデルです。
      3. 回帰ベクトルの分析し、生物学的バンドを特定します。

部分的な最小二乗 (PLS-R) プロットし、その関連付けられた回帰ベクトル、図 1aと1b , 表示寄生虫からの信号とは異なること十分な線形回帰モデルを使用するフォームを使用することができます赤血球、将来のデータ セットで寄生虫の予測。

R 二乗値 0.87 の堅牢な線形の PLS-R モデルが生成され、根平均二乗 0.13% 寄生、図 1 aの交差検証誤差 (RMSECV)。寄生レベルが高く、特に主に核酸バンド関連付け 1042, 1083 1226/cm、RNA のリボースから、ν(C=O) に割り当てられているグループ、ν_s(PO⁴)、ν_、(PO⁴) それぞれ、および形成回帰ベクトルの主要な負の部分。赤血球は核を欠いている、すなわち核酸が寄生虫の強力な指標です。さらに、1226/cm のバンド構造が水溶液状態¹²の測定の重要性を強調 B DNA のフォームを持っていることを示します。対照的に、寄生虫は RBC コンポーネント、主にヘモグロビンを使用、脂質の比率に高い蛋白質感染赤血球にみられる私とアミド II 2913 2879、1397 cm^-1とアミドから 1631 と 1555 cm^-1に脂質帯によって示されるようにモード^12,13。

明瞭なバンドは、狭いと強烈なバンドとして、水蒸気などの非生物起源のスプリアス バンドに基づいて差別化ではなく、信号が真の生物学的バンドであることを明確に示します。具体的には、表 1、DNA バンドの存在は、寄生虫^11,12,13に直接起因します。一般に、回帰のベクトルは、PCA の荷重を同様の方法で解釈できます。バンドもバンドと元のスペクトルのシフトと関係します。

図 1:-R を PLS 回帰図、 (a) 0-1 の間スパイクの赤血球の % 寄生率と関連付けられた回帰係数(b)。回帰図では、各サンプルでは、x 軸に知られている寄生率と y 軸上の予測の寄生の寄生率を予測するモデルの能力を示しています。回帰係数は、モデルの予測能力に各バンドの貢献より強いバンドは貢献モデルそしてこうして寄生虫が血液の組成を変更する方法について説明します。再現してから変更したマーティン、M. et al.王立化学協会の許可を得て¹⁰ 。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

表 1: マラリアのスペクトルに PLS R の回帰係数バンドの割り当てスパイク赤血球。PLSR でスペクトルに関連付けられている赤血球値は回帰ベクトル前処理されたスペクトルを乗じて計算されます。したがって、回帰ベクトル回帰における IR のバンドの方向性と重要性を示しています。スペクトルは、2 番目の誘導体を用いた前処理された、ので否定的なバンドは、肯定的なバンドが低寄生率に関連付けられている高い寄生率に関連付けられます。再現してから変更したマーティン、M. et al.王立化学協会の許可を得て¹⁰ 。

PLS モデルは線形関係、Y チャイルド多変量法 = bX + E、予測変数 X の (ここでは、各波数で吸光度) および連続変数 Y (ここで寄生率レベル)。一言で言えば、モデル x の X が Y と相関の差異をキャプチャ潜在変数 (LVs) の新しいセットを作成する変数を結合し、回帰ベクトル (b) を計算する y 値の推定における新しいスペクトルの結果を乗算します。2 つの値からモデルの強さを取ることができる: R²値および二乗平均平方根エラーのクロス検証 (RMSECV) の値。前者について説明しますモデルとこの堅牢性の直線性 (がそれが 1 に近い方が良い) と外れ値のノイズの多いデータ R²値 0.8 未満モデルのデータを慎重に検討する必要があります。RMSECV 値は、予測を行うことができますエラーについて説明します。常に慎重に扱い、データ、外れ値を除外することにより可能な限り数を最小限に抑える最高だし、できるだけ多くの生物的複製をいることを確認します。

したがって、モデルを構築するため質の良いデータを取得ことが不可欠です。希釈系列の作製が重要です。具体的には RBC の各サンプルは、可能な限り同種を確かめます。策定し、旋回やそっとのフリック遠心チューブの端 5-10 回に数回赤血球を取り出し、ピペットを使用して、不一致が回避されます。同じような静脈では、汚染を防ぐために各サンプル間結晶をきれいにする重要なまたです。超純水や糸くず無料ワイプを使用してきれいな結晶とベースラインがフラットであることを確認するには、次のサンプル測定を汚染する残留物がないことが保証されます。

フィールドに適用されるモデルに必要な生物学的サンプルの数はほぼ同数のデータ セットを検証条件あたり少なくとも 30 です。このかなりの量はかなりの量を生成するためにかかる、従ってこれは、技法の制限。ただしより多くのサンプルが分析されます正しく、彼らは予測モデルに追加することができます、それを強化します。したがって、確立されると、モデルはより正確になることができます、それを設定するために必要な努力を正当化することができます。

環境、測定の計測によっていくつかの問題が発生します。ビームラインは楽器で完全に囲まれていない場合、接合部が気密または ATR ウィンドウは他のサンプルのコンパートメントとの互換性はエタノールと水蒸気を汚染できるスペクトル。エタノールは、1,070/cm ¹⁴のまわりで強いシャープなバンドとして表示されます。これは、エタノールからの空きで測定し、測定は一度だけ楽器を消毒して回避できます。水蒸気雰囲気の変化によって引き起こされる、周り小さな鋭い正と負のピークとして表示されます 1400-1,800/cm と 3,200-3,600/cm。これは、バック グラウンドの測定の頻度を増やすと楽器との窒素のパージによって解決できます。どこのパージは利用できません、水蒸気はまだかなり強い場合、それらを削除するデータ前処理に平滑化アルゴリズムと水蒸気補償を追加できます。

この手法は、将来診断と患者のアウトカムの約束の多くを保持しています。まず、メソッドは ATR 結晶に、サンプルを戻のみ必要があり、直接測定することができ、ユーザー エラーの可能性を減らすモデルに入力されるを実装する非常に単純な全体。アフリカの一部の地域で現在は²を欠けている非常に熟練した光顕微鏡の必要性はなくなります。高価な試薬と機器の必要性も排除、簡単のため、このように診断になる事実上コスト無料患者のため、PCR のための主要な制限であります。この組み合わせは、もっと早く、こうして患者の転帰を向上させる診断に来る患者のより高い数に 。テクニックは、RDTs の低感度を克服する、無症候性キャリアより早く、こうしてとして使用できるスクリーニング手法を検出することができるでしょう非常に高い感受性のため可能性があります。さらに、技術その他の病気に使用する、血の負担またはそれ以外の場合、結晶にいくつかのマイクロリットルまたはマイクログラムを適用できる可能性があります。

ただし、モデルの例フィールドに適用できる前に対処する必要がある多くのものがあります。クロス検証生物の複製数が少ないため 1 つです、それは理想的なのではないです。むしろ別の検証モデルをテストに設定を持つ代わりにはるかに良いです。また、RMSECV はかなり高い信頼性定量化のより低いレベルをここで作るです。この値を向上させる、複製の数を増やすとフィールドでこのメソッドを使用する前に行う必要があります。これは研究室試験⁹RMSECV はサンプルのサイズが大きいため非常に低いどこに確証です。これに加えて、間隔範囲とポイント向上させることがまたこの値も。さらに診断能力を向上させる、マラリアの野生系統を使用する必要があります、3 7 としてマラリア研究所系統であり表現型変化のための異なる化学組成を提示可能性があります。

著者が明らかに何もありません。

オーストラリアの研究議会によって著者に資金提供された (BRW に将来交わり FT120100926)、国立保健医療研究評議会オーストラリアの (プログラム助成金と国債; する上級研究員奨学金のキャリア初期 JSR;研究のインフラ機関バーネット研究所サポート方式の補助金)、ビクトリア州政府の運用インフラストラクチャ サポートのバーネット研究所に許可と。我々 は手段的扶養氏フィンレー シャンクスを認めます。