На основе RANKL остеокластов культуры Assay из мыши костного расследовать роль mTORC1 в формировании остеокластов

Эта рукопись описывает протокол к изоляции и культуры остеокласты в пробирке из костного мозга мыши и для изучения роли млекопитающих/механистический цель rapamycin комплекс 1 в формировании остеокластов.

Остеокласты являются уникальные кости resorbing клеток, которые отличают от линии моноцитов/макрофагов костного мозга. Дисфункция остеокластов может привести к серии метаболических заболеваний костей, включая остеопороза. Для разработки фармацевтических целей для профилактики патологических костной потери массы, необходимо понимать механизмы, которыми остеокласты дифференцировать от прекурсоров. Способность изолировать и культуры большое число остеокластов в vitro имеет решающее значение для того, чтобы определить роль конкретных генов в дифференциации остеокластов. Инактивация млекопитающих/механистический цель rapamycin комплекс 1 (TORC1) в остеокластов может уменьшить число остеокластов и увеличения костной массы; Однако основные механизмы требуют дальнейшего изучения. В настоящем исследовании описан RANKL-протокол на основе изолировать и культуры остеокласты из костного мозга мыши и изучить влияние инактивирование mTORC1 на формирование остеокластов. Этот протокол успешно привели в большое количество гигантских остеокласты, обычно в течение одной недели. Удаление Raptor нарушения формирования остеокластов и снизилась активность секреторной тартрата стойкие кислая фосфатаза, означающее что mTORC1 имеет решающее значение для формирования остеокластов.

Кости является постоянно меняющейся органом и перестроенный остеобластов и остеокласты на протяжении всей жизни. Остеокласты отвечают для рассасывания минерализованных матрицы и остеобластов синтезировать и выделяют новые костной матрицы¹. Баланс между костную резорбцию и формирования костей имеет решающее значение для здоровья костей, включая поддержание костной массы и ответ на стимуляцию и травмы. Если этот баланс нарушается, может возникнуть ряд метаболических заболеваний костей, включая остеопороза и заболеваний пародонта. В этих заболеваний костной массы потери в результате osteoclastic костную резорбцию превышает костей, образующих потенциал остеобластов^2,3. Таким образом в целях разработки фармацевтических целей для лечения скелетных расстройств, таких как остеопороз, важно понять поколения и биологии остеокласты⁴.

Остеокласты уникальный гигантские многоядерные клетки, расположенные на или вблизи поверхности кости и принадлежат к моноцитов/макрофагов семьи¹. Ibbotson K. J. и др. сообщил метод для создания остеокластов подобных клеток в пробирке с средой, содержащей 1,25-дигидрокси витамин D3⁵. Выявление макрофагальный колонии стимулирующий фактор (M-CSF) и рецепторов активатор для ядерного фактора κ B лиганда (RANKL) как основные факторы формирования остеокластов резко повысило эффективность osteoclastogenesis в пробирке ^{1 , 6 , 7}. способность культуры остеокласты в vitro улучшилось наше понимание поколения и регулирование остеокластов.

Млекопитающих/механистический цель rapamycin (mTOR) функций в двух структурно и функционально различных комплексов, а именно mTORC1 и mTORC2^8,9. Два различных белковых комплексов отличаются друг от друга из-за их различных компонентов и ниже по течению субстратов. mTORC1 содержит уникальные регулирования связанных белков mTOR (хищника), а mTORC2 rapamycin нечувствительным компаньон mTOR (Rictor)⁹. mTORC1 можно интегрировать и передавать важные сигналы регулировать рост клеток, пролиферации и дифференцировки. Недавно мы продемонстрировали, что mTORC1 играет ключевую роль в сети катаболических костную резорбцию путем удаления Raptor для инактивации mTORC1 в остеокласты¹⁰. Однако основные механизмы требуют дальнейшего изучения. В настоящем исследовании на основе RANKL osteoclastogenic метод был использован для создания остеокласты из костного мозга, полученных макрофагов (BMMs) одичал типа (WT) и рэп^Ctsk мышей, а также изучить влияние инактивирование mTORC1 на остеокластов формирование.

Все процедуры, связанные с животными, были выполнены в соответствии с протоколом, утвержденным в Стэнфордском административной панели на лабораторных животных уход (APLAC); и были одобрены животное уход и использование Комитета Шанхайского института биохимии и ячейки Биология.

1. Подготовка

1. Генерировать остеокластов конкретных Raptor удаления мышей (Raptor^fl/fl; Ctsk-cre, далее, рэп^Ctsk) путем скрещивания Raptor^fl/fl мышей с Ctsk-cre мышей. Используйте мышь Raptor^fl/fl как WT управления в данном исследовании.
2. Иметь контейнер со льдом, чтобы держать изолированных кости.
3. Подготовка питательной среды.
   1. Подготовьте α-MEM питательной среды, дополняющего минимальных основных средних альфа (α-MEM) с 1 x глутамина, пенициллин стрептомицином и 10% плода телячьей сыворотки.
   2. Подготовьте костного макрофагов индукции среднего, состоящий из 50 мл α-MEM средних и M-CSF в 20 нг/мл.
   3. Подготовка среднего индукции остеокластов, состоящий из M-CSF и RANKL на 20 нг/мл, соответственно, 50 мл α-MEM среды.
4. Подготовьте следующие буферы до окрашивания ЛОВУШКУ.
   1. Подготовьте исправление раствор, состоящий из 6,5 мл ацетона, 2,5 мл раствора цитрата и 0,8 мл раствора формальдегида (vol/vol) 37%.
   2. Подготовьте ловушек, окрашиванию решение.
      1. Prewarm деионизованной воды 37 ° C.
      2. Добавить 100 мкл быстро граната GBC базового решения и 100 мкл раствора нитрита натрия в 1,5 мл микропробирок и смешивать, нежный инверсии для 30 s. оставить смесь стоять за 2 мин.
      3. Prewarm 9 мл деионизованной воды 37 ° C. Добавьте 200 мкл diazotized быстро граната GBC базового решения от шага 1.4.2.2, 100 мкл раствора фосфат Нафтол AS-би, 400 мкл раствора ацетата и 200 мкл тартрата раствор.
      4. Держите ЛОВУШКУ, окрашивание раствора смесь на водяной бане при температуре 37 ° C.
5. Подготовьте следующие буфера перед ЛОВУШКУ активности количественная оценка питательной среды.
   1. Подготовить тартрата буфера (50 мл): 2 мл L-винной кислоты 0,33 М, 48 мл 0,33 М натрия тартрата двуосновной обезвоживанию. Отрегулируйте значение pH 4,9.
   2. Подготовка 4-нитрофенил фосфат динатрия (pNPP) буфера (200 мл): 1.502 g глицина, 41 мг MgCl₂, 27,2 мг ZnCl₂и 180 мл деионизованной воды. Отрегулируйте значение пэ-аша для 10.4 с 3 M NaOH и объем до 200 мл деионизированной водой.
   3. Подготовка pNPP буфер с фосфатазы субстрата (для одного 96-луночных Латы): 49.37 мг фосфатазы субстрат и 175 мкл буфера pNPP шага 1.5.2.
   4. Подготовка субстрата буфера (9 мл/96-луночных Латы): 6.24 мл деионизированной воды, 360 мкл раствора ацетата, а 2,4 мл тартрата буфера. Mix вихря и разогреть при 37 ° C перед использованием.
   5. Добавление 9 мл разогретой субстрата buffer(1.5.4) сделать смеси субстрата и вихревые для 10 90 мкл буфера pNPP с фосфатазы substrate(1.5.3) s.

2. Вскрытие (день -1)

1. Усыпить 3 1 месяц старый самок мышей WT и рэп^Ctsk CO₂ отдельно. Выполняйте CO₂ ингаляции с соответствующим оборудованием, квалифицированным персоналом.
2. Погружайте 6 мышей в стакан с 100 мл 75% этанола (vol/vol) 5 мин для предотвращения бактериального загрязнения и затем разместить на доске рассечение в лежачем положении. Сделать надрез на дистальном голени вертикально и вскрыть кожу вдоль задних конечностей офтальмологический ножницами.
3. Вырезать суставных связок тазобедренного сустава с ножницами и вывихнуть задних конечностей из ствола.
4. Вырезать суставных связок коленного сустава и аккуратно отделить голени и бедра от коленного сустава. Аккуратно удалите мягких тканей с ножницами.
5. Поместите все кости одной генотипа в одной мыши в каждой скважине шести хорошо плита с 2 мл α-MEM на льду.
   Примечание: Для сохранения жизнеспособности клеток, кости должны храниться в этих условиях для менее 1 ч.

3. изоляция (день -1)

1. Заполните одно также шесть ну плиты с 75% этанола (3 мл) и другие 5 скважин с α-MEM среднего (3 мл).
2. Положите все кости одной генотипа в этанол мыть за 15 s и мыть кости 5 раз с α-MEM средой для 10 s каждый раз.
3. Cut off эпифизов с ножницами и вставьте иглу шприца 0,45 мм в полости и флеш костного мозга, с α-MEM среднего в 50-мл пластиковых пробирок.
4. Промойте полость кости, используя тот же метод из другого конца кости. Повторите по крайней мере дважды, чтобы вымыть полость кости до тех пор, пока кости бледно.
5. Центрифуга костного мозга для получения клеток лепешки на 800 x g и 4 ° C за 5 мин аспирата супернатант.
6. Добавьте 3 мл буфера lysis красных кровяных клеток в пластиковых пробирок и очистка нежно ресуспензируйте костного мозга. Держите пластиковых пробирок на льду на 8 минут, чтобы лизировать красных кровяных клеток.
7. Добавьте 6 мл α-MEM среды в пластиковых пробирок остановить лизис клеток. Центрифуга 500 x g и 4 ° C на 10 минут и удалить супернатант.
8. Ресуспензируйте в 3 мл α-MEM питательной среды и место клетки в шести ну плиту (обычно один мышь за хорошо).
9. Инкубируйте при 37 ° C в 5% CO₂ инкубатора на ночь.

4. обшивка (день 0)

1. Передать супернатант пластиковых пробирок 15мл собирать неприсоединенной клетки на следующее утро.
2. Центрифуга на 800 x g и 4 ° C на 5 мин и удалить супернатант.
3. Ресуспензируйте в 4 мл α-MEM питательной среды.
4. Возьмите 20 мкл раствора клеток и смешать с 20 мкл Трипановый синий. Добавить 10 мкл смеси в Счетной палате и получить количество клеток в мл раствора.
5. Добавьте соответствующий объем α-MEM питательной среды для получения клеток решение 500000 клеток/мл.
6. Добавьте 500 мкл и 50 мкл костного макрофагов индукции среды в каждой скважине 24-Ну и 96-луночных крышку, соответственно.
7. Добавьте 500 мкл и 50 мкл раствора клеток в каждой скважине 24-Ну и 96-луночных крышку, соответственно.
8. Инкубируйте 3 дней при 37 ° C в 5% CO₂ инкубатора.

5. Дифференциация (3-7 дней)

1. Через три дня после покрытия, собирать 50 мкл среднего от каждой скважины 96-хорошо пластины и заморозить при температуре-20 ° C, затем аспирационная остаточного среднего.
2. Добавьте 1 мл и 100 мкл остеокластов индукции среднего в каждую лунку 24-ну плиты и плиты 96-луночных, соответственно.
3. Инкубируйте при 37 ° C в течение 2 дней.
4. Собирать 50 мкл среды от каждой скважины и аспирационная остаточного среднего.
5. Добавьте остеокластов индукции среднего в каждой скважине.
6. Инкубируйте при 37 ° C, за 1 день.
   Примечание: В этот момент времени, большие, многоядерные остеокласты следует рассматривать под инвертированным микроскопом (рис. 2A).
7. Если не видны остеокласты, измените среднего индукции остеокластов и наблюдать ежедневно, пока не видел остеокластов.
8. Соберите 50 мкл среды от каждой скважины 96-луночных пластины после того, как сформировались остеокластов.

6. тартрата пятнать устойчивостью кислой фосфатазы (ловушка)

Примечание: Зрелые остеокластов может присутствовать после 6-7 дней в vitro культуры (шаг 4).

1. Аспирационная среднего и мыть нежно 3 раза с ПБС.
2. Исправить ячейки в каждой скважине 96-луночных пластины с 100 мкл раствора исправление для 30 s при комнатной температуре.
3. После фиксации аспирационная решения и мыть нежно 3 раза с деионизированную воду подогретую до 37 ° C. Аспирационная деионизированную воду.
4. 100 мкл ЛОВУШКУ пятно в каждой скважине 96-луночных пластины и место пластину в инкубаторе при 37 ° C 30 мин и щит от света.
5. После окрашивания, аспирационная ЛОВУШКУ пятно и осторожно промойте деионизованной воды 3 раза.
6. Остеокласты изображения с помощью инвертированного микроскопа при 40 кратном.

7. ЛОВУШКУ активности количественная оценка питательной среды

1. Сбор 30 мкл культуры супернатанта от каждой скважины 96-луночных пластины из шага 5.1, 5.4 и 5.8; Используйте 30 мкл-культивированный остеокластов индукции среды как отрицательный контроль. Поместите образцы в новой 96-луночных пластины.
2. Добавление 90 мкл mixture(1.5.5) субстрата в каждой скважине 96-луночных пластины.
3. Место пластину в инкубаторе при 37 ° C 1 h и щит от света.
4. Остановите реакции, добавляя 50 мкл 3 M NaOH в каждой скважине 96-луночных пластины.
5. Измерения theabsorbance на длине волны 405 нм.

8. западный Blotting

Примечание: После 6-7 дней в vitro культуры в пластину 24-Ну, Зрелые остеокласты должны быть видны.

1. Аспирационная среды.
2. Мыть нежно с предварительно охлажденный 1 x PBS 3 раза.
3. Аспирационная PBS.
4. 100 мкл 1 x SDS лизис буфера содержащий ингибитор протеазы коктейль.
5. Лизатов тепла при 105 ° C 10 мин и центрифуги на 12 000 × g и 4 ° C на 10 мин собирать supernatants, содержащие белки.
6. Отдельные лизатов, содержащие 30 мкг белка на 10% SDS-PAGE¹¹ и затем передать винилидена фторида (PVDF) мембраны.
7. Блокировать мембраны с 5% обезжиренное молоко за 30 мин.
8. Инкубации мембран с анти ящера, анти P-S6, анти S6, анти β-актина в 1:1,000 разрежения в 5% обезжиренное молоко при температуре 4 ° C на ночь.
9. Вымойте мембраны с трис буфер солевой с Tween-20 (TBST) для 10 мин при комнатной температуре.
10. Повторите шаг 8,9 дважды.
11. Инкубации мембран с пероксидазой хрена (ПХ)-конъюгированных IgG антитела анти мыши или кролика на 1:5,000 разрежения в 5% обезжиренное молоко в течение 1 ч при комнатной температуре.
12. Вымойте мембраны 3 раза с TBST 10 мин при комнатной температуре.
13. Хемилюминесцентный детектор добавить Западной Хемилюминесцентный субстрат HRP на мембранах и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре. Слейте излишки субстрата и разоблачить помарки для рентгеновской пленки.

Используя настоящий Протокол, большое количество гигантских остеокласты были замечены на день 6; Если не видны гигантских остеокласты, еще один день дифференцировки остеокластов может быть необходимо (рис. 1). Формирование успешных остеокластов был подтвержден ловушек, окрашиванию (рисунок 2A). Остеокласты были гигантские клетки вино красный/фиолетовый с более чем 3 ядрами. Более чем 250 остеокласты были получены в каждой скважине 96-луночных пластины в WT BMMs (рис. 4A).

Удаление Raptor было подтверждено западных blotting анализа и инактивации mTORC1 было обусловлено снижением фосфорилирования рибосомных белка S6 (P-S6), который широко используется как индикации для mTORC1 (рис. 3).

Число остеокластов ловушка положительных уменьшилось в рэп^Ctsk BMMs по сравнению с группой WT (рис. 4A), который указал, что Raptor дефицит нарушение формирования остеокластов.

Активность секреторной Ловушка имеет важное значение для костной резорбции, и ловушка деятельность в среде культуры были проанализированы в настоящем исследовании. Как показано на рисунке 4В, ловушка активность возросла благодаря стимуляции RANKL WT и рэп^Ctsk BMMs. Кроме того, ловушка активность снизилась в рэп^CtskBMMs по сравнению с соответствующей группой WT (P < 0,05).

Рисунок 1: Схема протокола индукции остеокластов. BMMs были изолированы на 1 день и инкубировали с основными α-MEM среднего ночь. В день 0 BMMs были собраны и покрытием на 96-луночных и 24-ну крышку после инкубации в α-MEM среде с 10 нг/мл M-CSF. День 3 средство было изменено на α-MEM средний с 20 нг/мл M-CSF и 20 нг/мл RANKL для индукции дифференцировки остеокластов. На 5 день было изменено дифференциации среднего остеокластов. На 6 день большое количество остеокласты были видны и остеокластов анализов были выполнены. Если остеобласты были не видны, средний индукционный остеокластов было изменено и инкубации продолжались еще один день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: представительный вид остеокластов. (A) гигант остеокласты наблюдается в яркие области на 6 день. Красная линия изложил границы остеокластов. (B) обычно гигант, многоядерные, ловушка положительным (Винно-красный) остеокластов. Черной стрелкой указано два ядра многоядерные остеокластов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: mTORC1 инактивации в рэп-^Ctsk BMMs. Западной blotting анализ экспрессии Raptor, P-S6 и S6 WT и рэп^Ctsk BMMs на 6 день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Исключить Raptor нарушение формирования остеокластов. (A) ЛОВУШКУ окрашивание BMMs на 6 день. Высокое увеличение изображения квадратов в WT и рэп^Ctsk групп показали, соответственно. Там были меньше гигант, ловушка позитивные остеокласты, образованная в рэп^Ctsk BMMs по сравнению с группой WT. (B) ЛОВУШКУ активности культивированный WT и рэп^Ctsk BMMs. данных представляют означает ± S.D.* P < 0,05, n = 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Osteoclastogenic assay является наиболее широко используемый метод, чтобы изолировать и культуры остеокласты в пробирке^12,13. Хотя несколько основанных на RANKL остеокластов индукции были описаны^13,14,15, настоящее исследование описал протокол с некоторыми изменениями, на основе предыдущих методов.

В предыдущем исследовании сразу же после изоляции^14,15покрытие BMMs. Мы рекомендовали, что BMMs были культивируемых с базовой средой на ночь перед обшивкой изолировать BMMs от мезенхимальных стволовых клеток и фибробластов, которые сразу же придерживаться блюдо. M-CSF может способствовать распространение моноцитов к прекурсорам остеокластов и стимулировать остеокластов прекурсоров выразить ранга, которая связывает RANKL и затем индуцирует образование пожилые остеокласты^6,16,17. Таким образом в нашем исследовании, BMMs были индуцированной с 10 нг/мл M-CSF за 3 дня до остеокластов индукции, вместо остеокластов индукции на второй день после покрытия¹⁵. Плотность клеток имеет решающее значение для формирования остеокластов в пробирке. Рекомендуется, что 25000 BMMs были посеяны в каждой скважине ниже 96-луночных пластины от 3 дней инкубации с 10 нг/мл M-CSF. Когда слияния клеток достигла 80 – 90%, это подходящее время для индукции RANKL остеокластов. Как правило пожилые остеокласты формы на 6 день. Наиболее распространенной причиной для нескольких остеокласты является плотность субоптимальные клеток, которое может быть результатом низкой плотности посева или жизнеспособности низкой клеток. BMMs тонкие клетки первичной и нужно относиться осторожно. Сохраняя кости на льду долгое время или resuspending энергично уменьшается жизнеспособность BMMs и впоследствии препятствует формированию остеокластов. Таким образом оптимального заполнения плотность жизнеспособных BMMs имеет решающее значение для получения большое число остеокластов.

Активность секреторной Ловушка имеет решающее значение для osteoclastic костную резорбцию. В этом исследовании мы описываем метод количественного анализа секреторную активность ЛОВУШКУ в среде культуры. Изменение активности ЛОВУШКУ в среде культуры может быть результатом изменения числа остеокластов или секреторной ЛОВУШКУ остеокластов или сочетанием обоих. Таким образом это может быть полезным методом для анализа остеокластов функции в пробирке совместно с Пробирной рассасывания остеокластов, описанных ранее¹⁸.

mTOR является эволюционно сохраняется протеинкиназы, можно регулировать метаболизм и дифференциации клеток⁹. В этом исследовании мы обнаружили, что mTORC1 играет важную роль в костную резорбцию, регулируя формирования остеокластов. mTORC1 может быть потенциальным фармакологических мишенью для лечения костных метаболических расстройств, таких как остеопороз в будущем.

Таким образом наш протокол для индукции остеокластов успешно привело к большое количество гигантских остеокласты в пробирке и наши данные показывают, что mTORC1 имеет решающее значение для формирования остеокластов.

Все авторы заявляют, что они имеют без конфликта интересов.

Авторы благодарят доктор Minghan Тонг и S. Като за любезно предоставление реагентов и мышей. Мы благодарим членов Цзоу лаборатории для полезных обсуждений. Эта работа частично поддержали грантов из 973 программы из китайского министерства науки и технологии (большинство) [2014CB964704 и 2015CB964503], программы клинических исследований 9 людей больницы, Шанхай Jiao Tong школы медицины университета. Спасибо за помощь Фонда основной клеточной биологии и основной объект для химической биологии, CAS центр передового опыта в области науки для молекулярной клеток, Шанхайский Институт биохимии и клеточной биологии, Китайской академии наук.