Une base RANKL Osteoclast Culture dosage de moelle osseuse de souris pour enquêter sur le rôle de mTORC1 dans la Formation des ostéoclastes

Ce manuscrit décrit un protocole d’isolat et la culture les ostéoclastes in vitro de la moelle osseuse de souris et d’étudier le rôle de la cible mammifère/mécaniste de la rapamycine complexe 1 dans la formation des ostéoclastes.

Les ostéoclastes sont unique-résorption osseuse des cellules qui se différencient de la lignée des monocytes/macrophages de la moelle osseuse. Une série de maladies métaboliques des os, dont l’ostéoporose peut entraîner un dysfonctionnement des ostéoclastes. Pour développer des cibles pharmaceutiques pour la prévention de la perte de masse osseuse pathologique, faut comprendre les mécanismes par lesquels les ostéoclastes différencient des précurseurs. La capacité d’isoler et de la culture d’un grand nombre d’ostéoclastes in vitro est cruciale afin de déterminer le rôle des gènes spécifiques dans la différenciation des ostéoclastes. Inactivation de la cible mammifère/mécaniste de la rapamycine complexe 1 (TORC1) dans les ostéoclastes peut diminuer le nombre d’ostéoclastes et augmenter la masse osseuse ; Cependant, les mécanismes sous-jacents nécessitent une étude plus approfondie. Dans la présente étude, on décrit un protocole RANKL d’isoler et de culture d’ostéoclastes de moelle osseuse de souris et d’étudier l’influence de l’inactivation de mTORC1 sur la formation des ostéoclastes. Ce protocole a permis avec succès dans un grand nombre des ostéoclastes géants, en général sous huitaine. Suppression du Raptor avec facultés affaiblies de la formation des ostéoclastes et diminue l’activité de sécrétion phosphatases acides tartrate-résistantes, qui indique que mTORC1 est essentielle pour la formation des ostéoclastes.

OS est un organe en constante évolution et est remodelée par les ostéoblastes et les ostéoclastes tout au long de la vie. Les ostéoclastes sont responsables de la résorption de la matrice minéralisée et ostéoblastes synthétisent et sécrètent des nouveaux OS matrices¹. L’équilibre entre la résorption et formation osseuse est cruciale pour la santé osseuse, y compris l’entretien des os masse et réponse à la stimulation et de blessures. Si cet équilibre est rompu, une série de maladies métaboliques des os peut se produire, y compris l’ostéoporose et les maladies parodontales. Dans ces maladies, la perte de masse osseuse résultant de la résorption osseuse ostéoclastique dépasse les os formant la capacité des ostéoblastes^2,3. Ainsi, afin d’élaborer des cibles pharmaceutiques pour traiter des troubles squelettiques telles que l’ostéoporose, il est essentiel de comprendre la génération et la biologie des ostéoclastes⁴.

Les ostéoclastes sont des cellules multinucléées géants uniques situés à ou près de la surface osseuse et appartiennent à la famille de monocytes/macrophages¹. Ibbotson K. J. et al. a signalé une méthode pour générer des cellules semblables à des ostéoclastes in vitro avec un milieu contenant 1, 25-dihydroxy-vitamine D3⁵. L’identification du facteur stimulant de macrophage-colony (M-CSF) et activateur du récepteur pour le ligand de facteur nucléaire-κ B (RANKL) comme facteurs essentiels de la formation des ostéoclastes a considérablement accru l’efficacité des osteoclastogenesis in vitro ^{1 , 6 , 7}. la capacité de la culture les ostéoclastes in vitro a amélioré notre compréhension de la génération et la réglementation des ostéoclastes.

La cible mammifère/mécaniste de la rapamycine (mTOR) fonctions dans deux complexes structurellement et fonctionnellement distinctes, à savoir mTORC1 et mTORC2^8,9. Les deux complexes de protéines multiples sont distincts les uns des autres en raison de leurs différents composants et des substrats en aval. mTORC1 contient la protéine associée à la réglementation unique de mTOR (rapace), tandis que mTORC2 contient la rapamycine insensible compagnon de mTOR (Rictor)⁹. mTORC1 peut intégrer et transmettre des signaux importants pour réguler la croissance cellulaire, la prolifération et la différenciation. Récemment, nous avons démontré que mTORC1 joue un rôle clé dans le réseau de la résorption osseuse catabolique par suppression du Raptor pour inactiver les mTORC1 dans les ostéoclastes¹⁰. Cependant, les mécanismes sous-jacents nécessitent une étude plus approfondie. Dans la présente étude, une méthode axée sur le RANKL osteoclastogenic a été utilisée pour générer des ostéoclastes de macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMMs) de type sauvage (WT) et de la souris ^Ctsk de Rap et d’étudier l’influence de l’inactivation de mTORC1 sur les ostéoclastes formation.

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été réalisés conformément au protocole approuvé par la Commission Administrative de Stanford sur Laboratory Animal Care (APLAC) et ont été approuvés par le Comité de l’utilisation de la Shanghai Institut de biochimie et de la cellule et animalier Biologie.

1. préparation

1. Générer des souris de suppression des Raptor spécifiques ostéoclastes (Raptor^fl/fl; Ctsk-cre, au-delà Rap^Ctsk) en s’accouplant souris Raptor^fl/fl Ctsk-cre des souris. Utilisez les souris Raptor^fl/fl sous le contrôle du poids dans cette étude.
2. Avoir un récipient rempli de glace pour garder des os isolés.
3. Préparer le milieu de culture.
   1. Préparez milieu de culture de α-MEM en complétant le minimum indispensable moyen alpha (α-MEM) avec 1 x glutamine, pénicilline-streptomycine et 10 % de sérum de veau foetal.
   2. Préparer la moelle osseuse macrophage induction milieu composé de 50 mL de milieu de α-MEM et de M-CSF à 20 ng/mL.
   3. Préparer le milieu d’induction ostéoclastes composée de M-CSF et RANKL à 20 ng/mL, respectivement, dans 50 mL de milieu de α-MEM.
4. Préparez les tampons suivants avant la coloration du piège.
   1. Préparer la solution de correction composée de 6,5 mL d’acétone, 2,5 mL de solution de citrate et 0,8 mL de solution de formaldéhyde (vol/vol) de 37 %.
   2. Préparer le piège solution de coloration.
      1. Préchauffer l’eau déionisée à 37 ° C.
      2. Ajouter 100 µL de solution de base rapide grenat GBC et 100 µL de solution de nitrite de sodium dans un microtube de 1,5 mL et mélanger doucement par retournements d’autorisation s. 30 le mélange reposer pendant 2 min.
      3. Réchauffer au préalable les 9 mL d’eau désionisée à 37 ° C. Ajouter 200 µL de solution de base de GBC diazoté rapide grenat de l’étape 1.4.2.2, 100 µL de solution de phosphate naphthol AS-BI, 400 µL de solution d’acétate et 200 µL de solution de tartrate.
      4. Garder le piège de la coloration de la solution de mélange dans un bain-marie à 37 ° C.
5. Préparer le tampon suivant avant la quantification de l’activité du piège du milieu de culture.
   1. Préparer le tampon de tartrate (50 mL) : 2 mL d’acide L-tartrique 0,33 M, 48 mL de 0,33 M de tartrate de sodium dibasique déshydrater. Ajuster le pH à 4,9.
   2. Préparer un tampon 4-nitrophényl phosphate disodique (pNPP) (200 mL) : 1,502 g de glycine, 41 mg de MgCl₂, 27,2 mg ZnCl₂et 180 mL d’eau désionisée. Ajuster le pH à 10.4 avec 3 M NaOH et le volume à 200 mL d’eau désionisée.
   3. Préparer les pNPP du tampon de substrat de phosphatase (pour une plaque de 96 puits) : 49,37 mg de substrat de phosphatase et 175 µL de tampon de pNPP d’étape 1.5.2.
   4. Préparer le tampon de substrat (9 plaque à 96 puits/mL) : 6,24 mL d’eau désionisée, 360 μL de solution d’acétate et 2,4 mL de tampon de tartrate. La composition de vortex et préchauffer à 37 ° C avant utilisation.
   5. Ajouter 90 μL de tampon de pNPP avec phosphatase substrate(1.5.3) dans 9ml de substrat préchauffé buffer(1.5.4) pour faire un mélange de substrat et vortexer pendant 10 s.

2. dissection (jour -1)

1. Euthanasier 3 souris WT et Rap^Ctsk femelles d’un mois par le CO₂ séparément. Effectuer de CO₂ par inhalation avec un équipement approprié par personnel qualifié.
2. Immerger 6 souris dans un bécher de 100 ml d’éthanol à 75 % (vol/vol) pendant 5 min prévenir la contamination bactérienne et puis placer sur une planche de dissection dans une position couchée. Faire une incision à la distale du tibia verticalement et disséquer la peau le long de la patte avec des ciseaux ophtalmique.
3. Couper le ligament articulaire de l’articulation de la hanche avec des ciseaux et disloquer les membres postérieurs du tronc.
4. Couper le ligament articulaire de l’articulation du genou et dissocier soigneusement le tibia et le fémur de l’articulation du genou. Retirez doucement les tissus mous avec des ciseaux.
5. Placer tous les os d’un génotype dans des souris dans chaque puits d’une plaque de six puits avec 2 mL de α-MEM sur la glace.
   Remarque : Afin de préserver la viabilité des cellules, l’OS doivent être conservé dans ces conditions pendant moins de 1 h.

3. isolation (jour -1)

1. Remplissez-le d’un puits d’une plaque de six puits avec 75 % d’éthanol (3 mL) et les 5 autres puits moyen α-MEM (3 mL).
2. Mettez tous les os d’un génotype dans le lavage de l’éthanol pour 15 s et laver les OS 5 fois avec milieu de α-MEM 10 s chaque fois.
3. Couper les épiphyses avec le ciseaux et insérer une aiguille de seringue de 0,45 mm dans la cavité et flush moelle osseuse dehors avec moyen de α-MEM dans un tube à centrifuger de 50 mL.
4. Rincer la cavité osseuse à l’aide de la méthode même de l’autre extrémité de l’OS. Répétez l’opération au moins deux fois pour laver la cavité de l’OS jusqu'à ce que l’os sont pâle.
5. Centrifuger la moelle osseuse pour obtenir un culot cellulaire à 800 x g et 4 ° C pendant 5 min. aspirer le surnageant.
6. Ajouter 3 mL de tampon de lyse des globules rouges dans le tube à centrifuger et pipette doucement pour remettre en suspension de la moelle osseuse. Maintenir le tube à centrifuger sur glace pendant 8 min à lyser les globules rouges.
7. Ajouter 6 mL de milieu de α-MEM dans le tube à centrifuger pour arrêter la lyse cellulaire. Centrifuger à 500 x g et 4 ° C pendant 10 min et aspirer le surnageant.
8. Resuspendre dans 3 mL de milieu de culture de α-MEM et placer les cellules dans une plaque de six puits (généralement une souris / puits).
9. Incuber à 37 ° C dans une étuve à₂ CO 5 % du jour au lendemain.

4. électrodéposition (jour 0)

1. Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger 15 mL pour recueillir les cellules seules le lendemain matin.
2. Centrifuger à 800 x g et 4 ° C pendant 5 min et aspirer le surnageant.
3. Resuspendre dans 4 mL de milieu de culture de α-MEM.
4. Prenez 20 µL de la solution de la cellule et mélanger avec 20 µL du bleu Trypan. Ajouter 10 µL du mélange dans la chambre de comptage et d’obtenir le nombre de cellules par mL de solution.
5. Ajouter un volume approprié de milieu de culture de α-MEM pour obtenir une solution portable de 500 000 cellules/mL.
6. Ajouter 500 µL et 50 µL de milieu d’induction de la moelle osseuse macrophage dans chaque puits d’une plaque 24 puits et la plaque à 96 puits, respectivement.
7. Ajouter 500 µL et 50 µL de solution de cellule dans chaque puits d’une plaque 24 puits et la plaque à 96 puits, respectivement.
8. Incuber à 37 ° C dans une étuve à₂ CO 5 % pendant 3 jours.

5. différenciation (3-7 jours)

1. Trois jours après l’ensemencement, recueillir 50 µL de milieu de chaque puits de la plaque à 96 puits et congeler à-20 ° C et puis aspirer le milieu résiduel.
2. Ajouter 1 mL et 100 µL de milieu d’ostéoclastes induction dans chaque puits d’une plaque 24 puits et une plaque à 96 puits, respectivement.
3. Incuber à 37 ° C pendant 2 jours.
4. Collecter 50 µL de milieu de chaque puits et aspirer le milieu résiduel.
5. Ajouter milieu inducteur ostéoclastes dans chaque puits.
6. Incuber à 37 ° C pendant 1 nuit.
   Remarque : À ce moment, gros, multinucléées ostéoclastes devraient être considérés sous un microscope inversé (Figure 2 a).
7. Si les ostéoclastes ne sont pas visibles, changer le milieu inducteur ostéoclastes et observer tous les jours jusqu'à ce que les ostéoclastes sont visibles.
8. Recueillir 50 µL de milieu de chaque puits de la plaque à 96 puits après que les ostéoclastes ont formé.

6. tartrate Resistant Acid Phosphatase (TRAP) coloration

Remarque : Les ostéoclastes matures peuvent être présents après 6-7 jours de la culture in vitro (étape 4).

1. Aspirer les moyen et laver doucement 3 fois avec 1 x PBS.
2. Fixer les cellules dans chaque puits de la plaque à 96 puits avec 100 µL de solution de 30 s à température ambiante.
3. Après fixation, aspirer la solution fix et laver doucement 3 fois avec de l’eau désionisée préchauffé à 37 ° C. Aspirer l’eau déionisée.
4. Ajouter 100 µL de tache de piège dans chaque puits de la plaque à 96 puits et placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 30 min et bouclier de lumière.
5. Après coloration, aspirer la tache de piège et laver délicatement 3 fois avec de l’eau désionisée.
6. Ostéoclastes d’image à l’aide d’un microscope inversé à un grossissement de 40 X.

7. piège Quantification de l’activité du milieu de Culture

1. Récupérer le surnageant de culture 30 µL de chaque puits de la plaque à 96 puits de l’étape 5.1, 5.4 et 5.8 ; Utilisez 30 µL de milieu d’induction ostéoclastes non fermentés comme contrôle négatif. Placer les échantillons dans une nouvelle plaque de 96 puits.
2. Ajouter 90 μl de substrat mixture(1.5.5) dans chaque puits de la plaque à 96 puits.
3. Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 h et bouclier de lumière.
4. Arrêter la réaction en ajoutant 50 µL de 3 M NaOH dans chaque puits de la plaque à 96 puits.
5. Mesurer theabsorbance à la longueur d’onde de 405 nm.

8. Western Blot

Remarque : Après 6-7 jours de culture in vitro la plaque 24 puits, les ostéoclastes matures doivent être visibles.

1. Aspirez le milieu.
2. Laver doucement avec un refroidissement préalable 1 x PBS 3 fois.
3. Aspirer le PBS.
4. Ajouter 100 µL de 1 x SDS lyse tampon contenant inhibiteur de protéase cocktail.
5. Lysats de chaleur à 105 ° C pendant 10 min et centrifuger à 12 000 × g et 4 ° C pendant 10 min. recueillent le surnageant contenant des protéines.
6. Séparez les lysats contenant 30 µg de protéines en 10 % SDS-PAGE¹¹ et puis transférer sur une membrane de Polyfluorure de vinylidène (PVDF).
7. Bloquer les membranes avec 5 % de lait pendant 30 min.
8. Incuber les membranes avec anti-Raptor, anti-P-S6, S6-anti, anti-β-actine à la dilution de 1 : 1 000 à 5 % de lait à 4 ° C durant la nuit.
9. Lavage des membranes avec Tris Buffered Saline avec Tween-20 (TBST) pendant 10 min à température ambiante.
10. Répétez l’étape 8,9 deux fois.
11. Incuber les membranes avec la peroxydase de raifort (HRP)-conjugués d’anticorps IgG anti-souris ou lapin 1:5,000 dilution à 5 % de lait pendant 1 h à température ambiante.
12. Laver les membranes 3 fois avec un mélange TBST pendant 10 min à température ambiante.
13. Pour la détection par chimiluminescence, ajouter Ouest substrat HRP chimiluminescent sur les membranes et incuber pendant 5 min à température ambiante. Égoutter l’excès substrat et exposer les taches à la radiographie.

En utilisant le présent protocole, un grand nombre des ostéoclastes géants ont été vus le jour 6 ; Si des ostéoclastes géants ne sont pas vus, un jour de plus de différenciation ostéoclastique peut être nécessaire (Figure 1). Formation des ostéoclastes réussie a été confirmée par piège coloration (Figure 2 a). Les ostéoclastes étaient des cellules géantes de rouge/pourpre vins avec plus de 3 noyaux. Plus de 250 ostéoclastes ont été obtenus dans chaque puits de la plaque de 96 puits en WT BMMs (Figure 4 a).

Suppression du Raptor a été confirmée par analyse épongeante occidentale et l’inactivation des mTORC1 a été déterminée par une diminution de la phosphorylation de la protéine ribosomale S6 (P-S6), qui est employé couramment comme la lecture pour mTORC1 (Figure 3).

Le nombre des ostéoclastes piège positif est en Rap^Ctsk BMMs comparées au groupe WT (Figure 4 a), qui indiquait que la carence en Raptor altérée formation des ostéoclastes.

L’activité sécrétoire piège est importante pour la résorption osseuse, et activité de piège dans le milieu de culture a été analysée dans la présente étude. Comme le montre la Figure 4 b, piège activité accrue due à la stimulation de RANKL WT et Rap^Ctsk BMMs. En outre, l’activité piège a diminué en Rap^CtskBMMs comparées au groupe WT correspondant (P < 0,05).

Figure 1 : schéma de principe du protocole induction ostéoclastes. BMMs ont été isolés au jour 1 et incubées avec le milieu de base α-MEM du jour au lendemain. Jour 0, BMMs ont été recueillies et ensemencés sur une plaque à 96 puits et la plaque 24 puits suivie d’incubation dans un milieu α-MEM 10 ng/ml de M-CSF. Le jour 3, le milieu a été changé au milieu de le α-MEM avec 20 ng/mL de M-CSF et 20 ng/mL RANKL pour l’induction de la différenciation des ostéoclastes. Le jour 5, le moyen de différenciation ostéoclastique a été changé. Jour 6, un grand nombre d’ostéoclastes était visible et ostéoclastes analyses ont été effectuées. Si ostéoblastes n’étaient pas visibles, le milieu d’induction ostéoclastes a été changé et l’incubation a continué pendant un jour de plus. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : vue représentatif des ostéoclastes. (A) géant ostéoclastes observés dans le champ lumineux le jour 6. La ligne rouge décrit la frontière des ostéoclastes. (B) A, ostéoclastes de positif (vin rouge) piège typiquement géant, multinucléées. La flèche noire indique deux noyaux de l’ostéoclaste multinucléée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : mTORC1 inactivation dans Rap^Ctsk BMMs. Western blotting analyse d’expression Raptor, P-S6 et S6 en WT et Rap^Ctsk BMMs le jour 6. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Suppression du Raptor avec facultés affaiblies formation des ostéoclastes. (A), piège de coloration de BMMs le jour 6. Images de fort grossissement des places de WT et Rap^Ctsk groupes figurent, respectivement. Il y avait moins géants, ostéoclastes positives piège formés dans les Rap^Ctsk BMMs en comparaison avec le groupe de WT. (B), piège de l’activité d’élevage WT et Rap^Ctsk BMMs. données représentent signifie ± S.D.* P < 0,05, n = 3. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

L’essai d’osteoclastogenic est la méthode la plus largement utilisée d’isoler et de culture d’ostéoclastes in vitro^12,,¹³. Alors que plusieurs cérémonies d’installation des ostéoclastes axée sur le RANKL ont été décrits^13,14,15, la présente étude décrit un protocole avec quelques modifications basées sur les méthodes précédentes.

Dans l’étude précédente, BMMs étaient plaquant immédiatement après isolement^14,15. Nous avons recommandé que BMMs ont été cultivées avec base milieu de jour au lendemain avant d’isoler BMMs de cellules souches mésenchymateuses et des fibroblastes qui adhèrent immédiatement dans le plat. M-CSF peut favoriser la prolifération des monocytes à précurseurs ostéoclastiques et stimuler des précurseurs ostéoclastiques pour exprimer le rang qui lie RANKL et puis induit la formation des ostéoclastes matures^6,16,17. Par conséquent, dans notre étude, les BMMs ont été induites 10 ng/ml de M-CSF pendant 3 jours avant l’induction de l’ostéoclaste, plutôt pour l’induction des ostéoclastes le deuxième jour après¹⁵d’électrodéposition. La densité cellulaire est critique pour la formation d’ostéoclastes in vitro. Il est recommandé que les 25 000 BMMs ont été ensemencées dans chaque puits de la suite de la plaque à 96 puits de 3 jours d’incubation à 10 ng/mL de M-CSF. Quand au confluent de la cellule atteint 80 à 90 %, c’est un moment approprié pour l’induction d’ostéoclastes de RANKL. Habituellement, échéance forme ostéoclastes le jour 6. La raison la plus courante pour les rares ostéoclastes est la densité cellulaire sous-optimal, qui peut être le résultat d’une faible densité de semis ou de la viabilité cellulaire faible. BMMs sont délicates cellules primaires et doivent être traités en douceur. Garder l’OS sur la glace pendant une longue période ou resuspendant vigoureusement diminue la viabilité de BMMs et diminue par la suite la formation des ostéoclastes. Ainsi, la densité de semis optimale de BMMs viables est essentielle pour obtenir un grand nombre des ostéoclastes.

L’activité sécrétoire piège est critique pour la résorption osseuse ostéoclastique. Dans cette étude, nous décrivons une méthode pour analyser quantitativement l’activité sécrétrice piège dans le milieu de culture. Le changement de l’activité de piège dans le milieu de culture peut entraîner des variations du nombre des ostéoclastes ou piège sécrétoire des ostéoclastes ou une combinaison des deux. Ainsi, cela peut être une méthode utile pour analyser les ostéoclastes function in vitro ainsi que le dosage de la résorption ostéoclastique décrit précédemment¹⁸.

mTOR est une kinase évolutivement conservée qui peut réguler la cellule du métabolisme et la différenciation⁹. Dans cette étude, nous avons constaté que mTORC1 a joué un rôle important dans la résorption osseuse en régulant la formation des ostéoclastes. mTORC1 peut être une cible pharmacologique potentielle pour le traitement des maladies métaboliques des os comme l’ostéoporose à l’avenir.

En résumé, notre protocole d’induction de l’ostéoclaste avec succès a provoqué un grand nombre de géants ostéoclastes in vitro et nos données suggèrent que mTORC1 est critique pour la formation des ostéoclastes.

Tous les auteurs affirment qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêt.

Les auteurs remercient Dr Minghan Tong et S. Kato pour souris et réactifs fournissant gracieusement. Nous remercions les membres du laboratoire Zou pour des discussions fructueuses. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de 973 de programme du ministère chinois de la Science et la technologie (MOST) [2014CB964704 et 2015CB964503], programme de recherche clinique du Hospital 9e populaire, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Merci pour l’aide du laboratoire central de biologie cellulaire et Core Facility for Chemical Biology, no CAS Centre d’Excellence en cellule moléculaire Science, Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology, Académie chinoise des Sciences.