Um baseado em RANKL Osteoclast cultura ensaio de Mouse medula óssea para investigar o papel de mTORC1 na formação de Osteoclast

Este manuscrito descreve um protocolo para isolar e cultura osteoclastos em vitro da medula óssea de rato e estudar o papel do alvo da rapamicina 1 complexo na formação do osteoclast mamíferos/mecanicista.

Osteoclastos são único osso-resorbing células que diferenciam-se da linhagem de monócitos/macrófagos da medula óssea. Disfunção dos osteoclastos pode resultar em uma série de doenças metabólicas ósseas, incluindo osteoporose. Para desenvolver metas farmacêuticas para a prevenção da perda de massa óssea patológica, devem-se compreender os mecanismos pelos quais osteoclastos diferenciarem dos precursores. A capacidade de isolar e cultura de um grande número de osteoclastos em vitro é fundamental para determinar o papel de genes específicos na diferenciação do osteoclast. Inactivação do alvo da rapamicina complexo 1 (TORC1) em osteoclastos mamíferos/mecanicista pode diminuir o número de osteoclasto e aumento da massa óssea; no entanto, os mecanismos subjacentes exigem um estudo mais aprofundado. No presente estudo, é descrito um protocolo baseado em RANKL isolar e cultura osteoclastos da medula óssea de rato e estudar a influência de inativação de mTORC1 na formação do osteoclast. Este protocolo com sucesso resultou em um grande número de osteoclastos gigantes, normalmente dentro de uma semana. Exclusão de Raptor deficiente formação osteoclasto e diminuiu a atividade secretora fosfatase ácida tartarato-resistente, indicando que mTORC1 é fundamental para a formação do osteoclast.

Osso é um órgão em constante mudança e é remodelado por osteoblastos e osteoclastos ao longo da vida. Osteoclastos são responsáveis pela reabsorção de matriz mineralizada e osteoblastos sintetizam e segregam o novo osso matrizes¹. O equilíbrio entre a reabsorção óssea e formação óssea é crucial para a saúde óssea, incluindo a manutenção do osso em massa e resposta à estimulação e lesão. Se esse equilíbrio é perturbado, pode ocorrer uma série de doenças metabólicas do osso, incluindo osteoporose e doenças periodontais. Estas doenças, perda de massa óssea resultante da reabsorção óssea osteoclástica excede o osso formando a capacidade de osteoblastos^2,3. Assim, a fim de desenvolver metas farmacêuticas para tratar distúrbios esqueléticos, tais como osteoporose, é fundamental para compreender a geração e a biologia dos osteoclastos⁴.

Osteoclastos são únicas células multinucleadas gigantes localizadas em ou perto da superfície do osso e pertencem à família de monócitos/macrófagos¹. Ibbotson K. J. et al. relatou um método para gerar células osteoclasto em vitro com meio contendo 1,25-diidroxi-vitamina D3⁵. A identificação do fator estimulante de colônia de macrófagos (M-CSF) e ativador do receptor para o ligante de B fator nuclear-κ (RANKL) como fatores essenciais da formação do osteoclast aumentou drasticamente a eficiência do osteoclastogenesis em vitro ^{1 , 6 , 7}. a capacidade de cultura osteoclastos em vitro melhorou a nossa compreensão da geração e regulação dos osteoclastos.

Mamíferos/mecanicista alvo de rapamicina (mTOR) funções em dois complexos estruturalmente e funcionalmente distintos, ou seja, mTORC1 e mTORC2^8,9. Os dois complexos de proteínas multi são distintos uns dos outros devido a seus diferentes componentes e substratos a jusante. mTORC1 contém a proteína reguladora associada exclusiva de mTOR (Raptor), enquanto mTORC2 contém o companheiro rapamicina diferenciação da mTOR (Rictor)⁹. mTORC1 pode integrar e transmitir sinais importantes que regulam crescimento celular, proliferação e diferenciação. Recentemente, temos demonstrado que mTORC1 desempenha um papel fundamental na rede de reabsorção óssea catabólica pela exclusão de Raptor para inactivar mTORC1 em osteoclastos¹⁰. No entanto, os mecanismos subjacentes exigem um estudo mais aprofundado. No presente estudo, um método baseado em RANKL osteoclastogenic foi usado para gerar os osteoclastos de macrófagos derivados da medula óssea (BMMs) do selvagem-tipo (WT) e Rap^Ctsk ratos e estudar a influência de inativação de mTORC1 no osteoclasto formação.

Todos os procedimentos relativos aos animais foram realizados de acordo com o protocolo aprovado pelo painel administrativo de Stanford no laboratório Animal conta (APLAC) e foram aprovados pelo Comitê de uso do Instituto de bioquímica de Shanghai e célula e cuidado Animal Biologia.

1. preparação

1. Gerar osteoclast específico Raptor exclusão ratos (Raptor^fl/fl; Ctsk-cre, outra vida Rap^Ctsk) pelo acasalamento Raptor^fl/fl ratos com ratos Ctsk-cre . Use os Raptor^fl/fl ratos como o controle WT neste estudo.
2. Tem um recipiente com gelo para manter os ossos isolados.
3. Prepare o meio de cultura.
   1. Prepare o meio de cultura de α-MEM completando alfa mínima essencial média (α-MEM) com 1 x de glutamina, penicilina-estreptomicina e 10% de soro fetal bezerro.
   2. Prepare o suporte de indução de macrófagos da medula óssea consistindo de 50 mL de meio de α-MEM e M-CSF a 20 ng/mL.
   3. Prepare o suporte de indução de osteoclast consistindo de M-CSF e RANKL a 20 ng/mL, respectivamente, em 50 mL de meio de α-MEM.
4. Prepare os seguintes buffers antes de armadilha de coloração.
   1. Prepare a solução de correção consistindo de 6,5 mL de acetona, 2,5 mL de solução de citrato e 0,8 mL de solução de formaldeído (vol/vol) de 37%.
   2. Prepare a armadilha solução de coloração.
      1. Escaldar com água destilada a 37 ° C.
      2. Adicione 100 µ l de solução de base rápido Granada GBC e 100 µ l de solução de nitrito de sódio em um microtubo de 1,5 mL e misture gentilmente por inversão de 30 s. deixe a mistura repousar por 2 min.
      3. Escaldar a 9 mL de água destilada a 37 ° C. Adicione 200 µ l de solução de base diazotada rápido Granada GBC da etapa 1.4.2.2, 100 µ l de solução de fosfato de naftol AS-BI, 400 µ l de solução de acetato e 200 µ l de solução de tartarato.
      4. Manter a armadilha coloração solução de mistura em um banho-maria a 37 ° C.
5. Prepare a seguinte reserva antes de quantificação de atividade de armadilha do meio de cultura.
   1. Preparar o tampão de tartarato (50 mL): 2 mL de ácido L-tartárico de 0,33 M, 48 mL de 0,33 M de tartarato de sódio dibásico desidratar. Ajuste o valor de pH de 4,9.
   2. Preparar o tampão de 4-nitrofenil fosfato dissódico (pNPP) (200 mL): 1,502 g de glicina, 41 mg de MgCl₂, 27,2 mg de ZnCl₂e 180 mL de água desionizada. Ajuste o valor de pH de 10.4 com 3 M de NaOH e o volume de 200 mL com água desionizada.
   3. Preparar pNPP buffer com substrato de fosfatase (para uma placa de 96 poços): 49,37 mg de substrato de fosfatase e 175 µ l de tampão pNPP de passo 1.5.2.
   4. Preparar o tampão de substrato (9 mL/96-placa): 6,24 mL de água desionizada, 360 μL de solução de acetato e 2,4 mL de tampão de tartarato. Misture por vórtice e pré-aqueça a 37 ° C antes do uso.
   5. Adicionar 90 μL de tampão de pNPP com fosfatase substrate(1.5.3) a 9ml de substrato pré-aquecido buffer(1.5.4) tornar-se uma mistura de substrato e vórtice por 10 s.

2. dissecação (dia -1)

1. Eutanásia em 3 um mês de idade WT e Rap^Ctsk ratos fêmeas separadamente pelo CO₂ . Realize inalação de CO₂ com equipamento adequado por pessoal treinado.
2. Mergulhe 6 ratos em um copo com 100 mL de etanol a 75% (vol/vol) por 5 min evitar a contaminação bacteriana e coloque em um tabuleiro de dissecação em posição supina. Fazer uma incisão na distal da tíbia verticalmente e dissecar a pele ao longo do membro posterior com tesoura oftálmica.
3. Corte do ligamento articular da articulação do quadril com uma tesoura e deslocar os membros posteriores do tronco.
4. Cortar o ligamento articular da articulação do joelho e cuidadosamente desassociar a tíbia e o fêmur da articulação do joelho. Remova cuidadosamente o tecido mole com uma tesoura.
5. Coloque todos os ossos de um genótipo em de um rato em cada poço de um seis--placa com 2 mL de α-MEM no gelo.
   Nota: Para preservar a viabilidade celular, o osso deve ser mantido nestas condições para menos de 1 h.

3. isolamento (dia -1)

1. Encha um poço de uma placa de seis com 75% de etanol (3 mL) e os outros 5 poços com meio de α-MEM (3 mL).
2. Coloque todos os ossos de um genótipo na lavagem etanol por 15 s e lavagem de ossos 5 vezes com meio de α-MEM de 10 s de cada vez.
3. Corte as epífises com a tesoura e inserir uma agulha de seringa de 0.45 mm na cavidade e flush medula óssea fora com meio de α-MEM em um tubo de centrífuga de 50 mL.
4. Lave a cavidade óssea, usando o mesmo método da outra extremidade do osso. Repita pelo menos duas vezes para lavar a cavidade óssea completamente até que o osso é pálido.
5. Centrifugue a medula óssea, para obter um centrifugado a 800 x g e 4 ° C por 5 min. Aspire o sobrenadante.
6. Adicione 3 mL de tampão de lise de células vermelhas do sangue no tubo de centrífuga e pipeta suavemente para Ressuspender a medula óssea. Mantenha o tubo de centrífuga no gelo durante 8 min lisar células vermelhas do sangue.
7. Adicione 6 mL de meio de α-MEM no tubo de centrífuga para parar a lise celular. Centrifugar a 500 x g e 4 ° C por 10 min e aspirar o sobrenadante.
8. Resuspenda em 3 mL de meio de cultura de α-MEM e colocar as células em uma placa de seis (geralmente um rato por alvéolo).
9. Incube a 37 ° C numa incubadora 5% CO₂ durante a noite.

4. chapeamento (dia 0)

1. Transferi o sobrenadante para um tubo de centrífuga de 15 mL para coletar as células solteira na manhã seguinte.
2. Centrifugar a 800 x g e 4 ° C por 5 min e aspirar o sobrenadante.
3. Resuspenda em 4 mL de meio de cultura de α-MEM.
4. Pegue 20 µ l da solução de célula e misture com 20 µ l de Trypan azul. Adicionar 10 µ l da mistura para a câmara de contagem e obter a contagem de células por mL de solução.
5. Adicione um volume adequado do meio de cultura de α-MEM para obter uma solução de célula de 500.000 células/mL.
6. Adicione 500 µ l e 50 µ l de meio de indução de macrófagos da medula óssea em cada poço de uma 24-placa e placa de 96 poços, respectivamente.
7. Adicione 500 µ l e 50 µ l de solução de célula para cada poço de uma 24-placa e placa de 96 poços, respectivamente.
8. Incube a 37 ° C numa incubadora 5% CO₂ por 3 dias.

5. diferenciação (dias 3-7)

1. Três dias depois do chapeamento, coletar meio de 50 µ l de cada poço da placa de 96-bem congelar a-20 ° C e em seguida, Aspire o meio residual.
2. Adicione 1 mL e meio de indução 100 µ l osteoclast em cada poço de uma placa de 24 e uma placa de 96 poços, respectivamente.
3. Incube a 37 ° C por 2 dias.
4. Coletar 50 µ l do meio de cada poço e aspire o meio residual.
5. Adicione meio de indução osteoclast em cada poço.
6. Incube a 37 ° C por 1 dia.
   Nota: Neste ponto do tempo, grandes, multinucleados osteoclastos devem ser vistos sob um microscópio invertido (Figura 2A).
7. Se osteoclastos não são vistos, mudar o meio de indução de osteoclasto e observar diariamente até osteoclastos são vistos.
8. Colete 50 µ l do meio de cada poço da placa de 96 poços depois de osteoclastos se formaram.

6. tartarato de coloração de fosfatase ácida resistente (TRAP)

Nota: Os osteoclastos maduros podem estar presentes após 6-7 dias de em vitro cultura (passo 4).

1. Aspire médio e lave delicadamente 3 vezes com 1X PBS.
2. Corrigir as células em cada poço da placa de 96 poços com 100 µ l de solução por 30 s, à temperatura ambiente.
3. Após a fixação, aspirar a solução de correção e lave delicadamente 3 vezes com água desionizada pré-aquecido a 37 ° C. Aspire água desionizada.
4. Adicione 100 µ l de mancha de armadilha em cada poço da placa de 96 poços e coloque a placa em uma incubadora a 37 ° C por 30 min e escudo de luz.
5. Depois da coloração, aspirar a mancha de armadilha e delicadamente lavar 3 vezes com água desionizada.
6. Osteoclastos de imagem usando um microscópio invertido na ampliação de X 40.

7. quantificação de atividade armadilha de meio de cultura

1. Coletar 30 cultura µ l sobrenadante de cada poço da placa de 96 poços da etapa 5.1, 5.4 e 5.8; Use 30 µ l de meio de indução não-cultivadas osteoclast como controlo negativo. Coloca as amostras em uma nova placa de 96 poços.
2. Adicione 90 μL de substrato mixture(1.5.5) em cada poço da placa de 96 poços.
3. Coloque a placa em uma incubadora a 37 ° C por 1 h e escudo de luz.
4. Pare a reação adicionando 50 µ l de 3 M de NaOH para cada poço da placa de 96 poços.
5. Medir a theabsorbance no comprimento de onda de 405 nm.

8. mancha ocidental

Nota: Depois de 6-7 dias de cultura em vitro na placa de 24, osteoclastos maduros devem ser visíveis.

1. Aspire o meio.
2. Lave suavemente com pre-cooled 1X PBS 3 vezes.
3. Aspire PBS.
4. Adicione 100 µ l de SDS do lysis buffer contendo inibidor da protease cocktail de 1x.
5. Lisados de calor a 105 ° C durante 10 minutos e centrifugar 12.000 × g e 4 ° C por 10 min. recolher os sobrenadantes contendo proteínas.
6. Separar os lysates contendo 30 µ g de proteína por 10% SDS-PAGE¹¹ ... e então transfira para uma membrana (PVDF) de fluoreto de polivinilideno.
7. Bloquear as membranas com leite desnatado 5% durante 30 min.
8. Incube as membranas com anti-Raptor anti-P-S6, anti-S6, anti-β-actina 1:1,000 diluição em leite desnatado 5% a 4 ° C durante a noite.
9. Lave as membranas com Tris Buffered Saline com Tween-20 (TBST) durante 10 minutos à temperatura ambiente.
10. Repita a etapa 8,9 duas vezes.
11. Incubar as membranas com peroxidase de rábano (HRP)-conjugado antirato ou coelho anticorpos IgG 1:5,000 diluição em leite desnatado 5% por 1h à temperatura ambiente.
12. Lave as membranas 3 vezes com TBST durante 10 minutos à temperatura ambiente.
13. Para a deteção quimioluminescente, adicionar ocidental substrato quimioluminescente de HRP sobre as membranas e incubar durante 5 min à temperatura ambiente. Escorra o excesso substrato e expor as manchas para filme de raio-x.

Utilizando o presente protocolo, um grande número de osteoclastos gigantes foram visto no dia 6; se osteoclastos gigantes não são vistos, mais um dia de diferenciação osteoclast pode ser necessário (Figura 1). Formação osteoclast sucesso foi confirmada pela armadilha de coloração (Figura 2A). Os osteoclastos foram células gigantes de vinho vermelho/roxo com mais de 3 núcleos. Mais de 250 osteoclastos foram obtidos em cada poço da placa de 96 poços em WT BMMs (Figura 4A).

Exclusão de Raptor foi confirmado pela análise de mancha ocidental e a inactivação de mTORC1 foi determinada por uma diminuição da fosforilação da proteína ribosomal S6 (P-S6), que é amplamente utilizada como a leitura de mTORC1 (Figura 3).

O número de osteoclastos armadilha-positivo diminuiu em Rap^Ctsk BMMs comparados com o grupo WT (Figura 4A), que indicou que a deficiência de Raptor diminuída formação osteoclast.

A atividade secretora armadilha é importante para reabsorção óssea, e atividade de armadilha em meio de cultura foi analisada no presente estudo. Como mostrado na Figura 4B, armadilha atividade aumentou devido à estimulação de RANKL em WT e BMMs Rap^Ctsk . Além disso, atividade de armadilha diminuiu em Rap^CtskBMMs comparados com o grupo correspondente de WT (P < 0,05).

Figura 1: diagrama esquemático do protocolo de indução de osteoclast. BMMs foram isoladas no dia 1 e incubadas com meio básico α-MEM durante a noite. No dia 0, BMMs foram coletadas e chapeados sobre uma placa de 96 poços e placa de 24 seguido de incubação em meio α-MEM com 10 ng/mL, M-CSF. No dia 3, o médio foi mudado para meio de α-MEM com M-CSF e 20 ng/mL RANKL para indução de diferenciação osteoclast de 20 ng/mL. No dia 5, o meio de diferenciação osteoclast foi alterado. No dia 6, um grande número de osteoclastos eram visível e osteoclasto ensaios foram realizados. Se os osteoblastos não eram visíveis, o meio de indução osteoclast foi alterado e incubação continuou por mais um dia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: vista representativa dos osteoclastos. (A) gigante osteoclastos observaram em campo claro no dia 6. A linha vermelha delineada a fronteira dos osteoclastos. (B), um normalmente gigante, multinucleada, armadilha positivo (vinho tinto) osteoclast. A seta preta indicado dois núcleos do multinucleadas osteoclasto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: inativação de mTORC1 em ^Ctsk de Rap BMMs. Análise da expressão de Raptor, P-S6 e S6 no WT e Rap^Ctsk BMMs no dia 6 de mancha de ocidental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Exclusão de Raptor deficiente formação osteoclast. (A) armadilha coloração de BMMs no dia 6. Imagens de alta ampliação das praças de WT e Rap^Ctsk grupos são mostradas, respectivamente. Havia menos osteoclastos positivos de armadilha gigantes, formados nos BMMs Rap^Ctsk em comparação com o grupo WT. Atividade (B), armadilha de culto WT e representam de dados BMMs. Rap^Ctsk significa ± S.D.* P < 0.05, n = 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O ensaio de osteoclastogenic é o método mais utilizado para isolar e cultura osteoclastos em vitro^12,13. Enquanto várias induções baseadas em RANKL osteoclast têm sido descritos^13,14,15, o presente estudo descreveu um protocolo com algumas modificações com base em métodos anteriores.

No estudo anterior, BMMs foram chapeamento imediatamente após isolamento^14,15. É recomendável que BMMs foram cultivadas com meio básico durante a noite antes de chapeamento de isolar BMMs de células-tronco mesenquimais e fibroblastos, que imediatamente aderem ao prato. M-CSF pode promover a proliferação de monócitos para precursores osteoclasto e estimular precursores osteoclast para expressar RANK que vincula RANKL e então induz a formação de osteoclastos maduros^6,16,17. Portanto, em nosso estudo, os BMMs foram induzidas com 10 ng/mL, M-CSF durante 3 dias antes da indução de osteoclasto, em vez para indução de osteoclast no segundo dia após¹⁵de chapeamento. A densidade celular é fundamental para formação de osteoclast em vitro. Recomenda-se que 25.000 BMMs foram semeadas em cada poço de uma sequência de placa de 96 poços por 3 dias de incubação com 10 ng/mL, M-CSF. Quando a confluência de célula atingiu 80 – 90%, é um tempo adequado para indução osteoclast RANKL. Geralmente, amadurecem formulário osteoclastos no dia 6. A razão mais comum para alguns osteoclastos é densidade celular de qualidade inferior, que pode ser o resultado de uma baixa densidade de semeadura ou viabilidade celular baixo. BMMs são delicadas células primárias e precisam ser tratados com cuidado. Mantendo o osso no gelo por muito tempo ou resuspending vigorosamente diminui a viabilidade de BMMs e posteriormente prejudica a formação de osteoclastos. Assim, a densidade de semeadura ideal de BMMs viáveis é fundamental para a obtenção de um grande número de osteoclastos.

A atividade secretora armadilha é crítica para a reabsorção óssea osteoclástica. Neste estudo, descrevemos um método para analisar quantitativamente a atividade secretora armadilha em meio de cultura. A mudança de atividade de armadilha em meio de cultura pode resultar de alterações de número osteoclast ou armadilha secretora de osteoclast ou uma combinação de ambos. Assim, este pode ser um método útil para analisar osteoclast função em vitro juntamente com o ensaio de reabsorção osteoclast descrito anteriormente¹⁸.

mTOR é uma conservado evolutivamente proteína quinase que pode regular⁹, de metabolismo e diferenciação celular. Neste estudo, encontramos que essa mTORC1 desempenhou um papel importante na reabsorção óssea, regulando a formação de osteoclasto. mTORC1 pode ser um potencial alvo farmacológico para o tratamento de doenças metabólicas ósseas como a osteoporose no futuro.

Em resumo, nosso protocolo para indução de osteoclast com sucesso resultou em um grande número de osteoclastos gigante em vitro e nossos dados sugerem que mTORC1 é fundamental para a formação do osteoclast.

Todos os autores afirmam que eles não têm nenhum conflito de interesses.

Os autores Obrigado Dr. Minghan Tong e S. Kato para ratos e gentilmente fornecendo reagentes. Agradecemos os membros do laboratório Zou para debates úteis. Este trabalho foi financiado em parte por subvenções de 973 programa do ministério chinês da ciência e tecnologia (a maioria) [2014CB964704 e 2015CB964503], programa de pesquisa clínica do Hospital do povo 9, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Obrigado pela ajuda de instalação de núcleo de biologia celular e facilidade do núcleo para a biologia química, CAS centro de excelência em Molecular célula ciência, Shanghai Instituto de Bioquímica e biologia celular, Academia Chinesa de Ciências.