Расширение и адипогенез Индукция адипоцитов-предшественников из периваскулярной жировой ткани, изолированной магнитоактивированной сортировкой клеток

Здесь мы сообщаем о способе выделения популяций клеток-предшественников Adipocyte (APC) из периваскулярной жировой ткани (PVAT) с использованием магнитно-активированной сортировки клеток (MCS). Этот метод позволяет увеличить выделение APC на грамм жировой ткани по сравнению с флуоресцентно-активированной сортировкой клеток (FACS).

Расширение периваскулярной жировой ткани (PVAT), основного регулятора сосудистой функции через паракринную сигнализацию, напрямую связано с развитием гипертонии во время ожирения. Степень гипертрофии и гиперплазии зависит от местонахождения депо, пола и типа фенотипов клеток-предшественников адипоцитов (APC). Методы, используемые для изоляции APC и преадипоцитов за последние 10 лет, значительно повысили точность, с которой отдельные клетки могут быть идентифицированы на основе определенных маркеров поверхности клеток. Однако выделение APC и адипоцитов может быть проблемой из-за хрупкости клетки, особенно если интактная клетка должна быть сохранена для применений клеточной культуры.

Магнитно-активированная сортировка клеток ( MCS) обеспечивает метод выделения большего числа жизнеспособных APC на единицу веса жировой ткани. APC, собранный MCS, может использоваться для протоколов in vitro для расширения preaДипоциты и дифференцировать их в адипоциты с использованием коктейлей фактора роста, позволяющих анализировать плодовитый и адипогенный потенциал, сохраняемый клетками. Этот эксперимент был сосредоточен на аортальных и брыжеечных складах PVAT, которые играют ключевую роль в развитии сердечно-сосудистых заболеваний во время расширения. Эти протоколы описывают методы выделения, расширения и дифференциации определенной совокупности APC. Этот протокол MCS позволяет использовать изоляцию в любом эксперименте, в котором требуется сортировка ячейки с минимальным оборудованием или обучением. Эти методы могут помочь в дальнейших экспериментах для определения функциональности конкретных популяций клеток на основе присутствия маркеров клеточной поверхности.

Периваскулярная жировая ткань (PVAT), из-за ее непосредственной близости к кровеносным сосудам, является основным сигнальным компонентом паракрина в функции сосудов. Расширение этой жировой ткани зависит от фенотипа клеток-предшественников Adipocyte (APC), присутствующих ^{2 , 3} . Выделение клеток из жировых тканей затруднено, поскольку первичные адипоциты являются хрупкими, плавучими и имеют размер. Некоторые методы изоляции также могут изменять фенотип и морфологию клеток путем увеличения синтеза воспалительных белков и уменьшения экспрессии адипогенного гена ⁴ , подчеркивая важность протокола, который поддерживает целостность клеток.

Культура первичных клеток и специфических субпопуляций преадипоцитов дает редукционистский подход к росту in vivo и поддерживает эквивалентный клеточный генетический состав ⁵ , хотя работа tiЯ с этими клетками ограничен из-за ухудшения со старением или старения ⁶ . Preadipocytes из различных жировых складов, в том числе подкожных и оментальных складов, также демонстрируют различия в пролиферации ⁷ , что подчеркивает важность сбора клеток из конкретных анатомических сайтов. Ячейки-предшественники из не-PVAT белых жировых депо были охарактеризованы в предыдущих исследованиях ^{7 , 8 , 9} , но меньше известно о фенотипах PVAT APC.

Описанные здесь методы позволяют анализировать конкретные и определенные популяции APC с минимальным воздействием на их морфологию, жизнеспособность и потенциал для пролиферации и дифференциации. Магнитоактивированная сортировка клеток (MCS) применима к нисходящим приложениям, таким как культура, поскольку шарики растворяются без изменения ячейки. MCS также является экономичным, и как только антитело conЦентровки были стандартизированы, потребность в анализе проточной цитометрии минимальна. Исследования in vitro с предшественниками PVAT также могут дать представление о потенциале, который могут иметь эти первичные клетки.

Все процедуры, описанные в настоящем документе, следуют руководящим принципам, установленным Институтом по уходу и использованию животных (IACUC) Мичиганского государственного университета. Все буферы и медиа должны быть защищены от света.

1. Подготовка буферов, средств массовой информации и инструментов

1. Приготовить раствор Кребса Рингера с бикарбонатом-буферным раствором (KRBB): 135 мМ хлорида натрия, 5 мМ хлорида калия, 1 мМ сульфата магния, 0,4 мМ двухосновного фосфата калия, 5,5 мМ глюкозы, 1% антибиотика / антимикотика (10000 единиц / мл пенициллина, 10000 мкг / Мл стрептомицина, 25 мкг / мл амфотерицина В) и 10 мМ HEPES (pH = 7,4). Этот раствор стабилен в течение 3 недель при хранении в стерильном состоянии и при 4 ° С.
2. Подготовьте раствор коллагеназы типа 1: 1 мг / мл в KRBB с 4% альбумином бычьей сыворотки (BSA). Этот раствор следует поддерживать при 37 ° C и стабилен в течение 4 часов.
3. Подготовьте раствор буфера для лизиса эритроцитов: 154 мМ хлорида аммония, 10 мМ бикарбоната калия, И 0,1 мМ ЭДТА. Хранить при температуре 4 ° C в течение одного месяца.
4. Подготовка буферного блока MCS: DMMS / F12, 10% фетальная бычья сыворотка (FBS), 5% нормальная сыворотка осла, 40 мкл / мл F (ab) Фрагмент Donkey Anti-Rat IgG. Хранить при температуре 4 ° C в течение одного месяца.
5. Подготовьте буферный раствор MCS: солевой раствор с фосфатным буфером (PBS, pH = 7,5), 0,5% BSA и 2 мМ EDTA. Хранить при температуре 4 ° C в течение одного месяца. Раствор дегаза нагревают до 37 ° С в стеклянном контейнере, а затем применяют вакуум в течение 15 с. Оставьте неиспользованную буферную печать.
6. Подготовить основную среду стромальной сосудистой фракции (SVF): модифицированная Дульбекко среда орлов (DMEM): F12, 15% сыворотка плода теленка (FCS), 1% антибиотик / антимикотик (10000 единиц / мл пенициллина, 10000 мкг / мл стрептомицина, 25 мкг / Мл амфотерицина В), 44,05 мМ бикарбоната натрия, 100 мкМ аскорбиновой кислоты, 33 мкМ биотина, 17 мкМ пантотената, 2 мМ L-глутамина и 20 мМ HEPES. Держите стерильным и при 4 ° C в течение 2 недель.
7. Подготовьте APC &# 160; медиа: базальная среда с дополнительными факторами роста, включая эпидермальный фактор роста 10 нг / мл), фактор ингибирования лейкемии (10 нг / мл), тромбоцитарный фактор роста BB (10 нг / мл) и основной фактор роста фибробластов ( 5 нг / мл). Держите стерильным и при 4 ° C в течение 2 недель.
8. Подготовить Индукционные среды APC: APC Media с 10% FBS, 2,5 мкг / мл инсулина, 0,5 мМ 2-изобутил-1-метилаксантина (IBMX), 1 мкМ дексаметазона и 200 мкМ T3 (трийодтиронин тиреоидный гормон). Держите стерильным и при 4 ° C в течение 2 недель.

2. Изоляция предшественников адипоцитов

1. Анестезируйте крысу в соответствии с институциональными руководящими принципами. Поместите крысу в дорзальное положение. Подтвердите глубину анестезии через пальцы и потерю рефлекторного ответа на этот болезненный раздражитель.
   ПРИМЕЧАНИЕ. В этом протоколе используются 10-недельные крысы Sprague Dawley и 70 мг / кг пентобарбитала, полученные через внутрибрюшинную инъекцию.
2. Сделайте вертикальный срединный разрез wС ножницами вдоль грудины в грудной области и в промежностной области. Получите доступ к брюшной полости и выведите верхнюю брыжеечную артерию, небольшие сосуды для брыжеечной инсульт (mPVAT) и грудную аорту (aPVAT).
   1. Разделите все соединения с брыжейкой и аортой и удалите сосуды с животных. Изолируйте PVAT с помощью рассекающего микроскопа и чашки Петри, заполненной KRBB, для просмотра сосудов и выделения PVAT.
   2. В этом эксперименте собирайте гонадальную (GON) жировую, чтобы представлять не-PVAT жировое депо. Поместите изолированные жировые накладки на лед в KRBB с 10 мМ HEPES (pH = 7,4).
   3. В кожухе для биобезопасности перенесите около 50 мг ткани в 1,7 мл пробирку с 1 мл раствора коллагеназы типа I и мице с тканевыми ножницами (1 - 3 мм).
3. Дайте образцы, инкубируя при 37 ° C в инкубаторе для гриля (или инкубаторе с орбитальным шейкере) в течение 1 часа. В кожухе для биобезопасности последовательно фильтруйте переваренный материал через 100 и 40 Μm в пробирку объемом 50 мл. Центрифугируют полученный фильтрат при 4 ° С в течение 10 мин при 300 × g.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Все шаги в этом протоколе вперед должны выполняться в шкафу для биобезопасности, чтобы держать клетки стерильными.
4. Вылейте супернатант и ресуспендированные гранулы, содержащие клетки SVF, в 1 мл 1X раствора буфера для лизиса эритроцитов и перенесите в микроцентрифужную пробирку объемом 1,7 мл. Инкубируйте клетки в течение 5 мин при комнатной температуре, защищенные от света и центрифугирования при 4 ° С в течение 5 мин при 300 х g.
5. Вылейте супернатант и повторно суспендируйте оставшийся осадок клеток в SVF Basal Media. Соберите 20 мкл суб-выборки для подсчета живых клеток с помощью Trypan Blue Solution.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Количество ячеек SVF, которые могут быть выделены, зависит от сайта. Среднее количество собранных SVF на мг ткани: aPVAT = 5,0 ± 2,0 × 10 ³ , mPVAT = 1,04 ± 0,62 × 10 ⁴ , GON = 2,4 ± 1,2 × ^{10 5} .

3. Магнитоактивированная сортировка клеток

1. Спиновые клетки в течение 5 мин при 300 × g. Вылейте супернатант и ресуспендируйте осадок клеток в блокирующем буфере MCS при 1 × 10 ⁶ клеток / мл и инкубируйте в течение 20 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Клеточные суспензии 1 × 10 ⁶ - 2 × 10 ⁸ клеток / мл можно эффективно отделить.
2. Инкубируйте клетки с 5 мкл FITC-конъюгированного мышиного анти-CD34 (1 мкг / 1 × 10 ⁶ клеток) в течение 30 минут при 4 ° C. Спиновые клетки в течение 5 мин при 300 xg и 4 ° C.
   1. Инкубируйте 4 мкл микрочипов против FITC и 96 мкл буфера MCS (общий объем 100 мкл) в течение 5 мин при 4 ° C в темноте для отделения CD34 ⁺ и CD34-клеток.
3. Прикрепите магнитный сепаратор к подставке и поместите колонку MultiSort (MS) с крыльями колонны спереди, в разделитель. Поместите 5 млСборной трубки под колонкой MS в верхнем держателе трубки.
4. Подготовьте колонку MS с помощью промывки буфером MCS. Примените 500 мкл буфера MCS поверх столбца и пропустите буфер. Откажитесь от сточных вод и замените собирающую трубку.
5. Загрузите антитело, помеченное клеточной суспензией, на подготовленную колонку MS. Собирайте поток, содержащий немаркированные клетки.
6. Вымойте MS колонку с 500 мкл дегазированного буфера MCS 3x. Соберите немаркированные ячейки, которые проходят и соединяются с потоком с предыдущего шага.
7. Удалите колонку MS из магнитного сепаратора и поместите ее на новую трубку для сбора. Пипеткой 1 мл буфера MCS на колонку MS. Немедленно промойте фракцию магнитомаркированными ячейками прочно, но медленно, используя плунжер, поставляемый с колонкой, чтобы не допустить избыточного газа в колонну.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Изолированные номера ячеек будут меняться по сайту. Среднее количество CD34 ⁺ APC, выделенное из популяции SVF заМг ткани: aPVAT = 2,6 ± 0,43 × 10 ² , mPVAT = 9,6 ± 1,4 × 10 ² , GON = 1,3 ± 0,22 × 10 ³ .
8. Спиновые клетки в течение 5 мин при 300 × g и 4 ° C. Инкубируйте фракцию CD34 ^+, собранную в 10 мкл раствора 1: 200/1 × 10 ⁶ клеток Rabbit anti-PDGFR в течение 30 мин при 4 ° C.
   1. Центрифужные клетки снова в течение 5 мин при 300 xg и 4 ° C. Инкубируйте меченые клетки с помощью 4 мкл микробега с кроличьим IgG и 96 мкл буфера MCS, повторяя этапы с 3.3 по 3.7 для выделения.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Изолированные номера ячеек будут меняться по сайту. Среднее количество PDGFRα ⁺ APC, выделенное из CD34 ⁺ популяции на мг ткани, составляет: aPVAT = 2,4 ± 0,64, mPVAT = 8,4 ± 2,4, GON = 10,4 ± 1,9, что составляет 0,5-10% от ранее выделенной популяции.

4. Культура клеток и индукция адипогенеза

1. Культура SVFИ APC в 6-луночных планшетах для культивирования тканей в базальной среде с заменой каждые 2 дня. После 3 последовательных проходов пластинку в черных 96-луночных планшетах для культивирования ткани в ячейках ¹ ч10 ² ч / лунку для анализов пролиферации, которые оценивают через 8, 24, 48 и 96 ч и 50 000 клеток / лунку в 24-луночных планшетах или 10 000 клеток / лунку в 48-луночных планшетах для культивирования тканей для анализа адипогенеза, которые являются качественными и количественными.
2. Дополнить базальную среду APC в течение 48 ч после слияния и до индукции с морфогенным белком кости 4 (3,3 нмоль / л), как указано для дифференциации ¹⁰ . Индуцировать клетки через 48 ч 100% слияния (день 0) с использованием Индукционной среды APC для инкубации клеток.
3. Через 48 часов смените носитель для поддержания клеток в индукционной среде APC без IBMX и дексаметазона в течение 14 дней с изменениями среды каждые 48 часов.
4. Изоляция MCS, подтвержденная FACS.
   1. Возьмите 50 мкл (50 000 клеток) суб-образец магнитной сепарацииИ промывают раствором FACS.
   2. Центрифужные клетки и ресуспендируют в 100 мкл 1: 1000 раствора ослиного антикроличного IgG Dylight 405 для маркировки клеток PDGFRα ⁺ . Инкубируйте в течение 30 минут, защищенных от света и при 4 ° C.
   3. Промывают клетки и ресуспендируют в 200 мкл 2% -ного раствора формальдегида до времени для анализа с использованием фильтров 488 нм (FITC) и 405 нм (Dylight 405) на проточном цитометре.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Накопление липидов культивированными клетками количественно оценивают с использованием анализа флуоресценции липофильного адипогенеза в микропланшет-ридере, измеряющем флуоресценцию, и используют преадипоциты в качестве калибраторов для накопления липидов. Концентрация липидов также качественно измеряется окрашиванием липидным красителем и визуализацией, выполненной на инвертированном микроскопе, оснащенном камерой, что составляет процент от общего количества клеток, которые имеют или не содержат липидного наблюдаемого. Любой считыватель пластинок, способный измерять флуоресценцию с возбуждением при 485 нм и эмиссию при 572Нм подходит для анализа, а также любого микроскопа с камерой, способной захватывать цифровые изображения.

Пролиферативная способность преадипоцитов и адипогенный потенциал предшественников адипоцитов являются характеристиками, которые поддерживаются in vitro ¹¹ . Пролиферацию in vitro изолированных SVF и APC из aPVAT, mPVAT и GON самцов крыс оценивали через 8, 24, 48 и 96 ч после нанесения покрытия с использованием количественного анализа ДНК. Никаких различий в частоте расширения SVF не наблюдалось в любой момент времени, за исключением APC из aPVAT, у которого было меньше пролиферации на 96 ч по сравнению с клетками SVF с того же сайта ( рисунок 1 ).

Конфлюентный АРС, стимулированный морфогенным белком костей 4 (BMP4) в течение 48 ч перед стандартной индукцией ^12, показал дифференциацию. Это было видно из-за большего накопления липидов в капельках, как оценивалось как методом анализа флуоресцентного липида ( рисунок 2A ) и масляного красного окрашивания ( рисунок 2 B ).

При сравнении выхода APC изоляция MCS обеспечивала большее количество клеток, готовых к культивированию, по сравнению с FACS. ( Рисунок 3 ). Важно отметить, что распределение и жизнеспособность популяций APC (CD34 ⁺ и PDGFRα ⁺ ) были сходными между MCS и FACS. Жизнеспособность клеток, определяемая окрашиванием Trypan Blue для подсчета постсоединений, была одинаковой для обеих процедур изоляции (FACS = 71,57 ± 11,09, MCS = 79,25% ± 7,47). Эти данные показывают, что изоляция MCS APC дает большее количество жизнеспособных APC по сравнению с MCS.

Рисунок 1 : Распространение рекламы in vitroКлетки-предшественники ipocyte (APC) подвержены анатомическому расположению. Стромальная сосудистая фракция (SVF) и APC были выделены из аортальной и брыжеечной периваскулярной жировой ткани (aPVAT и mPVAT соответственно) и гонадальной жировой ткани у 10-недельных самцов крыс. Пролиферацию клеток измеряли с помощью анализа количественной оценки ДНК в моменты времени 8, 24, 48 и 96 часов после посева. Данные выражаются как увеличение складки за 8 ч базовой линии ± SEM (N = 4). Значение обозначается * (P <0,05). Рисунок, измененный от Contreras et al . 2016 ¹³ . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2 : Аддипоцитарные клетки-предшественники (APC).Способности между депо, но большее накопление липидов по сравнению со стромальной сосудистой фракцией (SVF). Клетки индуцировали через 48 ч слияния и подвергали воздействию BMP4 с последующим 48 ч воздействием дексаметазона и 3-изобутил-1-метилксантина, а затем поддерживали в поддерживающей среде 14 дней с изменением среды каждые 48 часов. ( A ) Анализ поглощения липидов дифференцированного APC с данными, выраженными как отношение недифференцированных преадипоцитов: дифференцированные адипоциты (преадипоциты: адипоциты) в относительных единицах флуоресценции (RFU) ± SEM (N = 4). ( B ) Окрашивание масла Red O (ORO) APC и SVF с данными, выраженными в процентах от клеток с липидом (поглощение ORO) ± SEM (N = 4). Значение обозначается * (P <0,05). Рисунок, измененный от Contreras et al. 2016 ¹³ . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3 : Выход изолята жизнеспособных клеток-предшественников адипоцитов (APC) улучшается с помощью магнитно-активированной сортировки клеток (MCS). Экспрессия поверхностного маркера CD34 ⁺ ( A ) и PDGFRα ⁺ ( B ) в SVF, выделенном из периваскулярных жировых тканей (аорта = aPVAT, mesenteric = mPVAT) с использованием MCS и FACS. Данные выражаются в виде среднего количества клеток, выделенных из 50 мг ткани - SEM (N = 4). Значение обозначается * (P <0,05). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Центральным направлением настоящего эксперимента является изоляция, расширение и адипогенная индукция APC из хранилищ PVAT. Здесь мы представляем протокол для выделения APC на основе идентификации клеток, экспрессирующих поверхностные маркеры CD34 и PDGFRα. Эти поверхностные белки были ранее идентифицированы на APC с высокими скоростями пролиферации и возможностью дифференцироваться в белые или коричневые адипоциты в различных жировых депо ^{14 , 15} . Выбирая клетки на основе этих специфических маркеров, мы смогли выделить похожие популяции APC из нескольких жировых депо, которые соответствуют фенотипу адипоцитов, который наблюдается в выбранном PVAT ¹³ . В наших экспериментах мы улучшили дифференциацию APC, добавив фактор роста BMP4. Ранее Macotela и его коллеги продемонстрировали, что у конкретных популяций APC из висцеральных жировых складов активность BMP меньше, чем уПодкожные депо при дифференцировке, если культуральная среда не была дополнена адипогенными факторами роста BMP2 или BMP4 ^{12 , 16 , 17 , 18} .

Поскольку выделение отдельных клеток из жировой ткани затруднено из-за хрупкости клеток, использование MCS обеспечивает эффективный метод изоляции клеток при меньшей стоимости расходных материалов, оборудования и учебных ресурсов. Важно отметить, что выход APC может зависеть от возраста или размера животного, а также от изменения температуры среды и неспособности поддерживать стерильную среду изоляции. Культивирование клеток в нормоксии также важно для пролиферации и дифференцировки ¹⁹ , поэтому поддержание условий инкубационного воздуха является неотъемлемой частью практики культуры. Скорости центрифугирования могут быть увеличены до 800 xg, если достаточное количество клеточных гранул не образуется в течение tОн изоляционный процесс. Также может потребоваться проверка истечения антител, поскольку конъюгированный флуорохром FITC может со временем ухудшаться. Изменение количества коллагеназы типа I может также потребовать внесения изменений в процедуры пищеварения, поскольку партии могут варьироваться в зависимости от потенции. При использовании другого вида, кроме крысы, специфическая сыворотка и IgG в блокирующем буфере также могут быть необходимы, если виды хозяина антител отличаются от тех, которые используются здесь.

Среди преимуществ MCS над FACS заключается в том, что экономически выгоднее, чем FACS, поскольку комплекты недороги и могут быть легко приобретены. Это также позволяет избежать приобретения, обслуживания и использования проточного цитометра. Использование MCS также допускает специфическое связывание без регулировки ворот для выбора и фоновой флуоресценции.

Ограничением для этого исследования является то, что он полагался на два маркера поверхности preadipocyte. Другие поверхностные маркеры preadipocyte приверженности и различийБыли выявлены инициации, такие как Zfp423, Sca1 и CD24, ^{20 , 21} . Эти маркеры могут точно идентифицировать выделенные клетки-предшественники адипоцитов конкретных фенотипов; Однако используемые здесь поверхностные маркеры были выбраны, поскольку клетки, экспрессирующие эти маркеры, обладают способностью индуцировать как коричневые, так и белые фенотипы ^{20 , 21} . Другим ограничением этого исследования было выборочное использование факторов роста в культуре APC. Другие коктейли фактора роста были эффективны при индукции адипогенеза ²² . Клеточная культура в этом исследовании также была ограничена тем фактом, что вся культура была выполнена в двухмерных культуральных планшетах. Хотя это норма культуры, клетки in vivo не размножаются таким образом. Культивирование в трехмерных средах может позволить дальнейшую гипертрофию и гиперплазию, поскольку она реплицирует естественную форму жировой стRucture ²³ .

Из-за практичности и эффективности использования MCS этот протокол идеально подходит для изоляции APC, а также других типов ячеек в PVAT. Эта процедура также обеспечивает более эффективный способ индуцировать дифференциацию в культурах преадипоцитов. Минимальные затраты, оборудование и необходимое обучение позволяют использовать этот метод в любой лаборатории, желающей изолировать клетки на основе определенных поверхностных маркеров. Будущие приложения могут позволить изолировать другие популяции клеток или использовать более конкретные клеточные маркеры. Использование коктейлей фактора роста в приверженности клеткам может быть полезно при активации стволовых клеток

Авторам нечего раскрывать.

Лаборатории Контрераса и Ватта и доктора Уильяма Рафаэля. Эти эксперименты поддерживали NHLBI F31 HL128035-01 (стандартизация протокола пищеварения), NHLBI 5R01HL117847-02 и 2P01HL070687-11A1 (животные) и NHLBI 5R01HL117847-02 (выделение клеток и культура).