Декстран повышает эффективность лентивирусные трансдукции мышиных и человеческие клетки первичной

Цель этого исследования заключалась в разработке технологий, которые позволяют для успешного гена трансдукции в первичной естественной убийца (НК) клетки. Декстран опосредованной лентивирусные трансдукции человека или мыши первичной NK клеток приводит к более высокую эффективность выражения гена. Этот метод гена трансдукции значительно улучшит NK клеток генетические манипуляции.

Эффективное трансдукции специфических генов в естественных убийца (НК) клетки был серьезной проблемой. Успешное transductions имеют решающее значение для определения роли гена интереса в разработке, дифференциация и функции НК-клеток. Последние достижения, связанные с химерных антигена рецепторов (машин) в Рак иммунотерапия подчеркнет необходимость эффективным способом доставить экзогенных генов эффекторные лимфоциты. Эффективность лентивирусные опосредованной гена transductions в первичной человека или мыши НК-клетки остаются значительно низкими, который является основным сдерживающим фактором. Последние достижения, с использованием катионных полимеров, таких как Полибрен, показывают эффективность трансдукции улучшение ген в Т-клеток. Однако эти продукты не удалось улучшить эффективность трансдукции НК-клеток. Это работа показывает, что декстрана, разветвленные глюкан полисахарид, значительно повышает эффективность трансдукции человека и первичных НК-клеток мыши. Эта методология высокую воспроизводимость трансдукции предоставляет компетентным инструмент для преобразования человека первичной НК-клеток, которые можно значительно улучшить клинические гена доставки приложений и, таким образом, NK на основе ячеек Рак иммунотерапия.

Природные убийца (НК) клетки являются основными лимфоцитарный населения врожденной иммунной системы¹. НК-клетки функционируют как защитники первой линии иммунного ответа против опухоли и инфекции^2,3,4. НК-клетки также играть центральную роль в развитии терпимости через секрецию цитокинов мощным и chemokines⁵. Благодаря мощным способности и ликвидации опухолевых клеток в настоящее время проводятся многочисленные клинические испытания для оценки доноров производные человеческих клеток NK как адоптивной иммунотерапии рака^6,7. В отличие от Т-клеток биология развития НК-клеток имеет пока быть хорошо изученных⁸. Этот недостаток знаний является частично из-за отсутствия эффективных методов, которые обеспечивают генов интерес к мыши или первичной NK клеток человека. По этим причинам большинство НК клеток исследования были проведены в клеточных линий, а не в Главные ячейки. Таким образом необходимость надежного и эффективного протокола передавать первичной НК-клеток с генами интерес имеет решающее значение.

Общая цель этого исследования заключалась в разработке последовательного и надежный метод, по которому первичного человека или мышиных НК-клеток может преобразованы с lenti - или ретровирусы.

Были выполнены более ранних исследований, которые пытались решить эту проблему, главным образом с помощью переходных преобразования первичного НК-клеток. Это включает плазмида трансфекции^9,10, вирус Эпштейна - Барр (EBV) / ретровирусной гибрид вектор¹¹, коровью векторные^12,13и Ad5/F35 химерных векторов аденовирусных¹⁴. Несмотря на скромные эффективность этих методов преходящий характер трансдукции делает их непригодными для долгосрочного использования генетически модифицированных НК-клеток. Несколько недавних исследований использовали ретровиральных векторов передавать НК-клеток, требуется проведение нескольких циклов инфекции для достижения приемлемого уровня ген выражение^11,15. В отличие от ретровиральных векторов лентивирусные векторы можно использовать клетки хозяина ядерного импорта техники для перемещать вирусный комплекс предварительных интеграции в ядре. Это является основным сдерживающим фактором в репликации вируса в-деления клеток, которые включают основной НК-клеток.

Взаимодействие между различными клетк поверхности рецепторы и вирусных частиц позволяют вирусный поглощения в клетку. Первоначальные обязательства между вирусной конверт белков и их рецепторов родственных узлов может быть ограничена из-за потенциальными отрицательными зарядами, существующие между этими двумя. Многие методы трансдукции объясняется что добавление катионных полимеров, таких как Полибрен (Pb), протамина сульфат (PS) или декстрана, могут дать положительный заряд с рецепторами клеточной поверхности и тем самым увеличить привязки вирусных конверт белки. Это увеличит эффективность слияние и поглощение вирусных частиц на клетки¹⁶. Хотя сообщалось, что Pb или PS может улучшить передачу генов в клетки T¹⁷, их применение не никакого эффекта в электромеханической эффективности первичного НК-клеток. Кроме того сравнительный анализ этих реагентов с использованием первичных НК-клетки не была выполнена. В этом исследовании сравнивали электромеханической эффективности трех катионных полимеров. Результаты показывают, что среди этих трех катионных полимеров, только декстрана значительно повышает эффективные вирусный трансдукции как мышь, так и первичной NK клеток человека.

Все животные протоколы следовать гуманным и этического лечения животных и были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в пределах центра биомедицинских исследований (BRC) из медицинского колледжа штата Висконсин (ЗМК), Милуоки, WI. Использования в мононуклеарных клеток периферической крови человека (получения) был одобрен институционального обзора (КИБ) крови научно-исследовательского института из крови центр штата Висконсин, Милуоки, Висконсин.

1. мышей, клеточных линий и векторы

1. Получите мышей C57BL/6 от коммерческих поставщиков. Сохранить мыши колонии в условиях возбудителя бесплатно и использовать мышь женского и мужского пола в возрасте от 6 до 12 недель. Получите обезличенных человека получения от IRB утвержденных источников.
2. Анестезировать животных со смесью 20-30% v/v изофлюрановая в пропилен гликоль (1, 2-пропандиола, USP класс) чтобы анестезировать мышей. Применять мазь ветеринара для глаз для предотвращения сухости, в то время как мыши находятся под наркозом.
3. Чтобы усыпить животных, выполните шейки матки дислокации после индукции анестезии.
   1. Останови мышей, твердо держа основание хвоста с одной рукой. Место крепкие палки тип пера или пальца и первым пальцем другой руки против задней части шеи, в основании черепа.
   2. Производить дислокации, вставьте руку, сдерживающих голова животного вперед и надавите потянув назад с рукой, держа хвост базы. Проверьте эффективность дислокации, чувство для разделения ткани шейки матки.
4. Держать животных в клетке камеру, по крайней мере 5 минут и удалите их, только когда дыхательную активность отсутствует или когда есть отсутствие обнаружению пакета пульса.
5. Получить клетках K562 и МЦ-1 от коммерческих поставщиков и поддерживать их в RPMI1640 среде, содержащей 10% тепло инактивированная FBS. Проверьте эти клеточные линии периодически, чтобы исключить возможность заражения микоплазмы.

2. Подготовка и титрование лентивирусные векторы

1. Культуры 5 × 10⁶ 293T клеток на ночь в колбе² см T75, содержащий решение 20 мл RPMI1640 среды с 10% FBS, 100 ед/мл пенициллин, стрептомицин 100 мкг/мл, пируват натрия 1 мм, 5%, 7,5% раствора бикарбоната натрия и 0,001% Β-меркаптоэтанол. Место колбу в инкубаторе 37 ° C, infused с 5,2% CO₂.
2. Урожай 293T клетки, с помощью трипсина (0.025%)/EDTA (1 мм) в фосфат амортизированное saline (PBS). Добавьте 5 мл трипсина/ЭДТА в PBS и инкубировать и фляги для 10 минут при 37 ° C инкубатор разрешить отряд 293T клеток из T75 см² фляги.
   1. Собирать отдельные клетки и мыть их дважды в PBS для удаления любых следов трипсина и ЭДТА. Подсчет количества ячеек с Горяева и настроить мобильный номер один миллион клеток / мл.
3. Transfect 293T клетки¹⁸ с 3,95 мкг psPAX2, 1.32 мкг pMD2G и 5.26 мкг ОРЗЗ GFP-Пуро (порожденных собственными силами в BRI клонирования EF1alpha промоутер от pWPI вместо ЦМВ промоутер в pLenti ЦМВ-GFP-Puro)¹⁹.
   1. Подготовка 1 мл 150 мм NaCl плюс 63 мкл polyethylenimine 0,6 мг/мл (пей; 25 000 kD, линейная). Хорошо перемешайте и затем добавить плазмиды и перемешать. Проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре, а затем добавить его в клетки.
   2. 16 h после трансфекции, заменить трансфекции среднего со свежими средний плюс 4,5 мм натрия бутират. Урожай супернатанта, содержащий вирус 48 ч после transfection и сконцентрировать центрифугированием ночи на 5000 × g. Смотрите таблицу материалов.
4. Определить вирусную титры, с помощью 293T клетки, выполнив серийных разведений и анализа потока цитометрии 72 ч после трансдукции²⁰. Используйте выражение зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) в качестве меры для количественного определения вирусных титры.

3. Очистка и расширение мышиных первичных НК-клеток

1. Очищают мышиных первичных клеток NK²¹. Вкратце передайте одноклеточных селезенки суспензий через столбцы шерсть нейлон истощения адэрентных популяций, состоящий из лимфоцитов и макрофагов.
2. Культура, население не сторонник этого eluted из столбца шерсть нейлон, содержащий мышиных НК-клеток с 1000 ед/мл интерлейкина -2 (IL) в RPMI1640 среде с 10% FBS, 100 ед/мл пенициллин, стрептомицин 100 мкг/мл, 1 мм пируват натрия, 5% бикарбоната натрия 7,5% решение и 0,001% β-меркаптоэтанол (RPMI1640 полный средний).
3. Изменения среды из колбы на 4 день этой культуры, чтобы удалить не сторонник T и NKT клетки; клетки, которые по-прежнему соблюдать колбы в основном НК-клеток. Добавьте 20 мл свежего RPMI1640 полного среднего и 1000 ед/мл IL-2 пополнить колбы.
4. Проверить чистоту мышиных NK клеточных культур на 7 день подачей cytometry с NK клеток специфических маркеров²⁰ с использованием препаратов с более чем 95% CD3^–NK1.1⁺ населения.

4. Очистка и расширение первичного NK клеток человека

1. Изолируйте репликацию, градиент плотности от Баффи пальто здоровых добровольцах. Вкратце, тщательно слой 35 мл половину разбавляют (HBSS) клеток более 15 мл градиент плотности в 50-мл канонические трубку. Центрифуга на 400 × г за 30 мин при 20 ° C в размахивая ведро ротора без тормозов.
2. Используйте комплекты коммерческих антител-отбора на основе негативных для очистки человека первичной НК-клеток по данным производителя протокол.
3. После изоляции определите чистоту препаратов NK клеток с помощью иммунофлуоресцентного анализа. Пятно NK клеток препараты с 2 мкг/мл анти CD3 и 2 антитела анти CD56 мкг/мл при температуре 4 ° C для 20 минут вымыть клетки дважды с PBS NK клеточных популяций определяется отсутствие CD3 и присутствие CD56 на поверхности клеток.
4. Инкубации клеток подготовки с антителами к 20 мин при температуре 4 ° C, мыть с PBS и анализировать в проточный цитометр. Использовать препараты NK клеток с более чем 85% чистоты для трансдукции гена assays²⁰.

5. трансдукции мышиных и человека первичной НК-клеток с человека

1. Приостановить мыши или первичной НК клеток человека в пластине 24-Ну на 0.5/мл⁵× 10 средних присутствии GFP человека супернатант в 5, 10 и 20 кратности инфекции (МВД) и в присутствии Pb (8 мкг/мл), PS (8 мкг/мл) или декстрана (8 мкг/мл).
2. Центрифуга пластины на 1000 g × 60 мин.
3. Без декантирующие супернатанта, культура клетки на ночь (16-18 ч) в инкубаторе 37 ° C, infused с 5,2% CO_2.
4. Вымойте с 10 мл PBS и Ресуспензируйте в 2 мл полной питательной среды RPMI1640 присутствии Ил-2 (300 ед/мл).
5. Протестировать человека и мыши первичного НК клеточный цитотоксичность против K562 и МЦ-1, соответственно, выполняя ⁵¹хрома (Cr)-релиз анализов в разнообразных коэффициентов эффекторных целевой ячейки²².
   1. Вкратце дают один миллион целевой ячейки 50 Μки radiolabeled натрия хромат ⁵¹Cr. Во время 4-h инкубации они поглощение ⁵¹Cr в клеточных белков. В конце инкубации Вымойте клетки для удаления любых неприсоединенной подписи.
   2. Вычислить конкретные опухоли лизис клеток, количество абсолютной, спонтанный и экспериментальный выпуск ⁵¹Cr из клеток-мишеней.
      Примечание: Расчет доли конкретных лизис из pentaplicate экспериментов было сделано с помощью следующего уравнения: конкретные лизис % = ((⁵¹Cr означает экспериментальный релиз - ⁵¹Cr среднее Самопроизвольный отпуск) / (⁵¹Cr означает Максимальная релиз - ⁵¹Cr означает Самопроизвольный отпуск)) х 100, где «⁵¹Cr среднее Самопроизвольный отпуск» ⁵¹Cr, освобожден из клеток-мишеней в отсутствие НК-клеток и «⁵¹Cr среднее максимальное освобождение» ⁵¹Cr выпустили из клетки-мишени после лизиса 2 N соляной кислотой (HCl).
6. Урожай transduced НК-клеток на 7 день, осторожно нажав колбы.
   1. Активируйте заготовленных клеток с титруемая концентрации МАБ пластины прыгните анти NKG2D (A10), покрытие 96-луночных, высоко белка абсорбент пенополистирольные плиты с 2,5 мкг/мл концентрация анти NKG2D МАБ на ночь.
   2. Мыть каждый хорошо с 100 мкл PBS три раза перед добавлением первичных НК-клеток.
7. Собирайте supernatants культуры с помощью многоканальных дозаторов между 16 и 18 h после активации для количественного определения цитокинов, таких как ИФН γ. Генерировать стандартные кривые, с использованием рекомбинантного цитокинов, предоставлены комплекты иммуноферментного анализа (ИФА).
8. Проверить жизнеспособность клеток NK с помощью annexin-V/7-амино дактиномицин D (7-AAD) пятная²³ и определить процент отмершие клетки среди преобразованные НК-клеток с помощью проточный цитометр.
   1. Выполнять этот assay, урожай, мышиных и человека NK клеток через четыре дня после трансдукции, мыть два раза с 10 мл холодного PBS на 500 g × 5 минут и инкубировать с Annexin V (PE) / 7-AAD комплект.
9. Используйте соответствующий поток цитометрии программное обеспечение для анализа данных. Выберите жить клеток населения и проанализировать выражение гена GFP (FITC канал) как мера вирусных трансдукции²⁴.

Декстран индуцирует эффективного гена передачи лентивирусные вектора в первичных человеческих и мышиных НК-клеток

NK клеток человека были изолированы и очищенной от КСДОР (с чистотой более 85%) и инкубированы всю ночь с Рус-2 300 ед/мл. Эти первичной клетки были затем преобразованы с GFP человека на разнообразный кратности инфекции (MOI; 3, 10 и 20 МЕ в ячейке) в 24-ну пластины при наличии 8 мкг/мл Pb, PS или декстрана. Клетки были центрифугируется на 1000 g × 60 мин и культивировали (при наличии вирус) на ночь при 37 ° C в инкубатор CO₂ . Клетки были промывают и высокомобильна в свежих RPMI1640 полного среднего с Рус-2 300 ед/мл для семи дней. Трансдукция эффективность оценивалась подачей cytometry для экспрессия гена GFP через семь дней после трансдукции. Результаты показывают, что декстран повышает эффективность лентивирусные трансдукции NK клеток человека и увеличивает титр вирусных, который может также улучшить процент transduced НК-клеток (рис. 1).

Мышиных НК-клетки были изолированы и культивировали как описано в предыдущем разделе. Вышеупомянутый Протокол был использован для анализа и сравнения эффективности трансдукции Pb, Ps и декстрана. Результаты на рисунке 2 показывают, что декстран может увеличить эффективность лентивирусные векторы, по сравнению с Pb или PS.

Трансдукция НК-клеток с декстрана не влияет на их способность быть посредником эффекторных функций

Цитотоксические потенциала transduced человека и мышиных НК-клеток было рассмотрено ⁵¹Cr релиз анализов против K562 и МЦ-1 как клетки-мишени. Представленные в рисунке 3a и b результаты показывают, что трансдукции НК-клеток, декстран отрицательно не изменяет потенциал убийство преобразованные НК-клеток, по сравнению с не преобразованы НК-клеток. Кроме того была проанализирована цитокиновой продукции от transduced первичной НК-клеток. ИФН γ поколения была измерена с помощью ELISA. Transduced первичного NK клеток человека были совместно культивируемых с K562 за 24 ч, и supernatants были собраны в меру ИФН γ. Представленные в рисунке 4a результаты показывают, что декстран не оказывает влияния на способность производить цитокинов transduced НК-клеток. Как независимая проверка transduced НК-клетки были активированы с титруемая концентрации пластины прыгните анти NKG2D (A10) МАБ supernatants культуры 18 ч. были собраны, и ИФН γ поколения был измерен ELISA. Результаты, показанные на рисунке 4В показывают, что трансдукции мышиных НК-клеток с декстрана не влияет на их способность производить цитокинов.

Трансдукция НК-клеток с декстрана не влияет на их жизнеспособность клеток

Влияние Pb, PS или декстрана на жизнеспособность transduced НК-клеток было оцениваются с помощью пробирного пропидий йодидом (PI) и анализа последующих потоков. Результаты в Рисунок 5a и b продемонстрировать, что, хотя преобразователя первичного человека и НК-клеток мыши с вирусами может вызвать некроз в около 20% НК-клеток, добавлением декстрана сделал не дополнить этот некроза, по сравнению с Pb или PS.

Статистические анализы с двух неспаренных Стьюдента t теста. P -значения ≤ 0,05 были сочтены важными.

Рисунок 1: Декстрана имеет более высокую эффективность трансдукции человека первичной НК-клеток.
Первичного человека НК-клетки были преобразованы с MOI 3, 10 или 20 МЕ/ячейки и были культивированный на семь дней при наличии Pb (8 мкг/мл), PS (8 мкг/мл), или декстрана (8 мкг/мл). Процентные показатели NK GFP-положительных клеток были определены проточной цитометрии день семь после трансдукции. Показана одна из трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: Декстрана имеет более высокую эффективность трансдукции в мышиных НК-клеток.
Первичный мышиных НК-клетки были преобразованы с мои 30 МЕ/ячейки и были культивированный на семь дней при наличии Pb (8 мкг/мл), PS (8 мкг/мл), или декстрана (8 мкг/мл). Проценты GFP-выражая клеток были определены проточной цитометрии в семи дней после трансдукции. Показана одна из трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: Декстрана не изменяет клеточный цитотоксическую активность NK трансформированных клеток.
Основная НК-клетки были преобразованы с мои 10 МЕ/ячейки и были культивировали в течение семи дней. МЦ-1 и K562 были использованы как клетки-мишени для определения цитотоксических потенциалов мышиных (а) и человека (b) НК-клеток, соответственно. Данные являются представителями двух независимых экспериментов. Данные являются средние с SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Декстрана не меняет ИФН γ производства первичных НК-клеток.
) мышиных НК-клетки были преобразованы с мои 30 МЕ/ячейки и культивировали в течение семи дней. НК-клетки были стимулировали с 2,5 мкг/мл пластины прыгните анти NKG2D антитела для 18 h, и ИФН γ был количественно в supernatants культуры с помощью ELISA. b) transduced NK клеток человека были культивируемых с клетках K562 за 24 ч, и ИФН γ производства была измерена в supernatants культуры. Представленные данные являются представитель трех независимых экспериментов. Данные являются средние с SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: Трансдукции НК-клеток с декстрана не меняет их жизнеспособность клеток.
Жизнеспособность преобразованные человека (а) и (b) НК-клеток мыши был количественно после окрашивания Annexin V (PE) / 7-AAD позитивных клеток. Данные являются средние с SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Это исследование показывает что использование декстрана как агент Катионный полимер повышает эффективность лентивирусные трансдукции мышиных и человека первичной НК-клеток. Кроме того другие катионные агентов, таких как Pb или PS, имеют не дает ощутимого эффекта на поставку вирусных векторов в первичных NK клеток человека. Ранее было продемонстрировано, что Pb может увеличить трансдукции генов в клетки человека Т¹⁷. Эти результаты, однако, показывают, что Pb ни PS имеют аналогичные КПД на человека первичной НК-клеток. В этом исследовании, Pb улучшить эффективность трансдукции только скромно в мышиных НК-клеток. Было показано, что ингибирования внутриклеточных противовирусное защитных механизмов, с помощью BX795, ингибитор TBK1/IKKɛ и PS как усилитель может увеличить эффективность лентивирусные трансдукции²⁵. Тем не менее результаты показали, что это ингибитор не влияет на эффективность трансдукции в мышиных или человека первичной НК-клеток (данные не показаны).

Результаты показывают, что декстран может индуцировать эффективного трансдукции первичного человека и НК-клеток мыши, в то время как PS и Pb имеют никакого эффекта. Результаты также показывают, что декстран не меняет эффекторные функции НК-клеток, таких как противоопухолевую цитотоксичность и производство провоспалительных цитокинов. Таким образом эти результаты доказывают, что жизнеспособность этих первичных НК-клеток не было изменено с помощью декстрана.

Многочисленные исследования проанализировали и сравнили эффективность трансдукции ретровиральных векторов с использованием различных катионных полимеров, с разнообразными результатов^26,27,28. Один из ранее исследовании сравнивали эффективность трансдукции этих полимеров, используя лентивирусные векторы; Однако, это был испытан в CD4 клеток⁺ T¹⁶. В одном из этих исследований было показано, что Pb емкостью лучше трансдукции трансформированных лимфоцитов и дендритные клетки, по сравнению с²⁶декстрана. В другом исследовании было показано, что декстран способствует более высокой эффективности трансдукции чем другие усилители в клетках человека B и T клетки¹⁶. Настоящее исследование является первым в своем роде, насколько нам известно, что проанализировали и сравнили трансдукции потенциала различных полимеров в человека и мышиных первичной НК-клеток.

Transductions на основе декстрана ген может потребовать минимум двух раундов transductions. Эти результаты показывают, что один раунд трансдукции достаточно, чтобы достигать 40% положительно transduced клеток, который увеличивается до 100% следующих двух раундов трансдукции (данные не показаны). Одна из основных задач в преобразователя NK клеток является способность этих клеток сохранить выражение гена transduced. Текущие результаты показывают, что трансдукции первичных НК-клеток с декстрана является стабильным и что НК-клеток, которые выращиваются в присутствии IL-2 может удерживать вектора и поддерживать трансген выражение для четырех недель (данные не показаны). Необходимы дополнительные эксперименты для анализа эффективности трансдукция и изучить параллельные выражение нескольких трансгенов.

Клиническая эффективность терапии иммунных на основе клеток рака проверяется несколько учреждений. АВТОМОБИЛЬ преобразованы Т-клетки обеспечивают возобновление обещание для болезни и рецидивов бесплатно восстановления по сравнению с обычными лечения больных раком. В рамках innate иммунных реакций НК-клетки не требуют предварительного информирования посредничать их эффекторных функций, в том числе противоопухолевую цитотоксичность. Вследствие их быстрого реагирования НК-клетки являются идеальным эффекторных лимфоцитов подмножество посредником эффективно на основе ячеек Рак иммунотерапия. Несмотря на их позитивные атрибуты в опухоли признания и ликвидации технические препятствия, касающиеся генетической манипуляции, чтобы доставить трансгенов ограничить максимально клинического использования НК-клеток.

Электропорация мРНК для экспрессии экзогенных генов очень эффективна и имеет лучшие результаты. Однако утилита мРНК ограничена, поскольку они позволяют только переходные экспрессии генов интерес и тем самым не подходят для клинического применения. Антиретровирусные трансдукции NK клеток является менее эффективным, как это требует несколько раундов трансдукции; Кроме того ретровиральных векторов не передают в-деления клетки. Единственный перспективный подход для стабильной трансген доставки является использование лентивирусные векторы.

Вообще это исследование обеспечивает эффективный метод для доставки трансгенов в первичных НК-клеток, без ущерба для их эффекторных функций. Этот протокол делает NK на основе ячеек Рак иммунотерапия высокоэффективной и применимо для новых клинических испытаний. Будущие эксперименты необходимо проверить эффективность данного метода в НК immunotherapies на основе клеток рака.

Авторы утверждают не финансовый конфликт интересов.

Мы благодарим Lucia Саммарко и ее Лулу лимонада стенд для вдохновения, мотивации и поддержки. Эта работа частично поддержали NIH R01 AI102893 и CA179363 по с.м R01 NCI (.); NHLBI-HL087951 (С.Р.); НИЗ CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); Алекса Лимонад Стенд Фонд (с.м.); HRHM программа Фонда Макк (с.м.; С.Р.; M.S.T); Фонд семьи Николая (с.м.); Семья Gardetto (с.м.); Ученые Hyundai программа (САС); Надежда Hyundai на колесах (с.р.); МАКК фонд (САС и с.м.); Детская научно-исследовательский институт, MCW (с.р.); и Кэти Фогерти Даффи премии (M.J.R.).