デキストランは、マウスとヒト NK 細胞のレンチ ウイルスの伝達効率を向上します。

本研究の目的は、自然なキラー (NK) 細胞の正常な遺伝子伝達を可能にする技術を策定することでした。人間のデキストランを介したレンチ ウイルス伝達や遺伝子発現効率の向上でマウスの主な NK 細胞実験結果。遺伝子伝達のこのメソッドは、NK 細胞の遺伝的操作を大幅に向上させます。

ナチュラル キラー (NK) 細胞に特定の遺伝子の効率的な伝達は、主要な挑戦をされています。成功した伝達は、分化と NK 細胞の機能に関する研究の興味の遺伝子の役割を定義するのに重要です。がん免疫療法におけるキメラ抗原受容体 (自動車) に関連する最近の進歩は、エフェクター細胞に遺伝子を提供する効率的な方法の必要性を強調します。主な人間またはマウスの NK 細胞にレンチ ウイルス媒介性遺伝子伝達の効率は、主要な制限要因である大幅低いまま。Polybrene などのカチオン性ポリマーによる最近の進歩は、T 細胞で改善された遺伝子伝達効率を表示します。ただし、これらの製品は、NK 細胞の情報伝達効率を改善するために失敗しました。人間の伝達効率とマウスの NK 細胞が大幅に向上作業、デキストラン、分岐グルカンの多糖を示しています。この再現性の高い情報伝達方法臨床遺伝子配信アプリケーションとこのように NK 細胞を用いたがん免疫療法.を大幅に改善することができます人間プライマリ NK 細胞の伝達の有能なツールを提供します。

ナチュラル キラー (NK) 細胞は、生得の免疫組織の¹の主要なリンパ球人口です。NK 細胞は、腫瘍や感染症の^2,3,4に対する宿主の免疫応答の最初の行の擁護者として機能します。NK 細胞はまた強力なサイトカインとケモカイン⁵の分泌を通じて耐性の開発で中心的な役割を再生します。ターゲットし、腫瘍細胞を排除する強力な能力、がん^6、7の養子免疫療法としてドナー由来ヒト NK 細胞を評価する複数の臨床試験を行っています。T 細胞と対照をなして NK 細胞の発生生物学を特徴⁸となりますが。知識のこの欠乏は部分的にマウスやヒト NK 細胞に興味の遺伝子を提供する効率的な技術の不在のため。これらの理由から、NK 細胞研究のほとんどは、初代培養細胞ではなく細胞株で行われています。したがって、信頼性と効率的なプロトコルへと興味の遺伝子を持つ NK 細胞を変換するための必要性は重要です。

本研究の全体的な目標は、人間またはマウス NK 細胞でした遺伝子導入やレトロ ウイルスで導入する一貫性のある、信頼性の高い方法を策定します。

主として NK 細胞の一時的な変換を使用して、この問題に対処しようとした以前の研究が行われています。これはプラスミッド トランスフェクション^9,10、エプスタインバー ウイルス (EBV) が含まれています/レトロ ハイブリッド ベクトル¹¹, ワクシニア ベクトル^12,13、および Ad5/F35 キメラ アデノ¹⁴。これらのテクニックのささやかな効率にもかかわらず、伝達の過渡的な性質に、遺伝子組み換えの NK 細胞の長期的な利用には不向きになります。いくつかの最近の研究は、NK 細胞、遺伝子発現^11,15の許容可能なレベルを達成するために感染症の複数のサイクルを必要とする変換にレトロウイルスベクターを使用しています。レンチウイルスベクターは retroviral ベクトルと対照をなして宿主細胞核輸入機械を使用して、ウイルスの事前統合複合体を核に若しできます。これは、NK 細胞を含む非分裂細胞にウイルスの複製の主要な制限要因です。

異なった細胞表面受容体とウイルス粒子の相互作用は、セルにウイルスの取り込みを許可します。ウイルスのエンベロープタンパク質と同種のホスト受容体の初期の契約は、既存の 2 つの潜在的な負電荷のために限ることができます。多くの伝達技術の背後にある理論的根拠は, デキストラン投与やプロタミン硫酸塩 (PS)、polybrene (Pb) などのカチオン性ポリマー添加が細胞表面の受容体に正電荷を与えるでき、それによりウイルスの封筒の結合を強化蛋白質。これはセル¹⁶融合効率とウイルス粒子の吸収を高めます。Pb や PS が T 細胞¹⁷遺伝子伝達を改善できることは報告されて、応用は NK 細胞の伝達効率で任意の効果を持っていなかった。また、NK 細胞を使用してこれらの試薬の比較分析は実行されていません。この研究では、3 つのカチオン性ポリマーの伝達効率を比較しました。結果は、これら 3 つのカチオン性ポリマーの中でのみデキストラン大幅に向上マウスとヒト NK 細胞の両方に効率的なウイルス伝達を示します。

動物のすべてのプロトコルは、動物の人道的・倫理的扱いに従い、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、ウィスコンシン医科大学 (MCW)、ミルウォーキー、ウィスコンシンの医学研究センター (BRC) 内で承認されました。ひと末梢血単核球 (Pbmc) の使用は、ウィスコンシン州ミルウォーキー、ウィスコンシンの血液センターの血液研究所の制度的レビュー委員会 (IRB) によってを承認されました。

1. マウス、細胞株およびベクトル

1. 商用ベンダーから c57bl/6 マウスを取得します。病原体フリーの条件でマウス コロニーを維持し、6 および 12 週の年齢間の女性と男性のマウスを使用します。IRB 承認ソースから匿名化した人間の PBMCs を取得します。
2. プロピレング リコール (1, 2-プロパンジ オール、USP の等級)、マウスを麻酔するの 20-30 %v/v イソフルランの混合物と動物を麻酔します。マウスは麻酔下で、乾燥を防ぐため目に獣医軟膏を適用されます。
3. 安楽死、麻酔導入後頚部転位を実行します。
   1. 片方の手で尾の基本をしっかりとつかんでマウスを抑制します。頭蓋底に丈夫な棒型ペンまたは親指と、首の背部に対してもう一方の手の最初の指を置きます。
   2. 転位を作り出す、動物の頭を転送し、尾のベースを持っている手と後方に引きながら押し手の拘束を押してください。頸部組織の分離感によって転位の効果を検証する.
4. 少なくとも 5 分商工会議所/檻の中の動物を維持し、呼吸活性が存在しない場合にのみ、または検出ハートビートの欠如がある場合、それらを削除します。
5. 商用ベンダーから YAC 1 および K562 細胞を取得、メンテナンスを RPMI1640 培 10% 熱不活化政府短期証券。マイコ プラズマ汚染の可能性を排除するために定期的にこれらの細胞をテストします。

2. 準備中とレンチウイルスベクターの滴定

1. 7.5% 重炭酸ナトリウム溶液の 0.001% 5% 10 %fbs、100 U/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、1 mM ピルビン酸ナトリウム、RPMI1640 培地 20 mL の溶液が入ったコート t75 フラスコ cm²フラスコで一晩培養 5 × 10⁶ 293 t 細胞Β-メルカプトエタノール。5.2% CO₂を流し込んで 37 ° C の定温器にフラスコを配置します。
2. トリプシン (リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 0.025%)/EDTA (1 mM) を使用して 293 t 細胞を収穫.PBS でトリプシン EDTA/5 mL を追加し、37 ° C T75 cm²フラスコから 293 t 細胞の剥離を許可するインキュベーターで 10 分間フラスコを孵化させなさい。
   1. 戸建の細胞を収集し、トリプシンの痕跡を削除する PBS と EDTA で二度洗い。診断とセルをカウントし、mL あたり 100 万セルにセル数を調整します。
3. PsPAX2 の 3.95 μ g、pMD2G、1.32 μ g (社内 BRI ので生成 pLenti CMV GFP プーロの CMV プロモーターの代わりに pWPI から EF1alpha のプロモーターをクローニング) pLEP GFP プーロの 5.26 μ g と 293 t 細胞¹⁸ transfect¹⁹。
   1. 150 mM の NaCl の 1 mL プラス 0.6 mg/mL ポリエチレンイミンの 63 μ L を準備 (PEI; 25,000 kD、線形)。よく混ぜると、プラスミドを追加し、混ぜます。室温で 20 分間インキュベートし、セルに追加します。
   2. 16 時間後トランスフェクション、置換新鮮な培地でトランスフェクション ミディアム プラス 4.5 mM 酪。ウイルス 48 時間後トランスフェクションを含む上清を収穫し、5,000 × g で遠心を一晩で集中。材料表を参照してください。
4. シリアル希薄を行い 293 t 細胞を用いたウイルスの抗体価を決定し、流れ cytometry 72 h 後伝達²⁰試金。ウイルス抗体価を定量化するのに措置として緑色蛍光タンパク質 (GFP) の式を使用します。

3. 精製とマウス NK 細胞の拡大

1. マウスのプライマリ NK 細胞²¹を浄化します。簡単に言えば、B 細胞とマクロファージから成る付着性の人口を破壊するナイロン ウール列を単一細胞の脾臓の懸濁液を渡します。
2. 文化非付着個体数が 1,000 U/mL インターロイキン (IL)-2 RPMI1640 培地で 10 %fbs、100 U/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、1 mM ピルビン酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム 7.5% の 5% とマウスの NK 細胞を含むナイロン ウール列から溶出ソリューション、および 0.001% β-メルカプトエタノール (RPMI1640 完全培地)。
3. 非付着 T と NKT 細胞を削除するこの文化の 4 日目、フラスコから媒体を変更します。まま、フラスコに付着細胞は主として NK 細胞です。新鮮な RPMI1640 完全培地 20 mL、1,000 U/mL のフラスコを補充するために IL-2 を追加します。
4. フローサイトメトリーによる 7 日 NK 細胞特異的マーカー²⁰ CD3 の 95% 以上の製剤を使用してマウスの NK 細胞培養の純度を確認してください^-NK1.1⁺の人口。

4. 精製とヒト NK 細胞の拡大

1. 健康な人間のボランティアのバフィー コートからの密度勾配によって PBMCs を分離します。簡単に、慎重にはレイヤー (HBSS) で半分希釈細胞 15 mL 以上 50 mL の標準的な管の密度勾配の 35 mL です。ブレーキなしスイング バケツ ローターで 20 ° C で 30 分間 400 × g で遠心分離機します。
2. 製造元のプロトコルに従って人間 NK 細胞を浄化するために抗体を用いた負の淘汰の商業キットを使用します。
3. 次の分離、蛍光抗体法によって NK 細胞製剤の純度を決定します。CD3 の不在そして細胞表面に cd56 陽性細胞の存在によって決定されます PBS NK 細胞集団で 2 回 20 分洗浄 2 μ g/mL 抗 CD3、4 ° C で 2 μ G/ml アンチ CD56 抗体と NK 細胞製剤、細胞を染色します。
4. 4 ° C で 20 分の抗体と細胞製剤を孵化させなさい、PBS で洗浄し、流れの cytometer で分析します。NK 細胞製剤を使用遺伝子伝達の純度 85% 以上²⁰の試金。

5. レンチ ウイルスとマウスと人間の一次 NK 細胞の情報伝達

1. GFP レンチ ウイルス感染 (MOI) の 5、10、そして 20 の多様性で上清及び Pb の存在下における媒体の 0.5 × 10⁵/mL でマウスまたは 24 ウェル プレートのヒト NK 細胞を中断 (8 μ g/mL)、PS (8 μ g/mL) またはデキストラン (8 μ g/mL)。
2. 60 分の 1,000 × g でプレートを遠心します。
3. 上清をデカントすることがなく細胞の培養、一晩 (16-18 h) 5.2% を流し込んで 37 ° C の定温器で CO_2.
4. 10 mL の PBS で洗浄し、IL-2 の存在下で完全な RPMI1640 培地の 2 mL で再懸濁します (300 U/mL)。
5. 人間をテストし、それぞれ⁵¹クロム (Cr) を実行することにより K562 と YAC-1 主な NK 細胞性活性をマウス-リリース試金で様々 なエフェクターをターゲット細胞比²²。
   1. 簡単に言えば、radiolabeled ナトリウム クロム酸⁵¹Cr の 100 万のターゲット細胞 50 µCi を与えます。4 時間培養時間の間に彼ら吸収細胞蛋白質に Cr ⁵¹。孵化の最後に、任意の個人のラベルを削除するセルを洗ってください。
   2. 特定の腫瘍の細胞の換散を標的細胞から⁵¹Cr の絶対、自発、および実験的リリースの量によって計算します。
      注: pentaplicate の実験から特定の換散の割合の計算が行われていた次の式を使用して: % 特定換散 = ((⁵¹Cr 意味する実験的リリース - ⁵¹Cr 平均自然リリース)/(⁵¹Cr の意味最大 release - ⁵¹Cr は、自発的なリリース)) х 100、「⁵¹Cr 平均自発的な解放」は⁵¹Cr は、NK 細胞の標的細胞から解放、「⁵¹Cr 平均最大リリース」は⁵¹Cr2 N 塩酸 (HCl) によるターゲット細胞換散からリリース。
6. 7 日目に、フラスコをやさしくタッピングによって導入された NK 細胞を収穫します。
   1. アンチ NKG2D mAb の 2.5 μ g/mL の濃度 96 ウェル、高いタンパク質吸収ポリスチレン板を一晩コーティング プレート バインド対策 NKG2D (A10) mAb の滴定された濃度で収穫されたセルをアクティブにします。
   2. それぞれを洗って 3 回 NK 細胞添加前に 100 μ L の PBS とも。
7. 16 と 18 h ライセンス認証後 IFN-γ などのサイトカインを定量化する間マルチ チャンネル ピペットを使用して培養上清を収集します。酵素免疫測定法 (ELISA) キット付属組換えサイトカインを使用して標準的な曲線を生成します。
8. アネキシン-V/7-アミノ-アクチノマイシン D (7 AAD) 染色²³を使用して NK 細胞の生存率をテストし、流れの cytometer を使用して変換された NK 細胞壊死細胞の割合を決定します。
   1. この分析を実行するマウスおよび人間の NK 細胞の導入後、4 日間の収穫 (500 g) × 5 分ごとに、冷たい PBS の 10 mL で 2 回洗浄し、インキュベートする Annexin V (PE) と/7 AAD キット。
9. 適切な流れの cytometry のソフトウェアを使用して、データを分析します。生きている細胞集団を選択し、ウイルス伝達²⁴の指標として GFP (FITC チャンネル) の表現を分析します。

デキストラン誘導レンチウイルスベクター主の人間およびマウスの NK 細胞の効率的な遺伝子導入

ヒト NK 細胞分離 PBMC (純度 85% 以上) の精製し、リライアンス 2 300 U/mL で夜通し孵化します。これら NK 細胞が、感染症の様々 な多重度で GFP レンチ増殖型 (MOI; 3、10、およびセルあたり 20 の IU) 8 μ G/ml Pb や PS、デキストランの存在下で 24 ウェル プレートで。細胞 60 分 1,000 × g で遠心分離, 37 ° c CO₂インキュベーターで一晩培養 (ウイルス) の存在下で.細胞洗浄, 7 日間新鮮な rIL 2 300 U/ml RPMI1640 完全培地で再停止されます。伝達効率は導入後 7 日 GFP 発現をフローサイトメトリーによって評価されました。そのデキストラン ヒト NK 細胞のレンチ ウイルス伝達の効率向上し、導入された NK 細胞 (図 1) の割合を向上させることもウイルスの力価を増加を示した。

マウスの NK 細胞は、隔離され、培養前のセクションで説明したようだった。上記のプロトコルを使用して分析し、Pb、Ps、デキストランの伝達効率を比較します。図 2の結果を示して Pb に比べてレンチウイルスベクターの効率を増やすことがそのデキストランや PS

デキストランと NK 細胞の情報伝達にエフェクターの機能を仲介する機能は影響しません

導入された人間とマウスの NK 細胞の細胞傷害性の容量は標的細胞として K562 と YAC 1 ⁵¹Cr 放出アッセイによって調べた。図 3 aとbの結果を表示では、デキストランによる NK 細胞の伝達は否定的非導入 NK 細胞と比較して変換後の NK 細胞の潜在的な殺しを変わらない点を明らかにします。さらに、導入された NK 細胞からのサイトカイン生産を行った。IFN-γ の生成は、ELISA を用いて測定しました。導入されたヒト NK 細胞は IFN-γ.を測定する培養上清を採取され、24 時間 K562 との共培養図 4 aで示された結果は、そのデキストランは、導入された NK 細胞のサイトカインを生産する能力に影響を与えませんを明らかにします。独立系の検証として導入された NK 細胞活性プレート バインド対策 NKG2D (A10) mAb の滴定された濃度の 18 h 培養上清を回収し、IFN-γ の生成は、elisa 法により測定されたため。図 4 bに示される結果は、デキストランとマウスの NK 細胞の情報伝達にはサイトカインを生産する彼らの能力に影響はない明らかにします。

デキストランと NK 細胞の情報伝達、細胞生存率は影響しません

Propidium ヨウ化 (PI) 法とその後の流れ解析を使用してデキストランや PS、Pb の導入された NK 細胞の生存率に及ぼす影響を評価しました。図 5 aとbの結果を示すが主な人間とマウスの NK 細胞のウイルスの伝達は NK 細胞の約 20% の壊死を引き起こすことができる、デキストランの添加はないを増大させる Pb と比較してこの壊死や PS

2 尾不対スチューデントの t 検定と統計的分析を行った。P -値 ≤ 0.05 は、重要な考慮されました。

図 1: デキストラン ヒト NK 細胞の伝達の効率があります。
ヒト NK 細胞の 3、10、または 20 の IU/セルの MOI で形質転換したし、Pb の存在下で 7 日間培養した (8 μ g/mL)、PS (8 μ g/mL)、またはデキストラン (8 μ g/mL)。GFP 陽性 NK 細胞の割合は、次の情報伝達系 7 日目でフローサイトメトリーにより決定しました。3 つの独立実験のいずれかが表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: マウスの NK 細胞の情報伝達の効率にはデキストラン。
プライマリ マウス NK 細胞 30 IU/セルの MOI で形質転換したし、Pb の存在下で 7 日間培養した (8 μ g/mL)、PS (8 μ g/mL)、またはデキストラン (8 μ g/mL)。GFP 発現細胞の割合は、7 日間、伝達、次にフローサイトメトリーにより決定しました。3 つの独立実験のいずれかが表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: デキストランは、変換されたセルの NK 細胞媒介性細胞傷害活性を変更しません。
NK 細胞は、10 IU/セルの MOI で形質転換したし、7 日間培養しました。YAC 1、K562 は、それぞれマウス (a) と人間 (b) NK 細胞、細胞傷害性の電位を決定する標的細胞として使用されました。表示されるデータは、2 つの独立した実験の代表です。表示されるデータは、SEM を使用平均この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 4: デキストランは、NK 細胞の IFN-γ の産生を変更しません。
a) マウスの NK 細胞 30 IU の MOI で導入されたセル ・ 7 日間培養します。プレート連結アンチ NKG2D 抗体の 18 h の 2.5 μ g/mL と NK 細胞が刺激され、IFN-γ の ELISA を用いた培養上清の定量化を行った。b) 導入されたヒト NK 細胞 K562 細胞を 24 時間培養した培養上清で IFN-γ の産生を測定した.表示されるデータは、3 つの独立実験の代表です。表示されるデータは、SEM を使用平均この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 5: デキストランと NK 細胞の情報伝達には、細胞の生存率は変わりません。
変換された人 (a) とマウス (b) NK 細胞の生存率の Annexin V (PE) を染色後, 定量化した/7 AAD 陽性細胞。表示されるデータは、SEM を使用平均この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

本研究は、カチオン性ポリマー剤はマウスとヒト NK 細胞のレンチ ウイルスの伝達効率を向上、デキストランの使用を示します。また、Pb や PS などの他のカチオン性エージェントあるウイルスのベクトルの配信で目に見える効果ヒト NK 細胞に以前は、Pb が人間の T 細胞¹⁷の遺伝子伝達を強化できます実証されています。これらの結果はしかし、Pb も PS ひと NK 細胞に似たような効率があることをお勧めします。本研究では、Pb 改善伝達効果は緩やかでマウスの NK 細胞。それは、エンハンサーとして TBK1/IKKɛ、および PS の阻害剤 BX795 を用いた細胞内抗ウイルス防衛機構の抑制がレンチ ウイルス伝達効率²⁵を増やすことが示されています。それにもかかわらず、この抑制剤がマウスかヒト NK 細胞 (データは示されていない) に伝達効果に及ぼす影響を持っていないことがわかった。

結果を示す PS や Pb に効果はないそのデキストランが主な人間とマウスの NK 細胞の効率的な伝達を引き起こすことができます。また, そのデキストランが NK 細胞などの抗腫瘍細胞毒性と炎症性サイトカインの生産のエフェクターの機能を変更しません。したがって、これらの結果は、デキストランの使用によってこれらの一次 NK 細胞の生存率が変更されなかったことを証明します。

複数の研究を分析し、さまざまなカチオン性ポリマーを用いた様々 な成果^26,27,28レトロウイルスベクターの伝達効率を比較しました。1 つのより早い調査に比べてレンチウイルスベクター; を使用してこれらのポリマーの伝達効果ただし、これは cd4 テストは⁺ T 細胞¹⁶。これらの研究の 1 つは、Pb が変換された B 細胞と樹状細胞のデキストラン²⁶に比べて上伝達のより良い能力を持っていることが示されています。ヒト B 細胞の他のエンハンサーより高い伝達効率を容易にデキストランと T 細胞¹⁶は、別の研究で、それは示されています。現在の研究は、我々 の知識の分析と、人間とマウスのプライマリ NK 細胞に異なるポリマーの伝達容量を比較する、その種の最初です。

デキストラン遺伝子伝達は伝達の 2 つのラウンドの最小値を必要があります。これらの結果を示す伝達の 1 つのラウンドで十分です 2 つの伝達 (データは示されていない) のラウンドまで 40% に達する積極的に導入された細胞の 100% にまで増加しました。NK 細胞の伝達の主要な課題の 1 つは導入された遺伝子の発現を維持するためにこれらの細胞の能力であります。現在の結果は、デキストランと NK 細胞の伝達が安定していると IL-2 の存在下で培養した NK 細胞がベクトルを保持でき、4 週間 (データは示されていない) の発現を維持を示しています。追加実験は伝達効率を分析し、複数遺伝子の同時発現を調べる必要があります。

細胞を用いたがんの免疫療法の臨床効果は、複数の機関で検証中です。車導入 T 細胞は、従来の治療法と比較してがん患者の病気の再発ない回復の新たな約束を提供します。免疫反応の一部として、NK 細胞は抗腫瘍細胞毒性を含む彼らのエフェクター機能を仲介する前感作を必要としません。彼らの迅速な対応により NK 細胞、効率的な細胞を用いたがん免疫療法を仲介する理想的なエフェクター リンパ球サブセットです。腫瘍の認識と排除で彼らの肯定的な属性、にもかかわらず遺伝子を提供する遺伝子操作に関する技術的なハードルは、NK 細胞の最大限の臨床利用を制限します。

外因性の遺伝子発現のための mRNA のエレクトロポレーションは高効率より良い成果。しかし、mRNA ユーティリティは限られていると興味のある遺伝子の一過性の発現のみを許可することにより、臨床応用に適していません。NK 細胞のレトロ ウイルスの伝達は伝達; を複数回必要になるため効率が悪くまた、非分裂細胞にレトロウイルスベクターが変換できません。安定した遺伝子配達のためだけの有望なアプローチは、レンチウイルスベクターの。

完全に、この研究は、そのエフェクターの機能を損なうことがなく、NK 細胞に遺伝子を提供する効率的な方法を提供します。このプロトコルは、非常に効率的かつ新たな臨床試験に適用可能な NK 細胞を用いたがん免疫療法をなります。NK 細胞を用いたがん免疫療法におけるこのメソッドの有効性を検証する実験が必要です。

著者は金融利害を主張できません。

ルチア着きましたと彼女のルルのレモネード スタンド、インスピレーション、動機、サポートに感謝しますこの作品は、NIH R01 AI102893 と NCI R01 CA179363 (スウェン); によって一部で支持されました。NHLBI HL087951 (レジスタ)。NIH-CA151893-K08 (M.J.R.);NCI 1R01CA164225 (L.W);アレックスのレモネード スタンド財団 (スウェン);MACC 基金 (スウェン; の HRHM プログラムレジスタ;M.S.T);ニコラス ・ ファミリー基金 (スウェン);Gardetto 家族 (スウェン);現代学者はプログラム (M.S.T.);現代車輪 (レジスタ); 希望MACC の資金 (M.S.T. ・ スウェン);子どもの研究所、MCW (レジスタ)。キャシー ダフェイ ・ フォガティ賞 (M.J.R.)。