Повторные транскраниальной магнитной стимуляции к одностороннему полушарии мозга крысы

We applied repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) to the unilateral hemisphere of rat brain, by placing a 25-mm figure-8 coil 1 cm lateral to the vertex on the biauricular line and angulating the coil by 45°. An in-house water cooling system was used for rTMS for more than 20 min.

Previous rodent models of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) adopted whole-brain stimulation instead of unilateral hemispheric rTMS, which is unlike the protocols used for human subjects. We report a successful application of rTMS to the unilateral hemisphere of rat brain. The rTMS was delivered with a low-frequency (1 Hz), high-frequency (20 Hz), or sham stimulation protocol to one side of the brain by using a small 25-mm figure-8 coil. We placed the center of the coil 1 cm lateral to the vertex on the biauricular line and angulated the coil 45° to the ground to minimize a potential direct effect of rTMS on the contralateral cortex. We also used an in-house water cooling system to enable repetitive magnetic stimulation for more than 20 min, even at a 20-Hz stimulation frequency. Increases in the transcriptions of immediate early genes (Arc, Junb, and Egr2) were greater after rTMS than after sham stimulation. After 5 consecutive days of 20-min 1-Hz rTMS, bdnf mRNA expression was significantly higher in stimulated cortex than in contralateral side. The model presented herein will elucidate the molecular mechanisms of rTMS by allowing analysis of the inter-hemispheric difference in its effect.

Повторные транскраниальной магнитной стимуляции (мТМС), инструмент для неинвазивной стимуляции мозга и нейромодуляции, был применен при лечении различных заболеваний , таких , как центральной боли ^1,2, депрессии, мигрени ^{3 4,} и даже инсульта ^5-7. Быстрое изменение электрического тока через катушки на головке индуцирует электрическое поле на коре головного мозга и результирующей нейрональной активации. Возбудимость коры головного мозга может быть модулируется МТР, который может длиться в течение более чем 30 минут после того, как стимуляция прекращается.

Предлагаемые механизмы МТР последействия включают долгосрочное потенцирование / эффект депрессивноподобному ^8, переходные сдвиг ионного баланса ^9, и метаболические изменения ^10. Кроме того, Ди Лазаро и др. позволяют предположить, что прерывистый тета-взрыв стимуляция влияет на возбуждающие синаптические входы пирамидальных нейронов тракта, как в вынужденноеи контралатерального полушария ^11.

Значительные ограничения, однако, препятствовали исследователям перевода на стенде доказательств в клинических ситуациях. Во- первых, в предыдущих исследованиях на животных, мТМС использовали для стимуляции всего головного мозга ^12. Стимуляция всего головного мозга довольно сильно отличается от протоколов , используемых в исследованиях на людях ^9. Другая проблема связана с длительностью стимуляции. Это, по меньшей мере, частично связано с тем, что эффективная система охлаждения была недоступна для маленьких катушек в прошлом.

В последние годы, семенных статьи были опубликованы предложения в отношении путей преодоления этих трудностей в эксперименте мТМС на маленьком мозга животных. С помощью этих моделей на животных, было обнаружено , что мозг крыс также показывает аналогичные изменения коры головного мозга возбудимости как у человека в ответ на низкочастотных МТР ^13. Что еще более важно, клеточные и молекулярные механизмы МТР все чаще бейнг исследовали с использованием животных моделях МТР. Речь в данном случае является то , что особый тип ингибиторной интернейрон , как известно, наиболее чувствительной к прерывистой тета разрывного стимуляции ^14. Грызун модели МТР, таким образом, открывают новые возможности для изучения столь искомых вопросы о молекулярных основ мТМС-индуцированных изменений. Если маленькие животные модели МТР могут быть использованы в большем количестве лабораторий, это может значительно ускорить и активизировать исследования в этой области.

Теперь мы опишем , как применить МТР к одностороннему полушарии головного мозга крыс, продолжение предыдущей работы ^15. Изменения стимуляции индуцированных оценивали с помощью микро-позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) и мРНК микрочипов для изучения МТР-индуцированных изменений в стимулированной коре головного мозга.

Все процедуры с использованием животных были рассмотрены и одобрены Institutional Animal Care и использование комитета Сеульского национального университета больницы с.

1. Экспериментальная установка

1. подготовка животных
   1. Разрешить Самцов крыс Sprague-Dawley крыс 1 неделю, чтобы адаптироваться к новой среде перед началом эксперимента.
      Примечание: Несмотря на то, 8-недельных крыс использовали в настоящем исследовании, проявочный или мозг взрослого человека может быть выбран в соответствии с научно-исследовательскими гипотезами.
2. Ингаляционного наркоза для индукции
   1. Индуцировать и поддерживать анестезию с 5% и 2% изофлуран , растворенного в 40% / 60% и 25% / 75% кислорода / азота через камеру и носовой обтекатель, соответственно. Регулировка глубины анестезии до уровня отмены вывода педали рефлекс на носок щепотку, чтобы подтвердить правильность обезболивание.
      Примечание: Использование Awoken животных может быть лучшим выбором в поступательных терминах, но есть трудности удержать во время МТР и тэй склонны к чрезмерному стрессу.
   2. Монитор температуры тела с ректальным зондом и поддерживать его при температуре 37 ° С, используя теплокровных одеяло. Монитор глубины анестезии с помощью педали вывода рефлекс, температуру, частоту дыхания и частоту сердечных сокращений.
3. Переключение на внутривенной анестезии для поддержания
   1. Подготовьте хвост с тампоном, смоченным спиртом. Катетеризировать боковую хвостовую вену с 24- го калибра венозного катетера для перехода к IV анестезии (рис 1А). Нагрузка пропофол внутривенно (1 мг / кг [· мин] в течение 10 мин, с использованием 10 мг / мл эмульсии) к животным. Прекратите изофлуран через 5 мин после начала загрузки пропофола.
   2. Поддерживать пропофола седации со скоростью инфузии 500 - 700 мкг / (кг · мин) в течение всего эксперимента, как и в предыдущем исследовании ^16. Дополнение кислорода на уровне 0,8 л / мин через носовой конус.
      Примечание: Анестезия с пропофола, чтобы уменьшить потенциальное подавление возбудимости коры по inhalвания агента ^17-19. Тем не менее, анестезия не является обязательным в опытах МРВ, и будит животные также могут быть использованы. методы анестезии должны решаться с учетом научных гипотез.
   3. Используйте ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
   4. Применение магнитной стимуляции (см section2) в течение 10 мин после полного перехода к внутривенной анестезии.
4. условия восстановления
   1. Монитор жизненно важных функций во время фазы восстановления. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее. Если животное перенес операцию, не вернуть его в компании других животных, пока полностью не выздоровел.
      Примечание: Если операция для модели заболевания выполняется, послеоперационные боли управления необходимо. Тем не менее, управление боли не требуется для этого эксперимента МТР.

2. Повторные транскраниальной магнитной стимуляции

1. Стимулятор и катушки
   1. Применение стимуляции с помощью повторяющихся стимулятора , который обеспечивает двухфазные стимулы через 25 мм по фигуре 8 катушкой. Найдите центр катушки 0,5 см латеральнее вершины на biauricular линии, и угловыми катушка 45 ° к земле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальная напряженность магнитного поля катушки 4,0 T. Магнитная катушка жестко закреплялись на встроенном держателе.
2. порог двигателя
   1. Определения порога двигателя (МТ) в горячей точке, с центром катушки расположена на 0,5 см латеральнее вершины на biauricular линии и с поверхностью плоской на своде черепа. Это та же методология , используемая в предыдущем исследовании ^20.
      Примечание: Определить MT как минимальная интенсивность стимула, напоминающей 5 или более ощутимым схваток на контралатеральной лапой на 10 последовательных стимулов. Проверьте, является ли стимуляция в первую очередь вызывает контралатеральной сокращение мышц, чтобы обеспечить одностороннее стимулирование.
3. Применение мТМС
   1. Применить мТМС 10 мин после стабилизации глубокой анестезии. Поместите центр катушки на участке-мишени мТМС, выбранный из коры головного мозга в зависимости от вопросов исследования. Затем наклонить катушку для обеспечения прямого контакта между центром катушки и поверхностью черепа в точке стимуляции.
      Примечание: Например, угловатый Спиральные 45 ° по отношению к земле , чтобы минимизировать возможное прямое действие МРВ на контралатеральной коре (рис 1В и 1С).
   2. Тема животных на сессии 20-минутного мТМС одностороннего полушария. С помощью консоли программного обеспечения, поставить МТР с низкой частотой (1 Гц), высокочастотные (20 Гц), или фиктивный протокол стимуляции, а также установить интенсивность стимуляции на 100 - 110% от МП.
   3. Выполните 1 Гц стимуляции без отдыха. Использование программного обеспечения консольного ввода "1200" кадры для "20" мин). Для 20 Гц стимуляции, проводят 2 сек стимуляции с последующим 28сек отдыха. Использование программного обеспечения консольного ввода "1600" кадры для "20" минут.
   4. Для стимуляции мнимым, наклон катушки перпендикулярно (90 ° вращение) в своде черепа и поместите край катушки 2 см от поверхности головы (рис 1D). Закрепить держатель катушки плотно к главному устройству; нет необходимости удерживать катушку вручную в течение эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для компенсации акустических и других неспецифических эффектов, различные протоколы фиктивных должны использоваться для различных протоколов стимуляции. Например, 1-Гц стимуляция фиктивный можно использовать для 1 Гц мТМС экспериментов.
4. Охлаждение катушки
   1. Используйте систему водяного охлаждения для того, чтобы повторяющиеся магнитную стимуляцию в течение более 20 мин при 1- и 20-Гц частоты стимуляции (рисунок 2). Циркулируйте ледяную воду, окружающую всю длину катушки во время эксперимента, чтобы предотвратить перегрев, хотя температура катушки или стимулятора не контролируется.
      Примечание: Коммерчески доступные охлажденные катушки крысы также могут быть использованы.
   2. Если это возможно, контролировать температуру катушки путем просмотра нагревательного датчик машины МТР. ПРИМЕЧАНИЕ: Там не было каких-либо негативных последствий, связанных с стимуляции МРВ. Существует, однако, потенциальный риск ожога, если идентификация металла уха теги используются вблизи стимулирующего катушки.

3. Micro Позитронно-эмиссионная томография

1. подготовка животных
   1. Проведение ингаляционной анестезии для индукции и внутривенного наркоза для обслуживания (этап 1.2.1 и 1.3.1). Нанести 1 Гц мТМС животному в течение 10 мин при интенсивности стимуляции 100-110% от МП.
   2. Через пять минут после окончания стимуляции МРВ, вводят 1 мКи 2- [F-18] фтор-дезоксиглюкозы ⁽¹⁸ ФДГ) , растворенного в 0,5 мл физиологического раствора внутривенно с помощью катетера в хвостовую вену. Разрешить 30 минут для ¹⁸ поглощения ФДГ. Примечание: Поместите крысу под наркозом в течение всего микро-PET эксперимент.
2. анализ изображений
   1. С помощью ПЭТ-сканер для получения изображений мозга, чтобы подтвердить unilaterality стимуляции. Реконструировать изображения с 3-D итеративного алгоритма. Для оценки изменений в обмене веществ , вызываемых МТР, идентифицировать области , представляющие интерес (трансформирования) в изображениях поперечных срезов мозга ^21.
3. эвтаназия
   1. После выполнения изображений микро-ПЭТ, эвтаназии крыс в камере укажи с диоксидом углерода, в то время как крысы находятся в глубокой анестезии.

4. мРНК Microarray

1. эвтаназия
   1. Индуцировать и поддерживать анестезию с 5% и 2% изофлуран , растворенного в 40% / 60% и 25% / 75% кислорода / азота через камеру и носовой обтекатель, соответственно. Обезболить глубоко до уровня отмены вывода педали рефлекс на носок крайнем случае перед тем, обезглавлены.
   2. Обезглавьте крыс на эвтаназию 5 мин после 1 сессии 1-Гц МТР.
2. урожай тканей
   1. Разложите материалы и хирургические инструменты в порядке использования, в том числе сложенных бумажных полотенец, кости костными кусачками, microscissors, большие хирургические ножницы, microforcep, скальпелем № 10 или 11, закрытой крышкой 10 см стеклянной чашке Петри заполнены льдом и трубки 1,5 мл. Подготовьте пластиковый пакет для утилизации туши.
   2. Сделать надрез по средней линии кожи в черепе anterioposteriorly. Попросту рассекают мягкие ткани и окружающие мышцы с помощью хирургических ножниц и удалить кусок кости черепа, используя кости костными кусачками. Быстро рассекать свежий мозг тщательно из черепа. Затем положите ее на лед, используя microforceps и microscissors. Ополосните мозговую ткань в ледяной нормального физиологического раствора.
   3. Перенести мозг сухой лед немедленно, а затем хранить его при температуре -80 ° С в трубке до дальнейшей обработки.
   4. Разморозить ткани мозга до сбора урожая.
   5. Поместите мозг спинной стороной вверх, и урожай ткани мозга от стimulated кору головного мозга (вокруг горячего пятна в первичной моторной коре) на льду с помощью microforceps и microscissors. Поместите заготовленной ткани в 1,5 мл трубки.
3. подготовка РНК
   1. Экстракт тотальной РНК из гомогенатов тканей с использованием реактива для лизиса ^22. Процесс ДНКазой пищеварения и очистки процедур. Количественно образцы РНК и аликвоты и хранить их при температуре -80 ° С до использования.
   2. Для контроля качества, оценить чистоту и целостность РНК с помощью гель-электрофореза в денатурирующем, при соотношении OD 260: 280, и анализируют их на коммерчески доступного анализатора.
4. Этикетировочное и очистка
   1. Amplify и очищают тотальной РНК с использованием коммерчески доступного набора для амплификации РНК с получением биотинилированного кРНК. Если коротко, то обратный транскрибировать 550 нг тотальной РНК в кДНК с использованием Т7 олиго (дТ) праймера. Обобщить и в пробирке транскрибировать второй нити кДНК , а затем пометить его с биотин-NTP.
   2. После того, как PURфикация, количественную оценку кДНК с использованием спектрофотометра.
5. Гибридизация и экспорта данных ²³
   1. Используйте выражение beadchip для анализа экспрессии мРНК. Гибридизацию меченных 750 нг кДНК образцов для каждого выражения шарика массива крысу-12 в течение 16 - 18 ч при 58 ° С. Провести обнаружение сигнала массива с помощью стрептавидин-Су3.
   2. Сканирование массивов с конфокальной сканера. Выполните обработку экспорта данных массива и анализ с использованием коммерчески доступного программного обеспечения.

Пятнадцать 8-недельные самцы Sprague-Dawley крыс были использованы для отдельного анализа надежности между оценщик определения МТ. Используя пальпацию подергивание мышц, МЦ были получены у всех крыс и измеряется как 33,00 ± 4,21% максимального выхода стимулятора (% MSO) и 33,93 ± 0,88% MSO, соответственно, двумя независимыми исследователями. смещения Бленд-Альтман был -0,93, а 95% пределов соглашения были -9.13 до 7.26%.

В эксперименте микро-ПЭТ на шести 8-недельных крыс (N = 4 в мТМС 1-Гц, и п = 2 в группе с имитацией МРВ), поглощение ¹⁸ F-ФДГ в трансформирования рассчитывали как усредненный нКи / см после калибровки обоих ипсилатеральных и контралатеральной кору головного мозга в одних и тех же изображений. Радиоактивность в контрлатеральной области был использован в качестве эталона для нормализации данных, полученных в ипсилатеральной области, и рассчитывали отношение дифференциальное поглощение (DUR).Средние DURs, полученные из трех следующих друг за другом поперечных изображений были усреднены для получения DURs для крыс. Это та же методология , используемая в предыдущем исследовании ^{21. 18} ФДГ-ПЭТ снимки показали , фокусное увеличение метаболизма глюкозы в вынужденном левой корковой области в группе 1-Гц, поддерживая unilaterality из МТР (рисунок 3).

В исследовании микрочипов мРНК, качество гибридизации и общей производительности чипа контролировали путем визуального осмотра обоих проверок внутреннего контроля качества и сырых сканированных данных. Массив данных были отфильтрованы в соответствии с детектированием значение р <0,05 (по аналогии с отношением сигнал-шум), по меньшей мере, 50% образцов (требуется более высокое значение сигнала для получения определения значения р <0,05). Выбранное значение сигнала ген был нанят логарифм и нормализованы с помощью метода квантиль. Статистическая значимость выражения дата определяли с помощью теста Манна-Уитни U и сложите изменения, в которых нулевая гипотеза заключалась в том, что не существует различий между 1 Гц МТР (п = 4) и фиктивные группы (п = 4). Частота ложных обнаружения контролируется регулированием значения р с помощью алгоритма Benjamini-Höchberg. После нормализации и фильтрации, показывая значительные мРНК дифференциальные выражения (| изменить раза | 1,2, р <0,05) были выбраны. В результате уровни экспрессии непосредственных ранних генов были в группе мТМС значительно выше , чем в группе мнимым, с выражениями дуги, Junb и генов Egr2 повышающей регуляции (фиг.4А).

Кроме того, мы измерили BDNF мРНК выражения в вынужденном и контралатеральной коры головного мозга после того, как 5 дней подряд 20-мин МРВ (N = 5 каждый в 1 Гц и 20 Гц) групп. После стимуляции 1 Гц, BDNF экспрессия мРНК была значительно ВЫСОг в вынужденном коре , чем в контралатеральной одной (рис 4В). Это показало, дифференциальные МТР-индуцированные изменения в стимулированных и контралатеральной кору головного мозга.

Рисунок 1. Экспериментальные настройки. (А) внутривенный катетер вставлен в боковую хвостовую вену (стрелки), и носовой обтекатель используется для анестезии с изофлуран, а также для кислорода добавки после переключения на внутривенное пропофола. (В ) Спинной переднелатеральную вид во мТМС. (вид задней C) спинной. Поверхность катушки фигурное из-8 ангулейтд 45 ° к основанию , чтобы свести к минимуму возможность прямой стимуляции контралатеральной коры головного мозга. (D) Схематическое изображение фиктивных МТР. Катушка помещается 2 см от и наклонена перпендикулярно (поворот на 90 °)в своде черепа. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Система охлаждения использует Водно-циркуляционный насос с двигателя. Лед упаковка на медные провода катушки не требуется, так как система охлаждения enwrapping кабель катушки достаточно для охлаждения тепла , производимого на медных проволок. Поверхность катушки не находится в прямом контакте с ледяной водой. Система охлаждения активна во время сеансов стимуляции.

Рисунок 3. позитронно - эмиссионной томографии (ПЭТ) изображения. (А) корональные разделы микро-ПЭТ изображенийкрыса , полученный с использованием 2- [F-18] фтор-дезоксиглюкоза, показывая повышенный метаболизм глюкозы в местной стимулированного коре после 1-Гц мТМС в течение 10 мин при 100% МТ (стрелки). (B) Соотношение поглощения ФДГ при вынужденном / контралатеральной коры в 1-Гц (п = 4) и фиктивным мТМС группа (п = 2). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. мРНК микрочипов генов предраннего и BDNF. (А) дуги, Junb и Egr2 были дифференцированно выражены, которые были определены на микрочипе полученные через 5 мин после 1 сессии по 1 Гц мТМС, упорядоченные по кратному изменению. Уровни экспрессии генов были значительно выше в группе МРВ (N = 4) тхап в группе фиктивный (п = 4) (р <0,05 с Манна-Уитни тест U), с выражениями генов Arc, Junb и Egr2 активируемых. (В) Через 5 дней подряд 20-мин 1 Гц мТМС, BDNF экспрессия мРНК была в вынужденном коре значительно выше , чем в контралатеральной стороне (* р <0,05, Критерий Уилкоксона). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Основная цель данного исследования состояла в том, чтобы ввести животную модель односторонних МТР. Хотя одностороннее стимулирование является одним из наиболее фундаментальных характеристик исследований человека МТР, многие исследования не принимали его в маленьких животных. Тем не менее, Ротенберг и др. ¹⁵ записано контралатеральной MEPs при стимуляции 100% МП с помощью катушки фигура-8 с наружным диаметром лепестка 20 мм, в то время как стимуляция с 112,5% и 133,3% MT производства Ипсилатеральная, а также контралатеральной евродепутатов. Это может быть потому, что большое индуцированное электрическое поле может влиять на контралатерального полушария. Таким образом, наше исследование является продолжением этой предыдущей работы ^15,24, путем перемещения катушки более бокового наклона и это , чтобы подчеркнуть одностороннее стимулирование. Основная цель данного исследования была достигнута , потому что мы подтвердили , что микро-ПЭТ выявлено локальное повышение метаболизма глюкозы в вынужденном коре головного мозга после МТР (рисунок 3).

Анестезия может потенциально снижать возбудимость нейронов, метаболизм глюкозы и экспрессию генов. Haghighi и др. показали , что изофлуран при концентрации 0,5% значительно депрессии электрических транскраниальной MEPs записанных от крыс ^17. С другой стороны, во время Евродепутаты инфузии пропофола достигает 40 мг / кг [· ч] были сохранены, с амплитудами оставшихся больших у крыс ^18. В человеческом исследовании, не потенциалы соединения мышц действий (CMAP) во время изофлуран анестезии не было обнаружено. Тем не менее, 333 Гц, четыре импульса магнитная стимуляция вызывала CMAP в мизинца мышцы у 75% больных, а в передней большеберцовой мышцы у 65% больных, во время анестезии пропофолом ^19. Использование Awoken животных может быть лучшим выбором в Physiological аспекты, но они не так легко сдерживать во время МТР и склонны к стрессовым условиям.

В устранении неполадок, простой кулер, который используется с водой циркуляционного насоса позволило нам увеличить продолжительность стимуляции в течение более чем 20 минут даже при частоте стимуляции 20 Гц. Это важно, поскольку она позволяет так много раздражений как в протоколах МТР для человека. Охлаждение катушки фигура-8 только с портативной ледяной мешок воды было недостаточно, чтобы обеспечить стимуляцию более чем на 20 мин. Долговременность мТМС у мелких животных предоставит возможность для глубокого изучения молекулярных механизмов МТР. Коммерчески доступные охлажденные катушки крысы будут разумные альтернативы.

Существовали некоторые ограничения в этом эксперименте. Во-первых, только двухфазный импульс был доступен, который был ограничением машины мТМС мы использовали. будут необходимы дальнейшие исследования, изучающие влияние различных импульсов и сигналов.Во-вторых, мы приняли прагматичный подход для определения порога двигателя при пальпации. Хотя этот метод может быть ниже методов ЭМГ с точки зрения точности, он легко воспроизводим и применим ко многим научных гипотез. Например, если основной целью исследователя было изучить различия между первичной моторной коре головного мозга и смежных subcortices в мТМС-индуцированного гена или экспрессии белка, более точное определение порогового значения двигателя будет необходимо. Если исследователь, тем не менее, хотел проанализировать мТМС индуцированную профили экспрессии генов в дорсолатеральной префронтальной коры головного мозга ткани, настоящее прагматичный подход может быть достаточно, потому что расстояние и угол между тканью-мишенью и катушкой может слегка изменяться во время движения катушки от M1 до площади ДЛПФК. В-третьих, хотя мы успешно применяется МТР на одностороннее полушарие головного мозга крысы, до сих пор стимуляция не так, как фокусное МТР в человеческом исследований. Вызванная сильное электрическоеполе от ~ 0,5 см ² на менее чем на 10 см ² поверхности мозга крысы кажется относительно более диффузным , чем в человеческой полусферической поверхности ~ 2500 см ^{2 27.} Однако мы полагаем, что модель , представленная здесь , может быть использован для выяснении молекулярные механизмы МТР, позволяя анализ межполушарной разницы в его влиянии.

The authors have nothing to disclose.

This work was supported by the Korea Research Foundation Grant funded by the Korean Government (KRF-2008-313-E00458). The authors thank Jin-Joo Lee for the technical assistance.