Estimulação Magnética Transcraniana repetitiva para o Hemisfério unilateral do cérebro de rato

We applied repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) to the unilateral hemisphere of rat brain, by placing a 25-mm figure-8 coil 1 cm lateral to the vertex on the biauricular line and angulating the coil by 45°. An in-house water cooling system was used for rTMS for more than 20 min.

Previous rodent models of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) adopted whole-brain stimulation instead of unilateral hemispheric rTMS, which is unlike the protocols used for human subjects. We report a successful application of rTMS to the unilateral hemisphere of rat brain. The rTMS was delivered with a low-frequency (1 Hz), high-frequency (20 Hz), or sham stimulation protocol to one side of the brain by using a small 25-mm figure-8 coil. We placed the center of the coil 1 cm lateral to the vertex on the biauricular line and angulated the coil 45° to the ground to minimize a potential direct effect of rTMS on the contralateral cortex. We also used an in-house water cooling system to enable repetitive magnetic stimulation for more than 20 min, even at a 20-Hz stimulation frequency. Increases in the transcriptions of immediate early genes (Arc, Junb, and Egr2) were greater after rTMS than after sham stimulation. After 5 consecutive days of 20-min 1-Hz rTMS, bdnf mRNA expression was significantly higher in stimulated cortex than in contralateral side. The model presented herein will elucidate the molecular mechanisms of rTMS by allowing analysis of the inter-hemispheric difference in its effect.

Transcraniana repetitiva estimulação magnética (rTMS), uma ferramenta para a estimulação do cérebro não-invasivo e neuromodulação, tem sido aplicada no tratamento de várias condições, tais como dor central ^{1,2, 3} depressão, enxaqueca ^4, e mesmo acidente vascular cerebral ^5-7. Rápida mudança de corrente eléctrica através de bobinas na cabeça induz um campo eléctrico sobre o córtex cerebral e uma activação neuronal resultante. A excitabilidade do córtex cerebral pode ser modulada pela rTMS, que podem durar por mais do que 30 minutos após a estimulação é terminada.

Mecanismos sugeridos dos EMTr pós-efeito incluem potenciação de longa duração / depressão-como efeito ^8, mudança transitória no equilíbrio iônico ^9, e alterações metabólicas ^10. Além disso, Di Lazzaro et ai. sugerem que a estimulação-explosão teta intermitente afecta as entradas sinápticas excitatórias para neurónios do tracto piramidal, tanto no estimuladase no hemisfério contralateral ^11.

limitações significativas, no entanto, têm impedido pesquisadores de traduzir provas on-banco para situações clínicas. Em primeiro lugar, em estudos com animais anteriores, a EMTr foi usado para a estimulação do cérebro inteiro ^12. Estimulação do cérebro inteiro é bastante diferente dos protocolos utilizados em estudos com seres humanos ^9. O outro problema está relacionado com a duração de estimulação. Isto é, pelo menos parcialmente atribuível ao facto de que um sistema de arrefecimento eficaz não estava disponível para as pequenas bobinas no passado.

Nos últimos anos, os artigos seminais foram publicados sugerindo a forma de ultrapassar estas dificuldades no experimento a rTMS sobre o pequeno cérebro animal. Por estes modelos animais, foi revelado que o cérebro de rato também mostra alterações excitabilidade cortical similares como em humanos em resposta a rTMS de baixa frequência ^13. Mais importante ainda, os mecanismos celulares e moleculares da rTMS são cada vez mais being investigada utilizando modelos animais de EMTr. Um caso em questão é que um tipo distinto de interneurônio inibitória é conhecido por ser mais sensível à teta intermitente explosão estimulação ^14. modelos de roedores de EMTr, assim, oferecer novas oportunidades para explorar questões muito procurado sobre as bases moleculares das alterações induzidas EMTr. Se os pequenos modelos animais de EMTr pode ser usado em mais laboratórios, pode extremamente acelerar e reforçar a investigação nesta área.

Estamos agora descrever como aplicar EMTr para o hemisfério unilateral do cérebro de rato, uma extensão do trabalho anterior ^15. mudanças induzidas pela estimulação foram avaliados por meio de tomografia micro-Positron Emission (PET) e microarrays de mRNA para estudar mudanças induzidas EMTr de no córtex cerebral estimulada.

Todos os procedimentos que utilizam animais foram revistos e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal do Hospital da Universidade Nacional de Seul.

1. Configuração Experimental

1. preparação animal
   1. Permitir ratos Sprague-Dawley de 1 semana para se adaptar ao seu novo ambiente antes de iniciar a experiência.
      Nota: Embora 8 semanas ratos velhos foram usadas no presente estudo, um desenvolvimento ou adulto cérebro pode ser escolhido de acordo com as hipóteses de pesquisa.
2. anestesia inalatória para a indução
   1. Induzir e manter anestesia com 5% e 2% de isoflurano dissolvido em 40% / 60% e 25% / 75% de oxigénio / azoto, através de um cone de nariz e da câmara, respectivamente. Ajustar a profundidade da anestesia com o nível de abolir o reflexo de retirada pedal para pitada dedo do pé para confirmar anesthetization adequada.
      NOTA: Usando animais despertadas pode ser uma escolha melhor em termos de translação, mas há dificuldade para conter durante a EMTr e they são propensas ao estresse excessivo.
   2. Monitorar a temperatura corporal com uma sonda rectal e mantê-la a 37 ° C usando um cobertor homeotérmico. Monitorização da profundidade anestésica usando pedal reflexo de retirada, temperatura, freqüência respiratória e freqüência cardíaca.
3. A transição para a anestesia intravenosa para manutenção
   1. Prepare a cauda com um algodão embebido em álcool. Cateterização de uma veia lateral da cauda com um cateter venoso 24 de bitola para a transição para a anestesia IV (Figura 1A). Carga de propofol por via intravenosa (1 mg / kg [· min] durante 10 min, utilizando 10 mg / ml de emulsão) para os animais. Descontinuar o isoflurano 5 minutos após o início do carregamento propofol.
   2. Manter propofol sedação a uma taxa de infusão de 500 - 700 ng / (kg • min) durante todo o experimento, como em um estudo anterior ^16. Suplemento de oxigênio em 0,8 L / min através de um cone do nariz.
      NOTA: A anestesia com propofol é reduzir a potencial supressão da excitabilidade cortical pelo inalagente ção ^17-19. No entanto, não é obrigatória a anestesia em experiências rTMS, e animais acordado também pode ser usado. métodos de anestesia deve ser decidida tendo em conta as hipóteses de pesquisa.
   3. Use pomada veterinária nos olhos para evitar a secura e sob anestesia.
   4. Aplicar estimulação magnética (ver Seção 2) 10 min após a transição completa para a anestesia iv.
4. condições de recuperação
   1. Monitorar os sinais vitais durante a fase de recuperação. Não deixe o animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Se um animal foi submetido a cirurgia, não devolvê-lo para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
      NOTA: Se a cirurgia para um modelo de doença é realizado, é necessário pós-cirúrgica gestão da dor. No entanto, a gestão da dor não é necessário para este experimento EMTr.

Estimulação Magnética Transcraniana repetitiva 2.

1. Estimulador e serpentina
   1. Aplicar a estimulação por meio de um estimulador repetitivo que proporciona estímulos bifásica através de uma forma de 8 bobina de 25 mm. Localizar o centro da bobina de 0,5 cm lateral para o vértice na linha biauricular, e angulate a bobina 45 ° em relação ao chão.
      NOTA: A intensidade de campo magnético máximo da bobina é de 4,0 T. A bobina magnética é montada firmemente num suporte embutido.
2. limiar motor
   1. Determinar o limiar motor (MT) no ponto de acesso, com o centro da bobina posicionadas 0,5 cm lateral para o vértice na linha biauricular e com a parte plana da superfície para a calvária. Esta é a mesma metodologia utilizada em estudo anterior ^20.
      NOTA: Definir MT como a intensidade mínima de estímulo evocando 5 ou mais palpáveis ​​contrações na pata dianteira contralateral por 10 estímulos consecutivos. Verificar se a estimulação é principalmente causando contração muscular contralateral para garantir a estimulação unilateral.
3. Aplicação de EMTr
   1. Aplicar a EMTr 10 min, após estabilização da anestesia profunda. Colocar o centro da bobina no local da rTMS alvo, seleccionado a partir de córtices cerebrais, dependendo questões de pesquisa. Em seguida, incline a bobina para assegurar o contacto directo entre o centro da bobina e a superfície do crânio no ponto de estimulação.
      NOTA: Por exemplo, os angulate bobina 45 ° em relação ao chão para minimizar efeitos directos potenciais da rTMS no córtex contralateral (Figura 1B e 1C).
   2. Submeter os animais a uma sessão de 20 e mínimo de EMTr do hemisfério unilateral. Usando o console software, entregar EMTr com uma baixa frequência (1 Hz), de alta frequência (20 Hz), ou protocolo de estimulação sham, e definir a intensidade de estimulação de 100-110% do MT.
   3. Execute um estímulo Hz sem descanso. Usando a entrada do console software "1200" tiros para "20" min). Para a estimulação de 20 Hz, a conduta 2 segundos de estimulação, seguido por 28sec de descanso. Usando a entrada do console software "1.600" tiros para "20" min.
   4. Para a estimulação sham, inclinar a bobina perpendicular (90 ° de rotação) para a calvária e colocar a borda bobina de 2 cm de distância da superfície da cabeça (Figura 1D). Fixar o suporte da bobina firmemente ao aparelho principal; não há necessidade de manter a bobina à mão durante a experiência.
      NOTA: Para compensar os efeitos não específicos acústicos e outros, protocolos sham distintas devem ser usados ​​para protocolos de estimulação distintas. Por exemplo, a estimulação sham 1 Hz pode ser usado para 1-Hz rTMS experiências.
4. O arrefecimento da bobina
   1. Use um sistema de refrigeração de água para permitir a estimulação magnética repetitivo por mais de 20 minutos a 1 e 20 Hz frequências de estimulação (Figura 2). Circular a água gelada em torno de todo o comprimento da bobina durante a experiência para evitar o sobreaquecimento, embora a temperatura da serpentina ou estimulador não é monitorado.
      NOTA: bobinas de rato arrefecidos comercialmente disponíveis também podem ser utilizados.
   2. Se possível, monitorar a temperatura da bateria visualizando o indicador de aquecimento da máquina EMTr. NOTA: Não houve consequências adversas relacionadas com a estimulação EMTr. Há, no entanto, um risco de queimadura potencial se etiquetas de identificação ouvido de metal são usados ​​próximos a bobina estimulante.

3. Micro Positron Emission Tomography

1. preparação animal
   1. Realizar anestesia inalação para indução e anestesia iv para manutenção (veja o passo 1.2.1 e 1.3.1). Aplicar-1 Hz rTMS a um animal durante 10 minutos a uma intensidade de estimulação de 100-110% do MT.
   2. Cinco minutos depois de terminar a estimulação rTMS, injectam-se 1 mCi de 2- [F-18] f luoro-desoxiglucose (FDG ¹⁸⁾ dissolvido em 0,5 ml de solução salina normal por via intravenosa através de um cateter na veia da cauda. Permitir 30 min para ¹⁸ de captação de FDG. NOTA: Coloque o rato sob anestesia durante toda a micro-PEexperimento T.
2. análise de imagem
   1. Usar um scanner PET para imagens do cérebro para reafirmar a unilateralidade da estimulação. Reconstruir imagens com um algoritmo iterativo 3-D. Para avaliar as alterações no metabolismo induzidas pela rTMS, identificar as regiões de interesse (ROI) nas imagens das secções de cérebro transversais ^21.
3. Eutanásia
   1. Após a realização de imagens micro-PET, a eutanásia dos ratos numa câmara de pré-cheio com dióxido de carbono enquanto os ratos são em anestesia profunda.

4. mRNA Microarray

1. Eutanásia
   1. Induzir e manter anestesia com 5% e 2% de isoflurano dissolvido em 40% / 60% e 25% / 75% de oxigénio / azoto, através de um cone de nariz e da câmara, respectivamente. Anestesiar profundamente ao nível de abolir o reflexo de retirada pedal para pitada dedo do pé antes de ser decapitado.
   2. Decapitar os ratos para a eutanásia 5 min após 1 sessão de 1-Hz EMTr.
2. colheita de tecidos
   1. Lay out materiais e instrumentos cirúrgicos na ordem de uso, incluindo toalhas dobradas de papel, um rongeur óssea, microtesoura, maiores tesoura cirúrgica, um microforcep, uma lâmina de bisturi n º 10 ou 11, um com tampa de 10 cm placa de petri de vidro cheio de gelo e tubos de 1,5 ml. Prepare um saco de plástico para reciclagem de carcaça.
   2. Faça uma incisão na pele na linha média na anterioposteriorly crânio. Sem rodeios dissecar os tecidos moles e músculos que rodeiam com uma tesoura cirúrgica, e retire o pedaço do osso do crânio utilizando um rongeur óssea. dissecar rapidamente o cérebro fresco cuidadosamente do crânio. Em seguida, colocá-lo em gelo usando as micropinças e microtesoura. Lavar o tecido cerebral em solução salina normal gelada.
   3. Transferir o cérebro imediatamente gelo seco, e, subsequentemente, armazená-lo a -80 ° C em um tubo até ulterior processamento.
   4. Descongelar o tecido cerebral antes da colheita.
   5. Coloque o lado dorsal do cérebro, e colher o tecido cerebral do stimulated córtex cerebral (ao redor do ponto quente no córtex motor primário) em gelo usando os microfórceps e microtesouras. Colocar o tecido recolhido no tubo de 1,5 ml.
3. preparação de ARN
   1. Extrair o ARN total a partir de homogenatos de tecidos, utilizando o reagente de lise ^22. Processo com a digestão DNase e procedimentos de limpeza. Quantificar as amostras de ARN e alíquotas e armazená-las a -80 ° C até à sua utilização.
   2. Para o controlo de qualidade, avaliar a pureza e integridade do RNA por electroforese em gel desnaturante, a uma razão OD de 260: 280, e analisá-las num analisador disponíveis comercialmente.
4. Rotulagem e purificação
   1. Amplificar e purifica-se o ARN total utilizando um estojo de amplificação de ARN comercialmente disponível para se obter cRNA biotinilado. Resumidamente, inverter-transcrever 550 ng de ARN total em ADNc utilizando um iniciador de T7 de oligo (dT). Sintetizar e in vitro transcrever a segunda cadeia de cDNA e, em seguida, rotulá-la com biotina-NTP.
   2. após purificação, quantificar ADNc utilizando um espectrofotómetro.
5. Hibridação e exportação de dados ²³
   1. Utilizar a beadchip expressão para a análise de expressão de ARNm. Hibridizam os 750-NG amostras de cDNA marcadas para cada matriz talão expressão rat-12 para 16-18 horas a 58 ° C. Realizar a detecção de sinal de matriz, utilizando estreptavidina-Cy3.
   2. matrizes de digitalização com um scanner confocal. Executar o processamento de exportação de dados de matriz e análise usando um software disponível comercialmente.

Quinze 8 semanas de idade do sexo masculino ratos Sprague-Dawley foram utilizados para a análise de confiabilidade entre avaliadores separada de determinação MT. Usando palpação dos espasmos musculares, os MTs foram obtidos em todos os ratos e medido como 33,00 ± 4,21% máxima saída do estimulador (% MSO) e 33,93 ± 0,88% MSO, respectivamente, por dois pesquisadores independentes. viés de Bland-Altman foi -0,93, e os limites de 95% de concordância foram -9,13 para 7,26%.

Na experiência de micro-PET em seis ratos com 8 semanas de idade (n = 4 nas rTMS 1-Hz, e n = 2 no grupo rTMS sham), a captação de ^18F-FDG na ROI foi calculado como a média nCi / cc após a calibração de ambos os córtices cerebrais ipsilateral e contralateral nas mesmas imagens. A radioactividade na área contralateral foi utilizado como uma referência para normalizar os dados obtidos na área ipsilateral, e foi calculado o rácio de absorção diferencial (DUR).Os durs médios obtidos a partir de três imagens transversais consecutivos, foi usada para obter a durs para os ratos. Esta é a mesma metodologia utilizada no estudo anterior ^{21. 18} As imagens de FDG-PET mostrou um aumento focal no metabolismo da glicose na área cortical esquerda estimulada no grupo 1 Hz, apoiando unilateralidade da rTMS (Figura 3).

No estudo de microarray ARNm, a qualidade de desempenho global de hibridação e chip foram monitorizadas por inspecção visual de ambos os controlos de qualidade internos e dados digitalizados em bruto. dados de matriz foram filtrados de acordo com um valor de detecção de p <0,05 (semelhante à relação sinal-ruído) em amostras de, pelo menos, 50% (um valor de sinal mais elevada foi necessária para obter um valor de detecção de p <0,05). O valor de sinal do gene seleccionado foi transformada por logaritmo e normalizados utilizando um método quantil. A significância estatística da expressão data foi determinada por meio do teste de Mann-Whitney U e dobra mudança, em que a hipótese nula de que não existe diferença entre o 1-Hz EMTr (n = 4) e grupos placebo (n = 4). A taxa de detecção falsa foi controlado, ajustando o valor de p, utilizando o algoritmo de Benjamini-Hochberg. Após a normalização e filtração, ARNms mostrando expressões diferenciais significativas (| mudança dobra | 1,2, p <0,05) foram selecionados. Como resultado, os níveis dos genes precoces imediatos de expressão foram significativamente maiores no grupo a rTMS do que no grupo de simulação, com as expressões do Arco, JunB e genes regulados positivamente EGR2 (Figura 4A).

Além disso, medimos expressões de mRNA BDNF no córtex estimulada e contralateral após 5 dias consecutivos de 20 min EMTr (n = 5 cada no 1-Hz e 20 Hz-grupos). Após estimulação 1 Hz, a expressão de ARNm de BDNF foi significativamente higher no córtex estimulado do que na contralateral (Figura 4B). Isto revelou EMTr-induzidos diferenciais alterações nos córtices cerebrais estimuladas e contralateral.

Figura 1. Configurações experimentais. (A) um cateter intravenoso é inserido numa veia lateral da cauda (seta), e um cone de ponta é utilizada para a anestesia com isoflurano, bem como para o suplemento de oxigénio após uma comutação de propofol. (B ) Dorsal vista ântero-lateral durante a EMTr. (vista posterior C) Dorsal. A superfície de uma bobina de figura de oito é angulado 45 ° em relação ao solo para minimizar a potencial estimulação directa do córtex contralateral. (D) Uma ilustração esquemática da rTMS sham. A bobina é colocada 2 cm de distância e inclinado perpendicular (90 ° de rotação)a calota craniana. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. O sistema de arrefecimento utiliza uma bomba de circulação de água com motor. Embalagem de gelo sobre os fios de cobre com a bobina não é necessário, tal como o sistema de arrefecimento envolvendo-o cabo da bobina é suficiente para arrefecer o calor produzido nos fios de cobre. A superfície da bobina não está em contacto directo com a água gelada. O sistema de arrefecimento está activo durante as sessões de estimulação.

Figura 3. Positron Emission Tomography (PET) de imagem. (A) Os cortes coronais de imagens micro-PET deum rato obtido utilizando 2- [F-18] f luoro-desoxiglucose, mostrando o aumento do metabolismo da glicose em locais do córtex estimuladas após 1 Hz-rTMS de 10 min a 100% do TM (setas). (B) a proporção de absorção de FDG na estimulada córtex / contralateral no 1-Hz (n = 4) e sham grupo EMTr (n = 2). por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. O ARNm dos genes de Microarray precoce imediato e BDNF. (A) do arco, JunB, e EGR2 foram expressos diferencialmente, que foram identificados no microarray obtidos 5 minutos depois de uma sessão de 1-rTMS Hz, ordenados por mudança de dobragem. Os níveis de expressão dos genes foram significativamente maiores no grupo a rTMS (n = 4) THAn no grupo sham (n = 4) (p <0,05 com Mann-Whitney U), com as expressões dos genes Arc, JunB, e EGR2 regulados positivamente. (B) Depois de 5 dias consecutivos de 20 min 1 Hz EMTr, expressão de mRNA BDNF foi significativamente maior no córtex estimulado do que no lado contralateral (* p <0,05, Wilcoxon signed-rank). por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O objetivo principal deste estudo foi a introdução de um modelo animal de EMTr unilaterais. Embora a estimulação unilateral é uma das características mais fundamentais da investigação EMTr humanos, muitos estudos não adoptaram-lo em pequenos animais. No entanto, Rotenberg et ai. ¹⁵ gravada eurodeputados contralaterais com estimulação de 100% MT utilizando uma bobina Figura-8 com um diâmetro exterior lóbulo de 20 mm, enquanto que a estimulação com 112,5% e 133,3% MT produzido ipsilaterais, bem como eurodeputados contralaterais. Isso pode ser porque o campo elétrico induzido grande pode afetar o hemisfério contralateral. Assim, nosso estudo é uma extensão deste trabalho anterior ^15,24, movendo a bobina mais lateral e inclinando-o para acentuar a estimulação unilateral. O objectivo primário deste estudo foi realizado porque confirmou que a micro-PET revelou um aumento local no metabolismo da glicose no córtex cerebral estimulada após a rTMS (Figura 3).

A anestesia pode potencialmente depreciar a excitabilidade neuronal, metabolismo da glucose, e a expressão do gene. Haghighi et ai. revelou que o isoflurano em concentração de 0,5% significativamente deprimidos deputados transcraniana elétricos gravados a partir de ratos ^17. Por outro lado, os deputados foram preservados durante a infusão de propofol tão alto quanto 40 mg / [kg · h], com amplitudes restante grande em ratos ^18. Em um estudo humano, há potenciais de ação muscular composto (CMAP) foram detectados durante a anestesia isoflurano. No entanto, 333 Hz, estimulação magnética de quatro impulsos evocados CMAP no músculo hipotenar em 75% dos pacientes, e no músculo tibial anterior em 65% dos pacientes, durante a anestesia de propofol ^19. Usando animais despertadas pode ser uma escolha melhor nos physaspectos iological, mas eles não são fáceis de conter durante a EMTr e são propensos a condições estressantes.

Como solução de problemas, um refrigerador simples que usou uma bomba de circulação de água nos permitiu estender a duração estimulação por mais de 20 minutos, mesmo com uma frequência de estimulação de 20 Hz. Isto é importante porque permite que o maior número de estimulações como em protocolos rTMS para sujeitos humanos. O arrefecimento da bobina Figura-8 com apenas um saco de água gelada de mão não foi suficiente para assegurar a estimulação de mais de 20 min. duração EMTr longa em pequenos animais irá proporcionar a oportunidade para investigação aprofundada dos mecanismos moleculares da EMTr. Comercialmente disponíveis bobinas de ratos resfriados será alternativas razoáveis.

Houve várias limitações desta experiência. Em primeiro lugar, apenas uma pulso bifásico estava disponível, o que era uma limitação da máquina rTMS foi utilizado. serão necessários futuros estudos investigando o efeito de vários pulsos e formas de onda.Em segundo lugar, nós adotamos uma abordagem pragmática para determinar o limiar motor por palpação. Embora este método possa ser inferior às técnicas EMG em termos de precisão, é facilmente reprodutível e aplicável a muitas hipóteses de pesquisa. Por exemplo, se o objetivo principal de um investigador foram investigar diferenças entre o córtex motor primário e subcortices adjacentes no gene induzida por rTMS ou expressão da proteína, seria necessário determinação mais precisa do limiar motor. Se um investigador, no entanto, desejado para analisar a rTMS induzida por perfis de expressão do gene no tecido cortical dorsolateral pré-frontal, a presente abordagem pragmática pode ser suficiente, porque a distância e o ângulo entre o tecido alvo e a bobina pode variar ligeiramente durante o movimento da bobina a partir da M1 para a área de DLPFC. Em terceiro lugar, embora tenhamos aplicado com sucesso EMTr no hemisfério unilateral do cérebro de rato, ainda o estímulo não é tão focal como EMTr em pesquisa com seres humanos. A forte fi eléctrico induzidocampo de ~ 0,5 centímetros ² em menos de 10 ^cm2 de superfície do cérebro de rato parece ser relativamente mais difusa do que na superfície hemisférica humano de ~ 2,500 centímetros ^{2 27.} Acreditamos, contudo, que o modelo aqui apresentado pode ser utilizado para elucidar os mecanismos moleculares da EMTr, permitindo análise da diferença inter-hemisférica em seu efeito.

The authors have nothing to disclose.

This work was supported by the Korea Research Foundation Grant funded by the Korean Government (KRF-2008-313-E00458). The authors thank Jin-Joo Lee for the technical assistance.