Развитие многоклеточного трехмерной модели Органотипической слизистой оболочки пищеварительного тракта человека Выращенный в условиях микрогравитации

Клетки , растущие в трехмерной (3-D) среды представляют собой значительное улучшение по сравнению с выращиванием клеток в 2-D средах (например, колбах или блюда). Здесь мы опишем развитие многоклеточного 3-D модели органотипического слизистой оболочки кишечника человека, культивируемых в условиях микрогравитации, представленной вращающейся стенки сосуда (RWV) биореакторах.

Поскольку клетки растут в трехмерной (3-D) среде имеют потенциал для преодоления многих пробелов культивирования клеток в 2-D средах (например., Колбах или блюда). На самом деле, широко признается, что клетки, выращенные в колбах или блюда, как правило, де-дифференцироваться и теряют специализированные особенности тканей, из которых они были получены. В настоящее время существует в основном два типа систем культивирования 3-D, где клетки высевают в каркасах, имитирующие нативную внеклеточного матрикса (ECM): (а) статические модели и модели (б) с использованием биореакторов. Первый прорыв был статические модели 3-D. 3-D модели, использующие биореакторы, такие как вращающейся стенки-сосуда (RWV) биореакторы являются более недавнее развитие. Первоначальная концепция RWV биореакторов была разработана в Космическом центре имени Джонсона НАСА в начале 1990-х годов и, как полагают, чтобы преодолеть ограничения статических моделей, таких как развитие гипоксических, некротических ядер. В RWV биореакторов может обойти тысявляется проблемой, обеспечивая гидродинамику, которые позволяют эффективно диффузию питательных веществ и кислорода. Эти биореакторы состоят из вращающей базы , которая служит для поддержки и вращения двух различных форматов культуры судов , которые отличаются по типу источника аэрации: (1) Slow Turning Боковые Сосуды (STLVs) с коаксиальным оксигенаторе в центре, или (2 ) Коэффициент сосудов высокого Aspect (HARVs) с оксигенации при помощи плоского, силиконового каучука газообмена мембраны. Эти суда позволяют эффективную передачу газа, избегая образования пузырьков и последующее турбулентность. Эти условия приводят к ламинарного потока и минимальным усилием сдвига, что модели пониженной гравитации (микрогравитации) внутри сосуда для культивирования. Здесь мы описываем развитие многоклеточного 3-D модели органотипического слизистой оболочки кишечника человека, состоящей из кишечной эпителиальной клеточной линии и первичных человеческих лимфоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов, культивируемых в условиях микрогравитации, предоставленной RWV биореакторе. </ Р>

Первый прорыв в построении модели 3-D сообщалось в начале 1980 - х , когда ученые начали исследовать различные типы эшафоте (например., Ламинин, коллаген типа I, коллаген IV, и фибронектин) и коктейли факторов роста для улучшения от клетки к клетке и ECM взаимодействий "статических" 3-D модели ^1-7. С тех пор, основная проблема с этими моделями были ограничения в передаче питательных веществ и кислорода внутри среды и тканевых конструкций ^8. В отличие от клеток в окружающую среду в естественных условиях , которая получает постоянный поток питательных веществ и кислорода из окружающих сетей кровеносных сосудов, статическая природа этих моделей препятствует эффективному распределению их к клеткам. Например, клеточные агрегаты , образующиеся в статических моделях в пробирке , которые превышают размером в несколько миллиметров неизбежно будет развиваться гипоксические, некротические ядра ^9. В RWV биореакторов может обойти эту проблемуобеспечивая гидродинамику , которые позволяют эффективно диффузию питательных веществ и кислорода ^10-12. Тем не менее, на сегодняшний день работы с использованием RWV биореакторов были ограничены включением одного или двух типов клеток ^13-17. К тому же, вместо пространственной ориентации, подобной нативных тканей, эти клетки образуются клеточные агрегаты. Основной причиной этих ограничений является отсутствие лески, способного включать клетки комплексно. Леса , используемые в RWV биореакторах на сегодняшний день состоят, с некоторыми исключениями ^16-18, в основном из синтетических микросфер, трубчатых цилиндров или небольших листов ^13-15,19-23. Эти жесткие материалы, состав и гибкость не может манипулировать, и к которым клетки прикрепляются к их поверхности. Таким образом, маловероятно , что эти модели будут обеспечивать систему , в которой , чтобы оценить, в интегрированной форме, различные клеточные компоненты , такие как стромальные клетки (например., Фибробласты, иммунные и эндотелиальные клетки) , что should быть рассредоточены в эшафот, чтобы точно имитировать ткани человека.

Здесь мы описываем развитие многоклеточного 3-D модели органотипического слизистой оболочки кишечника человека , состоящей из кишечной эпителиальной клеточной линии и первичных человеческих лимфоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов ^24. Эти клетки культивировали в условиях микрогравитации, отданных RWV биореакторе ^13,25-30. В нашем 3-D модели, ЕСМ обладает многими различными свойствами, такими как осмотическое давление , подобной культуральной среды (например., Незначительные диффузионные удерживающие устройства во время культивирования) и способностью включать клетки и другие соответствующие белки внеклеточного матрикса, а также как соответствующая жесткость для использования в биореакторах ^24. Биологические системы очень сложны, и в течение последних нескольких лет наблюдается сдвиг в фокусе исследований через слизистую оболочку в направлении изучения клеточных взаимодействий с их окружением, а не изучать их в isolatioп. В частности, важность межклеточных взаимодействий в оказании влияния на выживание кишечника и дифференцировки клеток хорошо документирован ^31-34. В частности, связь между эпителиальными клетками и их нишей оказывает глубокое влияние на расширение эпителиальных клеток и дифференцировки ^35. В самом деле, широко признается, что не только от клетки к клетке, но и клетка-ECM взаимодействия имеют решающее значение для поддержания и дифференцировки эпителиальных клеток в моделях 3-D культуры. Предыдущие исследования показали , что кишка ECM белки , такие как коллаген I ^24,36,37, ламинин ³⁸ и фибронектин ³⁹ играют важную роль в оказании влияния на эпителиальные клетки кишечника приобрести пространственную ориентацию , подобную нативной слизистую оболочку. Таким образом, разработка новых технологий, как наш 3-D модели ^24, которая может имитировать требуется фенотипическое разнообразие кишечника , если исследователи намерены воссоздать сложную клеточную и структурную архитектуруи функции кишечника микросреды. Эти модели представляют собой важный инструмент в разработке и оценке новых препаратов и оральных вакцин-кандидатов.

Заявление по этике: Все образцы крови были собраны у добровольцев , которые участвовали в номер протокола HP-00040025-1. Университет штата Мэриленд Совета по рассмотрению Institutional одобрил этот протокол и санкционировал сбор образцов крови от здоровых добровольцев для исследований, включенных в этой рукописи. Целью данного исследования было объяснено добровольцев, и все добровольцы дали информированное, подписанное согласие до взятия крови.

Примечание: смотри таблицу 1 для получения среднего дополнения. В таблице 2 при подготовке 3-D культуральной среды.

1. Подготовка судов культуры

1. Отвинтить крышку заливной порта мл-сосуда 50 и залить 50 мл стерильной культуральной среды (например., RPMI). Выполните все процедуры в стерильных условиях в ламинарном шкафу.
2. Замените крышку и вытрите пролитое среду на любой поверхности с 70% этанола.
3. Дайте судну incubели в течение по крайней мере 15 мин до O / N при комнатной температуре.
4. Используйте порт заливки, чтобы отбрасывать культуральной среды и добавляют 30 мл 3-D культуральной среды.
5. Протрите пролитое среду на любой поверхности с 70% этанола.

2. Получение клеток

1. Человеческой эпителиальной линии клеток (НСТ-8) ^24,40.
   1. Культура клеток в среде RPMI с добавлением 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 50 мкг / мл гентамицина, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES-буфера и 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (ФБС ) (приложение 1). При 70% сплошности, расщепленные клетки в соотношении 1: 5.
2. Ободочной кишки человека фибробласты (CCD-18Co клетки) ^24,41.
   1. Культура клеток в среде базального Орла , обогащенной добавки 1 В сплошности, расщепленные клетки в соотношении 1: 3..
3. Человек пупочной вены (HUVEC) клетки 24,42.
   1. Культура клеток эндотелиальной базальной среды (EBM) среде , обогащенной 100 мкг / мл гепарина, 3 мкг / мл эндотелиальной Supplement клеточного роста (ECGS), и дополнения 1 при 70% сплошности, расщепленных клеток в соотношении 1: 2 . .
4. Лимфоциты / Моноциты
   1. Изолировать мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) из крови путем центрифугирования в градиенте плотности с использованием стандартных методик ^43.
      1. Если коротко, то с помощью 10 мл пипетки, осторожно добавляют 30 мл разбавленной крови (1: 1 в крови: забуференный фосфатом физиологический раствор (ЗФР)) в 50 мл-коническую пробирку, содержащую 10 мл плотности центрифугирование сред. После стадии центрифугирования, лимфоциты и моноциты будет находиться в "белом" слое между плотностью центрифугирования сред и плазменных слоев.
      2. Возьмите белый слой с помощью пипетки передачи. Избегайте загрязнения гранулоцитов путем ограничения сбора плотности центрифугирования сред. После промывки ^43, UРВМС себе как есть или криоконсервации в жидком N _2.
         Примечание: Важно подчеркнуть, что РВМС в основном состоит из лимфоцитов и моноцитов, с небольшой долей дендритных клеток и других типов клеток.
5. Растут все клетки в стандартных условиях культивирования при 37 ° С в атмосфере 5% CO _2.

3. Получение коллагеном внедренных клеток

1. Определить количество вставок необходимости, исходя из числа экспериментальных условий, которые необходимо установить вверх-. Поместите необходимое количество вставок в лунки 6-луночного планшета.
2. Приготовьте суспензию HUVEC и фибробластов:
   1. Промыть колб дважды в PBS и открепления клеток с помощью трипсина, 0,25% (1x) с 0,05% трипсин-тетранатриевый этилендиаминтетраацетат (трипсин-ЭДТА). Добавьте достаточное количество раствора трипсина, чтобы покрыть полноту площади поверхности клеточной культуры. Отрыв обычно происходит в течение 5 до 15 мин
   2. собиратьотдельные клетки в 50 мл-пробирку, содержащую 30 мл среды Игла в модификации Игла (DMEM) -30% ЭТС среды.
   3. Центрифуга трубки при 500g в течение 10 мин.
   4. Ресуспендируют клеток в 30 мл DMEM-30% FBS среды.
   5. Подсчитать общее количество жизнеспособных клеток путем разбавления 20 мкл ресуспендировали клеток с 20 мкл трипанового синего красителя. Загрузите гемоцитометра со смесью клеток. Приемлемые МНПК будет белым ясно; нежизнеспособными РВМС приобретет краситель и станет синим.
      1. Ресуспендируют каждый тип клеток в среде DMEM-30% FBS среде при концентрации 5 - 8 х 10 ⁷ кл мл ^{- 1.}
3. Подготовка клеток, содержащих коллаген гели
   Примечание: Каждое судно потребует подготовки ~ 5 мл клеточной содержащих коллагеновый гель.
   1. В 50 мл-коническую трубку готовят смесь коллагена путем добавления 1 х DMEM средств массовой информации, дополненной 50 мкг / мл гентамицина, 2 мМ L-глутамина и 10% термически inactivatEd ФБС плюс 3 мг / мл бычьего коллагена I, 10 мкг / мл ламинин, 40 мкг / мл коллагена IV, 10 мкг мл фибронектина, 2 мкг / мл гепарин протеогликанов / сульфат и 15 мМ NaOH (для достижения физиологического рН).
   2. Закройте пробирку и взболтайте несколько раз до тех пор, пока смесь не будет полностью гомогенизируют. Избегайте образования пузырьков.
      ВАЖНО: Держите смесь на лед, чтобы предотвратить гелеобразования.
      1. Критический шаг: Если смесь развивается кислый вид (желтоватый цвет), добавьте несколько капель стерильного 1 N NaOH для нейтрализации смеси.
   3. Добавить концентрированный HUVEC и фибробластами при плотности 1,0 - 1,2 и 1,5 - 2,0 × 10 ⁶ клеток / мл, соответственно , к обогащенной смеси коллагена (описанного выше). Закройте пробирки и взболтайте несколько раз, пока смесь не будет полностью гомогенизируют. Избегайте образования пузырьков. ВАЖНО: Держите смесь на лед, чтобы предотвратить гелеобразования.
   4. Добавить 4 - 5 мл клеточной содержащих коллагенгель для каждой вставки, предварительно загружаются в 6 луночного планшета, и позволили gelify в капот практически без движения в течение 1 часа.
   5. Через 1 ч передать 6-луночный планшет с 37 ° C, 5% CO ₂ инкубаторе в течение 1 - 2 дополнительных часов.
   6. Вернуть 6-луночного планшета к капоту, и с помощью стерильного пинцета и скальпель асептических отсечение мембрану из вставки отсоединение клеток, содержащих гель из мембраны. Обрежьте отдельностоящий гель на небольшие квадраты (~ 5 х 5 мм).
   7. Добавьте небольшие клетки, содержащие квадраты в 50-мл HARV с использованием порта заполнения.
4. Приготовьте суспензию HCT 8-эпителиальных клеток:
   1. Вымойте колбы дважды в PBS и открепления клеток с помощью трипсина, 0,25% (1x) с обработкой трипсин-ЭДТА. Добавьте достаточное количество раствора трипсина, чтобы покрыть полноту площади поверхности клеточной культуры. Отрыв обычно происходит в течение от 10 до 15 мин.
   2. Собирают обособленные клетки в 30 мл DMEM-30% FBS среды.
   3. ЦентробежнаяУГЭ DMEM-30% FBS среду, содержащую трубку при 500g в течение 10 мин.
   4. Ресуспендируют клеток в 30 мл DMEM-30% FBS среды.
   5. Подсчитать общее количество жизнеспособных клеток, как описано в 3.2.5.
   6. Ресуспендируют НСТ-8 эпителиальных клеток в среде DMEM-30% FBS среде при концентрации 10 ⁷ клеток мл ^{- 1.}
   7. Добавить 1 мл концентрированного НСТ-8 эпителиальных клеток в 50-мл HARV с использованием порта заливки.
5. Используя порт заливки, добавить дополнительную питательную среду 3-D до тех пор, пока судно почти полностью заполнен (~ 20 мл).
6. Замените крышку и протрите губы заполняющего порта с 70% -ным этанолом.
7. Поместите шприц в каждом шприцевой порту RWV: место в 5 мл-шприц, содержащий 3 - 4 мл 3-D культуральной среды в одном порту и 5 мл шприц пустой в другом порту.
8. Удалите все видимые пузырьки, потянув в пустой шприц в то время как примерно такой же объем среды вводят через другой порт шприца.
9. Поместите весиSELS в биореакторе, включите питание и установите скорость приблизительно от 13 до 14 оборотов в минуту.
   Примечание: критический шаг: Частота вращения может потребоваться скорректировать несколько раз во время эксперимента , чтобы поддерживать клетки орбитальные внутри сосуда, тем самым избегая контакта со стенками сосуда.
10. Культуры клеток при 37 ° С, 5% СО ₂ в условиях микрогравитации, предоставляемые RWV биореактора.
11. Изменение культуральной среды через каждые 3 - 4 дня, заменяя примерно 30 мл свежего 3-D культуральной среды.
12. После 4 -х дней (± 1 день), удалить сосуды из биореактора и добавить лимфоциты / моноциты к судам (2 х 10 ⁷ / сосуд).
13. Поместите сосуды обратно в биореакторе при 37 ° С в атмосфере 5% СО ₂ в течение еще ​​5 дней (± 1 день).
14. После дополнительных 5 дней (9 -й день культуры), добавляют лимфоциты / моноциты к судам (2 х 10 ⁷ / сосуд) и по- прежнему культур до 12 дополнительных дней.
15. Изменение культуральной среды через каждые 3 - 4 дня, заменяя примерно 30 мл свежего 3-D культуральной среды.

4. Заготовка 3-D Культуры для гистологии

1. С помощью пипетки урожая каждый маленький фрагмент гель, который теперь называется "строить" в шесть-луночного планшета, содержащую 10 мл 10% -ного буфера формалина. Оставьте в течение 3 ч при комнатной температуре или в течение 12 - 16 ч при температуре 4 ° С.
2. Приготовьте обработки тканей и встраивание кассеты путем маркировки и добавление двух кусков пены биопсии прокладок в каждой кассете.
3. Погружают кассеты в 10% формалине буфера.
4. С помощью пинцета поместите с фиксированной конструкции между двумя подушках из пеноматериала.
5. Погружают кассеты в 10% формалине буфера.
6. Продолжить со стандартными процедурами для встраивания, секционирования и окрашивания ^44.

Ранее мы разработали многоклеточного 3-D модели органотипической слизистой оболочки кишечника человека состоит из кишечной эпителиальной клеточной линии и первичных человеческих лимфоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов , культивируемых в условиях микрогравитации ²⁴ (рисунок 1). Фибробласты и эндотелиальные клетки были встроены в коллагена I матрице , обогащенной дополнительным кишка базальной мембраной белков ⁴⁵ (то есть., Ламинин, коллаген IV, фибронектина и гепаринсульфат протеогликановых) и добавляют к RWV биореакторы. Через 10 - 15 дней, гистологический анализ окрашивания показал наличие ворсинок-подобных структур в конструкциях. Примерно 60 - 80% этих эпителиальных клеток были организованы в виде монослоя поляризованных клеток с их ядер , расположенных в базисной позиции вблизи ECM, который является одной из главных особенностей хорошо дифференцированных клеток (рисунок 2).

Рисунок 2: Сравнение между нормальными человеческими кишечником и Органотипической моделей. Гематоксилином и эозином клеток, культивируемых в модели микрогравитации 3-D: ткани окрашивали фиолетовый и подмости пятнами розового цвета. Клетки из модели 3-D культивировали в течение 14 ( "A" и "B") и 20 дней (с). Через двадцать дней после посева, общее число клеток сохраняются, и клетки были хорошо дифференцированные, демонстрирующая ворсин подобные функции. Изображения отображаются на 100х ( "A" и "B") и 40X ( "с") увеличения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1: Определяется средний Дополнение Подготовка.

Таблица 2: Получение 3-D медиакультуре.

В этой рукописи мы опишем развитие биоинженерного модели слизистой оболочки кишечника человека , состоящего из типов клеток , включая кратные первичных человеческих лимфоцитов, фибробластов и эндотелиальных клеток, а также эпителиальным клеткам кишечника линии ^24. В этом 3-D модели, клетки культивируют в коллагеновой богатых внеклеточного матрикса в условиях микрогравитации ^24.

Как было описано выше, основные особенности этой модели являются: (I) способность имитировать эпителиальной тканевой организации монослоя (II) индукция соответствующей полярности эпителиальных клеток, плотных соединений, десмосом и микроворсинок, (III) на длительный термин культура (до 20 дней) с высокой жизнеспособности первичных клеток (то есть., фибробластов и эндотелиальных клеток), (IV) выражение в подобные ткани маркеры дифференцировки , включая виллин, цитокератином, E-кадгерина и мюCIN, (v) возможность производить значительные количества цитокинов (например, IL-8) и щелочной фосфатазы при антигенной стимуляции, (VI) перенос питательных веществ , таких как глюкоза (то есть., экспрессия дисахаридов, и присутствие сахара транспортеров) и (VII) мульти-родословная дифференцировки эпителиальных клеток кишечника (то есть., абсорбирующим энтероците, Globet и M клеток) ^24.

Важно подчеркнуть , что для достижения воспроизводимых результатов , используя нашу 3-D модель исследователь должен придерживаться хороших принципов клеточной культуры ^46-48. Крайне важно, чтобы систематически контролировать клетки для жизнеспособности, загрязнения микоплазмы и изменения в поведении роста клеток. Если проблема определена, сначала убедитесь, что никакие несанкционированные изменения не были внесены в протокол. Если проблема не решена, перейти к новой партии различных компонентов среды (в том числе в сыворотке крови) и /или клетки. Ограничением нашего 3-D модели является использование онкогенного НСТ-8 эпителиальной клеточной линии. Тем не менее, важно учитывать, что присутствие НСТ-8 линии предлагает преимущество быть коммерчески доступным. Кроме того, эти эпителиальные клетки не выражают ни классической или неклассической человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) -класс I молекулы ^49,50. Таким образом, они позволяют культуру эпителиальных клеток с РВМС различной HLA класса I гаплотипа в отсутствие эпителиального клеточного РВМС аллореактивность. Кроме того, при сравнении этой системы с системами , такими как кишка стволовой клетки органоиды ^51-53, эта модель предлагает множество преимуществ. Хотя кишка стволовых клеток органоиды содержат ценную информацию о клеточной биологии и кишечной дифференцировки ^51-53, эта модель позволяет прямое верхушечный воздействие питательных веществ, наркотиков и патогенных микроорганизмов. Эта модель также обеспечивает легкий доступ к содержимому просветными такие антимикробные пептиды и цитокины. В противоположность этому, органоиды компактны ООНего с полостной поверхности, обращенной внутрь. Следовательно, существует ограниченное количество продукта , которое может быть введено в Органоид Просвет ^54.

Мы полагаем , что многоклеточные 3-D модель Органотипической слизистой оболочки кишечника человека имеет широкие возможности в качестве инструмента для обнаружения как в здоровье и болезни, в том числе взаимодействие с патогенными микроорганизмами, незаконный оборот антигена и воспалительных и метаболических процессов ^24. Наконец, из - за многоклеточного природы нашего 3-D модели, наша модель могла бы позволить амплитудно и потери исследований с использованием типов иммунных клеток, которые могут влиять на поведение клеток эпителиального в естественных условиях.

The authors declare that a US Non-Provisional Patent Application has been filed in the U.S.Patent and Trademark Office (Number: 13/360,539).

This work was supported, in part, by NIAID, NIH, DHHS federal research grants R01 AI036525 and U19 AI082655 (CCHI) to MBS and by NIH grant DK048373 to AF. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institute of Allergy And Infectious Diseases or the National Institutes of Health.