Sviluppo di un multicellulare tridimensionale Organotipica Modello della mucosa intestinale umana coltivate in microgravità

Cellule che crescono in un ambiente tridimensionale (3-D) rappresentano un netto miglioramento rispetto coltura cellulare in ambienti 2-D (ad esempio, flaconi o piatti). Qui si descrive lo sviluppo di un modello 3-D organotipica multicellulare della mucosa intestinale umana coltivate in microgravità fornito ruotando parete dei vasi (RWV) bioreattori.

Poiché le cellule che crescono in un ambiente tridimensionale (3-D) hanno il potenziale per colmare molte lacune di coltivazione di cellule in ambienti 2-D (ad es., Flaconi o piatti). In realtà, è ampiamente riconosciuto che le cellule coltivate in fiaschi o piatti tendono a de-differenziarsi e perdere funzioni specializzate dei tessuti da cui sono stati derivati. Attualmente, ci sono principalmente due tipi di sistemi di coltura 3-D dove le cellule vengono seminate in ponteggi che mimano la matrice nativa extracellulare (ECM): modelli (b) utilizzando bioreattori (a) modelli statici e. La prima svolta è stato il modelli statici 3-D. modelli 3-D utilizzando bioreattori come la rotazione-parete del vaso (RWV) bioreattori sono uno sviluppo più recente. Il concetto originale dei bioreattori RWV è stato sviluppato al Johnson Space Center della NASA nei primi anni 1990 e si crede di superare i limiti dei modelli statici, come lo sviluppo di ipossia, nuclei necrotiche. I bioreattori RWV potrebbero aggirare °è problema fornendo fluidodinamica che permettono la diffusione efficiente di nutrienti e ossigeno. Questi bioreattori sono costituiti da una base dei rotatori che serve a sostenere e ruotare due diversi formati di recipienti di coltura che si differenziano per il loro tipo di fonte di aerazione: (1) di tornitura lenti Vessels laterale (STLVs) con un ossigenatore coassiale al centro, o (2 ) Le navi ad alta Aspect Ratio (HARVs) con l'ossigenazione tramite un appartamento, membrana di trasferimento di gas in gomma siliconica. Questi vasi consentono il trasferimento del gas efficiente, evitando la formazione di bolle e la conseguente turbolenza. Queste condizioni determinano flusso laminare e forza di taglio minimo che i modelli di gravità ridotta (microgravità) all'interno del recipiente di coltura. Qui si descrive lo sviluppo di un modello 3-D organotipica multicellulare della mucosa intestinale umana composta di una linea intestinale cellule epiteliali e linfociti umani primari, cellule endoteliali e fibroblasti coltivati ​​in microgravità fornito dal bioreattore RWV. </ P>

Il primo passo avanti nella costruzione di un modello 3-D è stata riportata nei primi anni del 1980, quando gli scienziati hanno iniziato a studiare i diversi tipi di ponteggio (ad es., Laminina, collagene di tipo I, collagene IV, e fibronectina) e cocktail di fattori di crescita per migliorare cellula-cellula e le interazioni ECM di modelli 3-D "statiche" ^1-7. Da allora, il problema principale con questi modelli ha limitazioni nel trasferimento dei nutrienti e ossigeno all'interno del mezzo e del tessuto costrutti ^8. In contrasto con le cellule per l'ambiente in vivo che riceve un flusso costante di nutrienti e ossigeno dalle reti di vasi sanguigni circostanti, la staticità di questi modelli ostacola la distribuzione effettiva di loro alle cellule. Ad esempio, aggregati di cellule generate in modelli statici in vitro che superano un paio di millimetri invariabilmente sviluppare ipossia, core necrotico ^9. I bioreattori RWV potrebbero aggirare questo problemafornendo fluidodinamica che permettono la diffusione efficiente di nutrienti e ossigeno ^10-12. Tuttavia, ad oggi, il lavoro utilizzando bioreattori RWV è stato limitato alla iscrizione di uno o due tipi di cellule ^13-17. Inoltre, invece di un orientamento spaziale simile a tessuti nativi, quelle cellule formano aggregati cellulari. Il motivo principale di queste limitazioni è stata la mancanza di un ponteggio in grado di incorporare le cellule in modo integrato. I ponteggi utilizzati nei bioreattori RWV fino ad oggi sono costituiti, con poche eccezioni ^16-18, principalmente di microsfere sintetiche, cilindri tubolari o piccoli fogli ^13-15,19-23. Questi sono materiali rigidi cui composizione e flessibilità non possono essere manipolati, e che le cellule sono attaccate alla loro superficie. Pertanto, è improbabile che questi modelli fornirà un sistema in cui valutare, in modo integrato, i vari componenti cellulari come cellule stromali (ad es., Fibroblasti, cellule immunitarie e endoteliali) che should essere disperso all'interno del patibolo per imitare da vicino il tessuto umano.

Qui si descrive lo sviluppo di un modello 3-D organotipica multicellulare della mucosa intestinale umana composta di una linea intestinale cellule epiteliali e linfociti umani primari, cellule endoteliali e fibroblasti ^24. Queste cellule sono state coltivate in microgravità fornire da parte del RWV bioreattore ^13,25-30. Nel nostro modello 3-D, il ECM possiede molte proprietà distinte, come un'osmolalità simile al mezzo di coltura (per es., Trascurabili limitazioni diffusionali durante cultura) e la capacità di incorporare cellule e altre proteine ​​della matrice extracellulare pertinenti, nonché la adeguata rigidità da utilizzare in bioreattori ^24. I sistemi biologici sono molto complessi, e nel corso degli ultimi anni, c'è stato un cambiamento nel centro di ricerca della mucosa verso l'esame delle interazioni cellulari con l'ambiente circostante, piuttosto che studiare in isolation. In particolare, l'importanza delle interazioni cellula-cellula nell'influenzare sopravvivenza cellulare intestinale e differenziazione è ben documentato ^31-34. In particolare, la comunicazione tra le cellule epiteliali e la loro nicchia ha una profonda influenza sulla espansione delle cellule epiteliali e la differenziazione ^35. Infatti, è ampiamente riconosciuto che non solo cellula-cellula, ma anche cellula-ECM interazioni sono fondamentali per il mantenimento e la differenziazione delle cellule epiteliali in modelli di coltura 3-D. Studi precedenti hanno dimostrato che le proteine ​​nell'intestino ECM come il collagene I ^24,36,37, laminina ³⁸ e fibronectina ³⁹ sono strumentali per influenzare le cellule epiteliali intestinali di acquisire orientamento spaziale simile alla mucosa nativo. Pertanto, lo sviluppo di nuove tecnologie, come il nostro modello 3-D ^24, che può imitare è necessaria la diversità fenotipica dell'intestino se i ricercatori intendono ricreare la complessa architettura cellulare e strutturalee funzione del microambiente intestinale. Questi modelli rappresentano uno strumento importante per lo sviluppo e la valutazione di nuovi farmaci per via orale e vaccini candidati.

Dichiarazione etica: Tutti i campioni di sangue sono stati prelevati da volontari che hanno partecipato in numero di protocollo HP-00.040.025-1. L'Università del Maryland Institutional Review Board ha approvato questo protocollo e ha autorizzato la raccolta di campioni di sangue di volontari sani per gli studi inclusi in questo manoscritto. Lo scopo di questo studio è stato spiegato ai volontari, e tutti i volontari ha dato informato, firmato il consenso prima del prelievo di sangue.

Nota: Vedere la Tabella 1 per la preparazione supplemento di media. Vedere la Tabella 2 per la preparazione di terreni di coltura 3-D.

1. Preparazione delle navi Cultura

1. Svitare il tappo della porta di riempimento del ml vasi 50 e riempire con 50 ml di terreno di coltura sterile (ad es., RPMI). Eseguire tutte le operazioni in condizioni sterili in una cappa laminare.
2. Riposizionare il tappo e pulire qualsiasi mezzo versato su qualsiasi superficie con il 70% di etanolo.
3. Permettere alla nave di incubmangiato per almeno 15 minuti per O / N a temperatura ambiente.
4. Utilizzare la porta di riempimento di scartare il terreno di coltura e aggiungere 30 ml di terreno di coltura 3-D.
5. Pulire qualsiasi mezzo versato su qualsiasi superficie con il 70% di etanolo.

2. Preparazione delle cellule

1. Umano linea di cellule epiteliali (HCT-8) ^24,40.
   1. cellule di coltura in RPMI integrato con 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina, 50 mg / ml gentamicina, 2 mM L-glutammina, 1 mM piruvato di sodio, 10 mM tampone HEPES e siero fetale bovino inattivato al calore del 10% (FBS ) (supplemento 1). Al 70% di confluenza, dividere le celle in un rapporto di 1: 5.
2. Fibroblasti umani (cellule del colon CCD-18Co) ^24,41.
   1. Cellule di coltura in terreno di basale Aquila arricchita con supplemento 1 alla confluenza, dividere le celle in un rapporto di 1: 3..
3. Ombelicale umana Vena cellule endoteliali (HUVEC) 24,42.
   1. Cellule di coltura in endoteliale basale medio (EBM) di media arricchiti con 100 mg / ml di eparina, 3 mg / ml Endothelial Growth Supplement cellulare (ECGS), e supplemento 1 al 70% confluenza, dividere le celle in un rapporto di 1:. 2.
4. Linfociti / monociti
   1. Isolare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dal sangue mediante centrifugazione in gradiente di densità utilizzando tecniche standard ^43.
      1. Brevemente, utilizzando un ml-pipetta 10, aggiungere con cautela 30 ml di sangue diluito (1: 1 sangue: tampone fosfato (PBS)) in una provetta da 50 ml conica contenente 10 ml di mezzi densità centrifugazione. Dopo la fase di centrifugazione, linfociti e monociti risiederanno nello strato di "bianco" tra i media densità centrifugazione e strati di plasma.
      2. Raccogliere lo strato bianco con una pipetta di trasferimento. Evitare la contaminazione dei granulociti, limitando la raccolta dei media densità centrifugazione. Dopo il lavaggio ^43, use PBMC come è o crioconservati in liquido N _2.
         Nota: È importante sottolineare che PBMC consiste principalmente di linfociti e monociti, con una piccola percentuale di cellule dendritiche e altri tipi di cellule.
5. Grow tutte le cellule in condizioni di coltura standard a 37 ° C in atmosfera al 5% di CO _2.

3. Preparazione di cellule collagene-embedded

1. Determinare il numero di inserti necessario in base al numero di condizioni sperimentali da set-up. Posizionare il numero appropriato di inserti nei pozzetti di un 6-pozzetti.
2. Preparare una sospensione di HUVEC e fibroblasti:
   1. Lavare i palloni due volte in PBS e staccare le cellule con tripsina, 0,25% (1x) con 0,05% tripsina-tetrasodico etilendiamminatetraacetato (tripsina-EDTA). Aggiungere la soluzione tripsina sufficiente a coprire la totalità della superficie di coltura cellulare. Il distacco di solito avviene entro 5 a 15 min
   2. Collezionarecellule indipendente in un 50 ml tubo contenente 30 ml di terreno Dulbecco Modified Eagle (DMEM) -30% FBS media.
   3. Centrifugare la provetta a 500 xg per 10 min.
   4. Risospendere le cellule in 30 ml di DMEM-30% FBS media.
   5. Contare il numero totale di cellule vitali diluendo 20 ml di cellule risospese con 20 ml di Trypan colorante blu. Caricare il emocitometro con la miscela di cellule. PBMC vitali saranno bianchi chiari; non vitale PBMC acquisirà il colorante e diventare blu.
      1. Risospendere ogni tipo di cellula in DMEM-30% FBS mezzo ad una concentrazione di 5 - 8 x 10 ⁷ cellule ml ^{- 1.}
3. Preparare gel di collagene di cellule contenenti
   Nota: Ogni nave richiede la preparazione di ~ 5 ml di gel di collagene di cellule contenenti.
   1. In una provetta da 50 ml conica preparare la miscela di collagene aggiungendo 1 media x DMEM, addizionato con 50 pg / ml gentamicina, 2 mM L-glutammina e 10% calore inactivated FBS più 3 mg / ml bovina collagene-I, 10 ug / laminina ml, 40 mg / ml di collagene IV, 10 ug / ml di fibronectina, 2 mg / ml di eparina solfato proteoglicani e 15 mM NaOH (per raggiungere il pH fisiologico).
   2. Chiudere la provetta e mescolare capovolgendo più volte fino a quando il composto è completamente omogeneizzato. Evitare la formazione di bolle.
      IMPORTANTE: mantenere la miscela in ghiaccio per prevenire gelificazione.
      1. Passaggio fondamentale: Se la miscela sviluppa un aspetto acida (colore giallastro), aggiungere qualche goccia di sterile 1 N NaOH per neutralizzare la miscela.
   3. Aggiungere HUVEC concentrato e fibroblasti ad una densità di 1,0 - 1,2 e 1,5 - 2,0 x 10 ⁶ cellule / ml, rispettivamente, alla miscela arricchita-collagene (sopra descritto). Chiudere le provette e mescolare capovolgendo più volte fino a quando il composto è completamente omogeneizzato. Evitare la formazione di bolle. IMPORTANTE: mantenere la miscela in ghiaccio per prevenire gelificazione.
   4. Aggiungere 4 - 5 ml di collagene di cellule contenentigel per ogni inserto, precedentemente caricato in un 6 a micropiastre, e lasciata gelify nella cappa con poco o nessun movimento per 1 ora.
   5. Dopo 1 ora, trasferire il 6 pozzetti a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore per 1 - 2 ore supplementari.
   6. Riportare la piastra da 6 pozzetti alla cappa, e con l'aiuto di una pinza sterile e bisturi asetticamente cut-off la membrana dall'inserto staccare il gel cella contenente dalla membrana. Tagliare il gel indipendente in piccoli quadrati (~ 5 x 5 mm).
   7. Aggiungere le piccole piazze di cellule contenenti in un HARV da 50 ml utilizzando la porta di riempimento.
4. Preparare una sospensione di HCT-8 cellule epiteliali:
   1. Lavare i palloni due volte in PBS e staccare le cellule con tripsina, 0,25% (1x) con il trattamento tripsina-EDTA. Aggiungere la soluzione tripsina sufficiente a coprire la totalità della superficie di coltura cellulare. Il distacco di solito si verifica entro 10 o 15 minuti.
   2. Raccogliere le cellule staccate in 30 ml di DMEM-30% di media FBS.
   3. centrifuge DMEM-30% di media FBS contenente tubo a 500 xg per 10 min.
   4. Risospendere le cellule in 30 ml di DMEM-30% FBS media.
   5. Contare il numero totale di cellule vitali come descritto in 3.2.5.
   6. Risospendere le cellule epiteliali HCT-8 in DMEM-30% FBS mezzo ad una concentrazione di 10 ⁷ cellule ml ^{- 1.}
   7. Aggiungere 1 ml di concentrato HCT-8 cellule epiteliali in 50 ml HARV utilizzando la porta di riempimento.
5. Utilizzando la porta di riempimento, aggiungere ulteriori terreno di coltura in 3-D fino a quando la nave è quasi pieno (~ 20 ml).
6. Riposizionare il tappo e pulire il bordo della porta di riempimento con il 70% di etanolo.
7. Inserire una siringa in ogni porto siringa del RWV: posto a 5 ml-siringa contenente 3 - 4 ml di terreno di coltura 3-D in una porta e una siringa da 5 ml vuota sull'altra porta.
8. Rimuovere eventuali bolle visibili tirando nella siringa vuota mentre circa lo stesso volume di terreno viene iniettato attraverso l'altra porta siringa.
9. Posizionare le vessels nel bioreattore, accendere l'alimentazione e impostare la velocità a circa 13 a 14 giri al minuto.
   Nota: passaggio fondamentale: velocità di rotazione può essere necessario regolare un paio di volte nel corso di un esperimento per mantenere le cellule in orbita all'interno della nave, evitando in tal modo il contatto con le pareti dei vasi.
10. Cellule di coltura a 37 ° C, 5% CO ₂ sotto microgravità, forniti dal bioreattore RWV.
11. Cambiare la cultura media ogni 3 - 4 giorni, sostituendo circa 30 ml con terreno di coltura 3-D fresco.
12. Dopo 4 giorni (± 1 giorno), rimuovere le navi dal bioreattore e aggiungere linfociti / monociti ai vasi (2 x 10 ⁷ / nave).
13. Posizionare i vasi nel bioreattore a 37 ° C, 5% CO ₂ per altri 5 giorni (± 1 giorno).
14. Dopo i supplementari di 5 giorni (giorno 9 della cultura), aggiungere linfociti / monociti ai vasi (2 x 10 ⁷ / nave) e continuare le culture per un massimo di 12 giorni aggiuntivi.
15. Cambiare la cultura media ogni 3 - 4 giorni, sostituendo circa 30 ml con terreno di coltura 3-D fresco.

4. raccolta 3-D Culture per Istologia

1. Con l'aiuto di un raccolto trasferimento pipetta ogni piccolo frammento gel, ora chiamato "costruire", in una piastra di sei pozzetti contenenti 10 ml di tampone di formalina al 10%. Lasciare riposare per 3 ore a temperatura ambiente o per 12 - 16 ore a 4 ° C.
2. Preparare la lavorazione dei tessuti e cassette incorporazione mediante l'etichettatura e l'aggiunta di due pezzi di cuscinetti in schiuma biopsia in ogni cassetta.
3. Immergere le cassette a 10% buffer di formalina.
4. Con l'aiuto di pinze posizionare i costrutti fissi tra le due spugne.
5. Immergere le cassette a 10% buffer di formalina.
6. Procedere con procedure standard per l'incorporamento, sezionamento, e colorazione ^44.

Precedentemente abbiamo progettato un modello 3-D organotipica multicellulare della mucosa intestinale umana comprendente una linea intestinale cellule epiteliali e linfociti umani primari, cellule endoteliali e fibroblasti coltivati ​​in condizioni di microgravità ²⁴ (Figura 1). Fibroblasti e cellule endoteliali sono stati incorporati in una matrice di collagene I arricchito con proteine ​​di membrana aggiuntiva intestino seminterrato ⁴⁵ (es., Laminina, collagene IV, fibronectina e eparina solfato proteoglicani) e aggiunti al RWV bioreattori. Dopo 10 - 15 giorni, analisi colorazione istologica ha dimostrato la presenza di strutture villi-simili nei costrutti. Circa 60 - 80% di queste cellule epiteliali sono stati organizzati come un monostrato di cellule polarizzate con i loro nuclei situati in una posizione vicino al basale ECM, che è una caratteristica importante di cellule ben differenziati (Figura 2).

Figura 2: confronto tra la normale Intestino umano ei modelli organotipiche. Colorazione ematossilina-eosina delle cellule in coltura nel modello di microgravità 3-D: tessuti erano macchiati viola e impalcatura macchiati rosa. Le cellule del modello 3-D sono state coltivate per 14 ( "a" e "b") e 20 giorni (c). Venti giorni dopo la semina, il numero di cellule totale sono mantenuti, e le cellule erano caratteristiche dei villi-come mostrare ben differenziati. Le immagini vengono visualizzate a 100X ( "a" e "b") e 40X ( "C") di ingrandimento. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Definito Supplemento Media Preparazione.

Tabella 2: Preparazione di 3-D di coltura.

In questo manoscritto, descriviamo lo sviluppo di un modello bioengineered della mucosa intestinale umana composto di tipi cellulari multipli inclusi linfociti primari umani, fibroblasti e cellule endoteliali, così come le linee di cellule epiteliali intestinali ^24. In questo modello 3-D, le cellule sono coltivate all'interno di una matrice extracellulare ricca di collagene in condizioni di microgravità ^24.

Come descritto in precedenza, le caratteristiche principali di questo modello sono: (i) la capacità di imitare l'organizzazione tessuto monostrato epiteliale, (ii) l'induzione di appropriata polarità delle cellule epiteliali, giunzioni strette, desmosomi e microvilli, (iii) un lungo cultura termine (fino a 20 giorni) con elevata vitalità delle cellule primarie (es., fibroblasti e cellule endoteliali), (iv) l'espressione dei marcatori di differenziazione dei tessuti simili, ad esempio villin, citocheratina, e-caderina e mucin, (v) la capacità di produrre notevoli quantità di citochine (ad es., IL-8) e fosfatasi alcalina dopo stimolazione antigenica, (vi) il trasporto di nutrienti quali glucosio (es., espressione di disaccaridasi e presenza di zucchero trasportatori), e (vii) la differenziazione multi-lignaggio di cellule epiteliali intestinali (es., enterociti di assorbimento, Globet e cellule M) ^24.

E 'importante sottolineare che per ottenere risultati riproducibili usando il nostro modello 3-D il ricercatore deve aderire alle linee guida di buona coltura cellulare ^46-48. E 'fondamentale per controllare sistematicamente le cellule per la vitalità, la contaminazione da micoplasma e cambiamenti nel comportamento crescita cellulare. Se viene individuato un problema, in primo luogo garantire che nessun modifiche non autorizzate sono state introdotte al protocollo. Se il problema persiste, passare a un nuovo lotto di vari componenti supporto (inclusa siero) e /o cellule. Una limitazione del nostro modello 3-D è l'uso di tumorigenico HCT-8 linea cellulare epiteliale. Tuttavia, è importante considerare che la presenza della linea HCT-8 offre il vantaggio di essere disponibile in commercio. Inoltre, queste cellule epiteliali non esprimono l'antigene leucocitario umano sia classico o non classica (HLA) di classe I le molecole ^49,50. Pertanto, esse consentono la coltura di cellule epiteliali con PBMC di diversi HLA di classe I aplotipi in assenza di epiteliale alloreattività cellule PBMC. Inoltre, quando si confrontano questo sistema con sistemi come cellula staminale intestinale organoidi ^51-53, questo modello offre molti vantaggi. Anche se organoidi cellule staminali dell'intestino forniscono preziose informazioni sulla biologia cellulare e la differenziazione intestinale ^51-53, questo modello permette l'esposizione diretta apicale ai nutrienti, farmaci e agenti patogeni. Questo modello fornisce anche un facile accesso ai contenuti del lume tali peptidi e citochine anti-microbiche. Al contrario, sono organoidi Compact delle Nazioni Uniteit con una superficie luminale rivolta verso l'interno. Di conseguenza, vi è una quantità limitata di prodotto che può essere introdotto nella organoide lumen ^54.

Crediamo che la nostra multicellulare 3-D del modello organotipica della mucosa intestinale umana ha il potenziale di ampio respiro come strumento per la scoperta sia in salute e malattia, compresa l'interazione con agenti patogeni, il traffico di antigene, e infiammatorie ed elabora ²⁴ metabolica. Infine, a causa della natura multicellulare del nostro modello 3-D, il nostro modello potrebbe consentire GAIN- e perdite di studio utilizzando i tipi di cellule del sistema immunitario che possono influenzare il comportamento delle cellule epiteliali in vivo.

The authors declare that a US Non-Provisional Patent Application has been filed in the U.S.Patent and Trademark Office (Number: 13/360,539).

This work was supported, in part, by NIAID, NIH, DHHS federal research grants R01 AI036525 and U19 AI082655 (CCHI) to MBS and by NIH grant DK048373 to AF. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institute of Allergy And Infectious Diseases or the National Institutes of Health.