Изучение надмолекулярной организации фотосинтетических мембранах внутри Фриз-трещиноватых тканях листа с помощью крио-сканирующей электронной микроскопии

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

Крио-сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) замораживанием образцы, разрушенные позволяет исследовать биологические структуры на близких нативных условиях. Здесь мы опишем метод для изучения надмолекулярной организации фотосинтезирующих (тилакоидов) мембран внутри образцов листьев. Это достигается за счет замораживания высокого давления тканей листьев, сублимационной разрыва пласта, двухслойного покрытия и, наконец, крио-SEM визуализации. Применение метода покрытия двойного слоя позволяет приобретать большое увеличение (>) 100000 изображений с минимальным повреждением пучка к замороженным увлажненной образцов, а также минимальным воздействием зарядки. С помощью описанных процедур , мы исследовали изменения в распределении супрамолекулярного фотосистемы и светособирающей антенны белковых комплексов , которые имеют место в процессе обезвоживания Воскрешение растений Craterostigma pumilum, на месте.

Кислородный фотосинтез, происходящих в древней цианобактерии, был унаследован водорослей и наземных растений эндосимбиотических событий, которые привели к развитию хлоропластов органелл. Во всех современных кислородных фототрофов, фотосинтетический перенос электронов и генерация протон-движущей силы и уменьшение мощности осуществляется в пределах уплощенными мешка типа везикул, называемых '' тилакоидов мембраны. Эти мембраны разместятся белковые комплексы, которые выполняют легкие управляемые реакции фотосинтеза и обеспечивают среду для энергетической трансдукции. Тилакоидную мембраны растений и (некоторые) водоросли дифференцируются на два различных морфологических доменов: плотно прижатыми мембранные области , называемые "грана" и штабеля мембраны , которые связывают Грана, называемые 'стромы ламели' ^1. Различные исследования сублимационной разрушения растений и водорослей тилакоидного мембран проводились, начиная с начала 1970-х. При замораживанием ломаются, мембраныраскалывается по их гидрофобной сердцевины ^2, генерируя exoplasmic лица (EF) и протоплазматическим лица (ПФ), в зависимости от клеточного отсека , который Половинки мембраны границы, как это первоначально придуман Брэнтон и соавт. . в 1975 году ³ растений и водорослей тилакоиды имеют четыре различных поверхностей разрыва: Efs, EFU, ФД и ОРП, с 'S' и 'U' , обозначающих "уложенных" и "разобран" мембранных областей соответственно. Белковые комплексы мембран, которые не расщепленная или сломанные, имеют тенденцию оставаться с или Е или Р стороне мембраны. Первоначальные наблюдения , что разные грани перелома тилакоидами содержат частицы различных размеров и плотности ⁴ и многочисленные исследования , которые следовали, привели к идентификации и корреляции между наблюдаемыми частицами и мембранных белковых комплексов , которые осуществляют легкие реакции ^5-13 (см также обзоры ^14,15).

FreЭз-Перелом опыты тилакоидного мембран , как правило , проводят на препаратах хлоропластов или изолированных мембранах тилакоидов (но смотри ^16,17), на риск каких - либо изменений в структурной и / или надмолекулярной организации , которые могут возникнуть во время процедуры изоляции. После перелома, точные копии получают путем выпаривания платины / углерода (Pt / C), затем толстым слоем углерода (C), и , наконец , переваривание биологического материала ^18. Реплики визуализируются с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Традиционная технология сублимационной перелом-реплики продолжает служить в качестве важного инструмента для изучения надмолекулярной организации фотосинтетических мембран и их адаптацию к различным, например., Свет, условия ^19-23.

В нашем недавнем исследовании homoiochlorophyllous Воскрешение растений Craterostigma pumilum ^24, мы стремились исследовать изменения в надмолекулярной организации OF тилакоидов мембраны, а также в целом клеточной организации, в процессе обезвоживания и регидратации. Уникальность homoiochlorophyllous видов воскресения в том, что они способны выжить условия высыханию в своих вегетативных тканях (листья), сохраняя при этом их фотосинтетического аппарата. После того, как вода доступна, эти растения восстановить и возобновить фотосинтетическую активность в течение нескольких часов до нескольких дней ^25. Для этого исследования, крио-сканирование ЭМ (СЭМ) визуализация сублимационной сломана образцов листьев, сочеталось с замораживанием под высоким давлением для образца крио-иммобилизации. Эти процедуры обеспечивают средства для визуализации замороженных гидратированных биологических образцов в состоянии , близком к их родному государству ^26. Один Основное преимущество состоит в том, что образцы исследуют непосредственно после сублимационной перелома и покрытия без каких-либо последовательных шагов. Это особенно актуально для исследования растений при различных относительного содержания воды (RWC), так как их состояние гидратации поддерживается в процессе подготовки. Каккогда-либо, один критический недостаток состоит в том, что замороженные гидратированных образцы могут пострадать от повреждения луча во время формирования изображения, особенно при сканировании при больших увеличениях, необходимых для точного измерения размера фотосинтетических комплексов. Чтобы преодолеть это, метод , называемый "двойной слой покрытия '(DLC) ^27,28 в сочетании с использовались специфические условия формирования изображения крио-SEM. Они привели в образцах, которые значительно меньше света чувствительных и позволила выяснении ценную информацию о фотосинтетической белка надмолекулярной организации и других клеточных компонентов Воскрешение растений C. pumilum при высоких увеличениях на месте.

1. Крио-фиксация листьев ТКАНЕЙ при замораживании высокого давления

Примечание: В данном разделе описывается, как проводить замораживание высокого давления тканей листьев для эксперимента сублимационной перелома. По соображениям , связанным с образцами растений см ^29. Это может быть адаптирована для других типов тканей или образцов с некоторыми изменениями.

1. Используя угол лезвия бритвы, царапают дно 0,1 мм полость алюминиевой пластинки 0,1 / 0,2 мм (рисунок 1). Приготовьте по меньшей мере десяток тромбоциты (6 образцов). Примите соответствующие меры предосторожности, чтобы не создать следы ножей на окружности диска.
   1. После того, как царапины, мыть диски в абсолютном этаноле, дайте им высохнуть и храните его в чистом блюде.
2. Подготовить машину замораживания высокого давления в соответствии с инструкциями изготовителя. Заполните камеру спирта морозильной машины под высоким давлением с изопропилового спирта.
3. Приготовьте самодельную вакуумнепроницаемую помощь infiltratioп устройство заменить газ, найденный в ткани листьев с жидкостью.
   1. Плотно соединить 200 мкл кончиком пипетки к концу 10 мл шприца. Отрезанные ~ 1 см кончика. Сделайте отверстие в крышке трубки микроцентрифужных 1,5 мл до плотно прилегать кончик вырезать. Вакуум может быть создана внутри трубки, потянув за поршень шприца.
4. Вырезать небольшой кусочек листа от растения, используя лезвие бритвы и с помощью пинцета поместите лист внутри микроцентрифужных трубки, наполовину заполненной 1-гексадецена. Проникнуть межклеточные пространства листа с жидкостью, осторожно потянув поршень для создания вакуума, удерживайте в течение примерно 30 секунд, а затем медленно отпустите поршень.
5. Удалите кусок листа из трубки с помощью пинцета. Обрежьте лист с бритвенным лезвием в случае его толщина более 0,2 мм и вырезать небольшой кусок, который будет вписываться в тромбоцитов.
6. Поместите чистую пластинкам с поцарапанной стороной вверх в держатель морозильной машины, а затем поместить отрезанный кусок леаф в тромбоцитов. Заполните оставшееся пространство вокруг листа с 1-гексадецена. Закройте бутерброд с использованием другого количества тромбоцитов, с царапинами, с которыми сталкивается лист.
7. Закройте и затяните держатель и вставить его в камеру машины. Затем нажмите кнопку "Jet" заморозить (~ 2,100 бары для 300 - 500 мс), и быстро перевести держатель в жидкий азот. Осторожно удалите замерзший бутерброд из держателя с использованием предварительно охлажденного пинцета, следя за тем, чтобы не раздробить бутерброд.
   Примечание: Закрытые замороженные бутерброды могут быть замораживанием сломана немедленно или хранятся в жидком азоте для последующего использования. Используйте защитную одежду и очки при работе с жидким азотом.

2. Замораживание-трещины и двухслойные покрытия ^27,28

1. Подготовить машину разрушения замораживанием для использования, в том числе и пушки для испарения платины / углерода (Pt / C) и углерода, в соответствии с инструкциями изготовителя. Поместите пистолет Pt / C на 45 градусов рисуетсяй углерод пушки под углом 90 градусов.
   1. Предварительная программа схема покрытие из 2-нм слой Pt / C (скорость покрытия 0,02 - 0,04 нм / с) и 6 нм слоем углерода (при ~ 0,1 нм / с).
      1. Введите установку на экране аппарата сублимационной перелома в. Выберите номер пользователя, где будет сохранена схема покрытия.
      2. Выберите Pt / C для 'Layer 1'. Выберите временные рамки, например., 5 мин (превысить необходимое время , необходимое для завершения покрытия). При помощи кнопок вверх-вниз стрелки, чтобы определить толщину 2 нм.
      3. Нажмите кнопку "Layer", чтобы перейти к Layer 2. Повторите шаг 2.1.1.2, за исключением выбора углерода и определяют толщину 6 нм.
   2. Проверить и отрегулировать работу пистолета.
      1. Выберите "Layer 1". Выберите Pt / C пистолет, нажав на кнопку 'GUN1' и нажмите кнопку 'ON' на блоке управления Испарение машины сублимационной перелома. Монитор скорости испарения и настроить его с помощью регуляторов напряжения и выбросов ЕНТIL достигая скорости 0,02 - 0,04 нм / с. Нажмите 'OFF', чтобы выключить пистолет Pt / C.
      2. Выбрать 'Layer 2'. Повторите 2.1.2.1, за исключением того, выберите 'GUN2' и настроить для скорости испарения ~ 0,1 нм / с.
2. Охлаждают этап системы разрушения замерзнуть до -140 ° С или -160 ° С (для гидратированных или обезвоженных листьев, соответственно). Прикрепите шаттл передачи вакуума крио к машине и заполнить ее камеру с жидким азотом. Давление в охлажденной камере сублимационной разрушения, как правило , между 1 - 8 х 10 ^-7 мбар.
3. Вставьте держатель образца сублимационной разрыва пласта (подходит для 3-мм тромбоцитов) в погрузочной станции. Наводнение камеру погрузочной станции с жидким азотом.
4. Загрузите два замороженных бутерброды на держатель один за другим с помощью пинцета класса с высокой точностью. Заверните первый сэндвич в держатель, а затем переверните держатель, чтобы проверить, что он надежно крепится на месте. Повторите эти действия для второй бутерброд.
5. Detach охлажденный трансфер из машины разрушения замораживанием и подключить его к погрузочной станции. Откройте челночный клапан, ввести втягивания руку в держатель и зафиксировать его на место. Повторно ввести руку с держателем в челноке и закройте челночный клапан с помощью ручки загрузочной станции. Прикрепите шаттл к машине сублимационной разрушения и ввести держатель в камеру с втягивания руку. Отделите трансфер из машины.
6. Совместите сублимационной перелом микротомных нож на высоту таким образом, что она будет скостить верхние пластинками бутербродов.
7. С помощью микротома нож быстро разбивают бутерброды, а затем сразу же поднять его, чтобы предотвратить загрязнение образцов обломками цепляния к ножу, и поверните охлажденный затвор над вновь обрабатываемые плоскости, чтобы оградить образцы от возможного загрязнения молекулами воды в камера.
8. Coat образцы с платины и углерода.
   1. Введите 'Layer 1' на СБНReen. Включите Pt / C пушки, нажав на кнопку 'GUN1', а затем кнопку "ON". Проверьте скорость испарения и как только он достигает 0,02 - 0,04 нм / с, одновременно выставить образцы и нажмите кнопку "Measure" для контроля толщины нанесенного слоя.
      Примечание: пистолет выключится автоматически, когда толщина достигнет предварительно выбранное значение.
   2. Накройте образцы с затвором при Pt / C испарение завершается.
   3. Нажмите кнопку "Layer", чтобы перейти к 'Layer 2'. Повторите шаги 2.8.1 и 2.8.2, за исключением выбора 'GUN2' (для углерода) и скорость испарения ~ 0,1 нм / с.
9. Подогреть этап системы разрушения замораживания до -120 ° С.

3. Cryo-сканирующей электронной микроскопии

1. Подготовка растрового электронного микроскопа для крио работы.
   1. Выберите Stage / Stage Initialise из главного меню и подтвердите выбор.
   2. Выберите Инструменты / GotO панель, и откройте панель "Airlock", выбрав его из списка. Нажмите кнопку "Закрыть колонке камеры клапана. Vent микроскопа камеру, нажав на кнопку Vent на вкладке "вакуум".
   3. Выберите Инструменты / Гото Панель и откройте "Сценическое пункты списка 'панель. Выберите позицию крио-обмена, чтобы переместить сцену к соответствующим координатам для приема держателя образца. Примечание: "крио-обмен позиции 'предварительно установлен, чтобы быть в соответствие с положением блока вакуумного переноса.
   4. Откройте образец камеры с чистой пары перчаток и вставьте крио-сцену на главной сцене микроскопа. Закройте камеру и нажмите кнопку насоса под "вкладке вакуума".
   5. Охлаждают микроскоп до -120 ° С. Заполните микроскоп Дьюара с жидким азотом. Включите функцию тепла на блоке управления крио-передачи до -120 ° С, как только температура на стадии опускается ниже -120 ° С.
2. AttACH шаттл крио-передачи в микроскоп и передать держатель образца с помощью втягивания руку на столик микроскопа крио (как в шаге 2.5). Отделить шаттл от микроскопа.
3. Нажмите на кнопку "Открыть колонке камеры клапана 'в Airlock панели.
4. Осторожно переместите держатель образца близко к линзы объектива (рабочее расстояние 1 - 2 мм) с помощью джойстика. Выберите диафрагму 10 мкм в закладке 'проемы. Дважды щелкните поле EHT на вкладке "Gun". Введите 10 (кВ) для цели EHT и нажмите кнопку OK. Нажмите на вкладку нижней EHT и выберите "EHT On".
5. Выберите 'InLens' от детекторов в раскрывающемся списке на вкладке "детекторами. Оптимизация условий формирования изображения (фокус, яркость и контрастность, выравнивание луча, астигматизм) в зависимости от обстоятельств.
6. Нажмите на вкладку "Сканирование". Выберите быстрое сканирование ( 'Скорость сканирования = 1', что соответствует времени выдержки от 100 нсек на пиксел), чтобы свести к минимуму повреждение луча, иа 'разрешение Store' 1024 х 768 пикселей. Выберите 'Line Avg "в раскрывающемся списке" Шумоподавление ". Отрегулируйте значение N 20 - 30 строк для поиска. Перемещение образца использовать функцию 'Centre Point' (нажав Control-вкладку на клавиатуре) для поиска областей с сломанных клеток и хлоропластов (Фигуры 2А и 2В).
7. Получение изображений трещиноватых хлоропластов при низких увеличениях (50 - 70 КХ) (рис 2С и 2D). Используйте функцию 'Центр' Feature (нажатием-Shift-Tab управления на клавиатуре) , чтобы увеличить в интересных граней хлоропласта трещин и получать изображения при больших увеличениях (100 - 200 кХ, 3 и 4). Используйте те же параметры, что и в шаге 3.6 для получения изображения, но изменить строку значение Avg к N> 100 для снижения уровня шума ^30.
   1. Нажмите Стоп-кадр на основном блоке управления микроскопом или на вкладке "Сканирование", чтобы остановить процесс сканирования и сохраненияизображение, нажав кнопку "Сохранить" TIFF.

Анализ 4. Изображение

Примечание: В данном разделе описывается короткая процедура для сегментации мембранных частиц от замораживанием разрушения SEM изображений с использованием открытого исходного кода пакета Фиджи ^31. Аналогичные результаты можно получить с помощью другого программного обеспечения для анализа изображений.

1. Открытое изображение с Фиджи путем перетаскивания файла изображения в главном окне программы. Преобразовать изображение в 8-бит, выбрав изображение / тип / 8-бит. Выберите изображение / Настройка / Яркость / Контраст и при необходимости отрегулировать (рисунок 5А).
2. Используя инструмент Straight Line, нарисуйте линию размер вложенного изображения шкалы бар. Выберите Анализировать / Set Scale. Введите необходимую информацию масштаба (известное расстояние и единица измерения длины) и нажмите кнопку ОК. Сохранить изображение масштабируется регулируется.
3. Выбор процесса / Фильтры / Гауссово размывание (1,5 радиуса нм) и нажмите кнопку OK (рисунок 5б).
4. Выберите изображение / Настройка / АВТо Local Threshold ( с использованием метода Niblack) и нажмите OK (рисунок 5в).
5. Выберите Edit / Инверсия а затем обработать / Binary / водораздела (рис 5D).
6. Нарисуйте рамку вокруг области интереса (ROI) с помощью инструмента выделения областей произвольной формы. Добавьте выбор менеджеру ROI, выбрав Edit / Selection / Добавить в диспетчере или нажав 'T'.
7. Выберите Edit / Clear снаружи (Рисунок 5E).
8. Выберите Анализ / Set Измерения, выберите соответствующие параметры (например, площадь, пригодный эллипсов).
9. Выберите Анализ / Анализ частиц. Введите соответствующий диапазон для размера частиц и отметьте "Показывать результаты ',' Добавить к менеджеру 'и, в случае необходимости," Исключить по краям "вариант и нажмите кнопку ОК. Результат показан на рисунке 5F.
10. Откройте сохраненный файл масштабируется изображенную (шаг 4.2). Выберите "Показать все" и снимите флажок "Ярлыки" в ROI Manager. Обзор выбранного учале укладывают на исходное изображение и вручную добавлять или удалять выбранные с помощью "Добавить" или "Удалить" кнопки на ROI Manager. Исправьте все необходимые выборы с помощью инструмента Selection и Freehand кнопку "Обновить" в ROI Manager (Рисунки 5G и 5H).
11. Анализ данных с использованием полученных измерений. В окне Результаты нажмите кнопку Результаты / Обобщить, чтобы получить, например, средняя площадь, а значит, большой и малой осей частиц, перечисленных в ROI Manager. Нажмите Результаты / Distribution, выберите параметр (например, Area) и нажмите кнопку OK, чтобы просмотреть гистограмму для этого параметра.

На рисунке 1 показана крио-SEM изображения пластинок , содержащих высокого давления заморожен, сублимационной трещиноватых Craterostigma pumilum кусочки листьев. В некоторых образцах, большие участки трещиноватых клеток получаются (Рис . 1А) В других кусок листа остается тесно связан с верхним диском и сбит вместе с ним (рис 1В). Тем не менее, даже во втором случае, некоторые из ткани листьев может оставаться присоединенным к ножу пазами на тромбоциты (рис 1B, Arrowheads) и изрядное количество данных по- прежнему могут быть собраны с помощью получения изображения листьев «остатки», при условии , что они были сломаны. После успешного разрушения найдена, изображения с низким увеличением клеток приобретаются для выявления областей интереса, в данном случае хлоропластов (рисунок 2).

Высшее коэффициент увеличения изображения тилакоидного мембран в С. pumilum листья показаны на рисунках 3 и 4. Четыре различных поверхности разрыва, ЭФ, EFU, КХ и ОРП, можно выделить (рисунок 3). Фотосистемы II (ФС II), который является самым крупным белковый комплекс находится в мембранах, находится в обоих ЭФ (Грана) и EFU (стромы ламелей). В гидратированных условиях PSII плотности в ЭФ ~ 3 раза выше , чем в EFU (~ 1,550 мкм комплексы ^-2 против ~ 550 мкм ^-2 комплексов, рис 3). Это одна основа для дифференциации между этими двумя непрерывными гранями. Другим примером является разница в их фоне. В то время как фон ЭФ кажется гладкой, лицо EFU неровная и содержит отверстия , которые являются следы отдельных PSI комплексов, перелом комплементарной лица, ОРП ¹⁰ (рисунок 3). Примером сегментации комплексов ФС II от Efs поверхности мембраны тилакоидов показано на рисунке 5.

Рисунок 1. Низкая Увеличение крио-SEM Изображения Тромбоциты с Фриз-раздробленной C. pumilum Кусочки листьев. (A) большая область трещиноватых клеток (пунктирная контур) из C. pumilum лист. (Б) кусок листа был сбит с верхней тромбоцита, но некоторые из листовой ткани оставалось прикреплены к ножу отметок на нижней тромбоцита (Наконечники отметить некоторые из них). Области, окружающие кусочки листьев замораживают 1-гексадецен (звездочки). Шкала баров:. 200 мкм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Супрамолекулярная Организация мембранах тилакоидов в тканях растений раздробленной хлоропласта , в котором можно увидеть различные тилакоидов грани разрушения:. Exoplasmic на поверхности разрыва (EF) обоих сложенных (EFS) и разобран (ВФУ) мембранных регионов содержат фотосистемы II (PSII) комплексы; Протоплазмы лицо перелом сложенных областей (PFS) содержит периферические светособирающей антенны комплексы PSII, LHCII; Фотосистемы I (PSI) и АТФ-синтазы перелом к ​​протоплазмы поверхности разрушения штабеля областей (БОЕ); Цитохром Ь ₆ е переломы обоих ФД и ОРП. Изображение сканировали при увеличении 203 КХ (горизонтальное поле зрения = 1,45 мкм). Шкала бар:. 100 нм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Изменения в фотосистемы II Организации при обезвоживании С. pumilum Эф лица тилакоидного мембран растений при различных RWC: (А) 100% (В) ~ 40%, (С) ~ 15%, и (D и E) , 5 - 10%.. При дегидратации, плотность PSII в ЭФ лицу постепенно уменьшается от ~ 1500 комплексов мкм ^-2 (А) до ~ 700 мкм комплексы ^-2 (~ 15% RWC, С). Следует отметить, что в более сухих условиях (5 - 10% RWC), некоторые PSкомплексы II организовать в виде строк и массивов (D и E, стрелки). Стрелолист (Е) обозначает лицо PFS, с LHCII антенны появляясь быть также организованы рядами, между которыми PSII строки будут найдены в дополнительных EFS. Для получения дополнительной информации по этим данным см ^24. Шкала баров:. 100 нм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5. Пример Сегментация фотосистемы II частиц. Использование пакета с открытым исходным кодом Фиджи, белковые комплексы могут быть сегментирован из изображений с помощью нескольких шагов (завершить детальную процедуру содержится в части 4 раздела Протокола). Изображения (A, оригинальное изображение) размыты с фильтром Гаусса (B); изображение порогами с помощью автоматического местного тысreshold инструмент (C); изображение инвертируется и алгоритм водораздела применяется для того , чтобы отделить объекты , найденные в тесном контакте (D); интересующей области выбирается и снаружи очищается (Е); частицы (в пределах заданного пользователем диапазона размеров) выбираются с помощью функции анализатора частиц. Полученная маска показана на (F). Частицы добавляются в ROI Manager , и наложить на исходное изображение (G) , чтобы проверить на наличие ошибок или ошибочных или пропущенных частиц. Список трансформирования может быть отредактирован вручную, заменив, удаления или добавления новых трансформирования, в зависимости от обстоятельств. Окончательный выбор отредактированный показан в (H). Шкала бар:. 200 нм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Техника, описанная в данной статье позволяет исследовать замораживанием сломана мембран в контексте хорошо сохранившимися высокого давления замороженных тканей растений с помощью крио-сканирующей электронной микроскопии. Основное преимущество использования этих процедур является то, что подготовка образца является чисто физическим; никаких шагов связанных с химикатами или обезвоживание не требуется. Таким образом, это позволяет изучать биологические структуры на почти родном штате ^26,32. Преимущество использования тканей листьев является то , что можно получить информацию о клеточной организации в целом, а также изучения конкретных мембран, таких как мембраны тилакоидов, в пределах их родного физиологического контекста, то есть в пределах хлоропластов. Еще одно преимущество, необходимо , чтобы изучать C. pumilum растений при различных относительного содержания воды (RWC), является то , что их гидратация состояние не изменяется в процессе подготовки. Это в отличие от использования выделенные хлоропласты или мембранах тилакоидов в качестве исходного материаладля эксперимента сублимационной перелома. В последнем случае, также надо учитывать, что некоторые структурные и / или супрамолекулярными изменения, вероятно, имеют место в процессе выделения органелл / мембраны.

Работа с образцами тканей растений, которые являются относительно толстые [> 50 - 100 мкм, и может быть значительно толще, в зависимости от типа ткани и вида], диктует использование высокого давления замораживания (ФВЧ) для образца витрификации. Применение высокого давления [2,100 бар], при котором температура плавления воды составляет около -22 ° C, влияет на сеть водородных связей воды таким образом, что он замедляет скорость образования кристаллов льда. Таким образом, вероятность получения витрифицированном образца высока даже при относительно медленных скоростях охлаждения. ФВЧ в настоящее время единственный доступный метод для витрификации толщиной, но не более 200 мкм, образцы. Важным шагом для ФВЧ растительных тканей является инфильтрация их межклеточных пространств воздуха с инертным4;. Пространство наполнитель "до замораживания, чтобы предотвратить разрушение ткани под высоким давлением (см обзоры ^29,33) В случае C. pumilum листьев, толщина которых может составлять до 1 мм, листья также должны быть обрезаны или разбавлять до ФВЧ.

По сути, методика подготовки реплики ¹⁸ также может быть применен к сублимационной сломана ткани листа. Тем не менее, в нашем опыте, достаточный выход интактных трещиноватых областей не было получено, так как точные копии часто фрагментировать на мелкие кусочки. Кроме того, в поисках конкретной области, представляющей интерес, такие как хлоропласты могут быть непрактичным в раздробленном репликами растительных тканей. Это происходит главным образом потому , что мезофильные (фотосинтетический) клетки состоят из большого центрального вакуоли , окруженной узкой полосой цитоплазмы (рис 2А), который включает в себя ядро, хлоропласты и все другие органеллы. Таким образом, хлоропласты представляют собой лишь очень малую часть от общей площади раздробленноймезофильные ткани. Крио-SEM визуализация замораживанием сломана образцов предлагает решение этой проблемы, так как образцы непосредственно визуализировать следующие разрушения (и покрытия / затенение). Тем не менее, этот метод страдает от ограничения, что замороженные увлажненной образцы пучка чувствительны и, таким образом, сканирование при больших увеличениях с готовностью повреждает образец при первом сканировании. Дважды слой покрытия (DLC) ^27,28 предлагает решение на этот серьезный недостаток.

В DLC, образцы, разрушенные покрыты таким образом, подобно тому, как они предназначены для подготовки реплики. Во-первых, тонкий слой (1 - 3 нм) Pt / C упаривают на образец, обеспечивая контраст и проводимость. За этим следует более толстым (5 - 10 нм), защитный слой углерода. DLC в сочетании с высоким ускоряющего напряжения (10 кВ) использовали для образцов изображения с использованием сигнала ²⁸ обратного рассеяния электронов (BSE). Сигнала ОЭ, происходящих из слоя платины позволяет получить информацию поверхности через углероди, возможно, вода загрязнителем слой пара, который практически прозрачен для BSE при высоких напряжениях ускорения (загрязнение воды накапливается в экспериментах, в которых вакуум-крио блок передачи не используется и раздробленная поверхность подвергается воздействию атмосферы, даже если это это за доли секунды). Кроме того, визуализация с помощью BSE сигнала сведено к минимуму проблему зарядки эффекты , которые проявляются в вторичных электронов (SE) обнаружения ^27. При установке микроскопа, описанного здесь, визуализации сигнала SE с In-объективом детектора SE на 10 кВ получали информацию, эквивалентную той, которая получается, когда образцы были покрыты исключительно 2 - 3 нм Pt / C и при низких отображены ускоряющих напряжений. Разница заключается в том, что образцы, полученные с помощью DLC и изображаемого, как описано было значительно меньше света чувствительны к регистру. Это дало нам возможность сканировать их при высоких увеличениях и во многих случаях даже неоднократно, и позволили получить ценную информацию о фотосинтетической белка supramoleculорганизация аг и другие клеточные компоненты (Рисунки 2 - 4) ^24.

И, наконец, процедуры, описанные здесь, могут быть модифицированы для изучения структуры и / или мембранную организацию белка в других типах образцов. Мы успешно использовали технику для изучения надмолекулярной организации фотосинтетических мембран в цианобактерий и водорослевых клеток (Shperberg-Авни и др. Неопубликованные данные). Основное соображение заключается в нахождении баланса между наличием в качестве тонкого образца, насколько это возможно, для того, чтобы увеличить вероятность для витрификации, сохраняя при этом образец интактность. Для различных типов образцов, которые могут быть суспензии или тканей животных / растений, различные упаковки должны быть использованы (например, с точки зрения типа тромбоцитов , используемых для замораживания под высоким давлением). После успешной крио-иммобилизации достигается, сочетание сублимационной перелома, DLC и визуализации крио-SEM обеспечивает превосходное средство для получения инфорформацию по мембранной организации белка при большом увеличении с минимальным повреждением пучка.

The authors declare they have no competing financial interests.

Мы благодарим Андрес Kaech (Университет Цюриха) за полезные советы по сканирующей электронной микроскопии изображений. Эта работа была поддержана исследований и развития Фонда США-Израиль Двусторонней сельского хозяйства (грант №. US-4334-10, ZR), Израильского научного фонда (грант №. 1034/12, ZR) и Научном программы Human Frontier (RGP0005 / 2013, ZR). Исследования электронной микроскопии проводились на Ирвинга и Черна Московиц Центра нано- и био-нано изображений в институте Вейцмана.