دراسة منظمة Supramolecular من الضوئى الأغشية داخل الأنسجة ورقة بكسر تجميد من قبل كرو مسح الميكروسكوب الالكتروني

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

البرد المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) العينات بكسر تجميد يسمح التحقيق في الهياكل البيولوجية في الظروف المحلية القريبة. هنا، نحن تصف تقنية لدراسة تنظيم supramolecular من التمثيل الضوئي الأغشية (الثايلاكويد) في عينات الأوراق. ويتحقق ذلك عن طريق الضغط العالي تجميد الأنسجة ورقة، تشميد، طلاء طبقة مزدوجة وأخيرا التصوير البرد ووزارة شؤون المرأة. استخدام طريقة طلاء طبقة مزدوجة يسمح الحصول على التكبير عالية (> 100،000X) صور مع الحد الأدنى من الضرر شعاع للعينات المجمدة المائية فضلا عن آثار فرض الحد الأدنى. باستخدام الإجراءات الموضحة نحن التحقيق في إحداث تغييرات في توزيع supramolecular المجمعات الضوئي وضوء حصاد البروتين الهوائي التي تحدث أثناء جفاف النبات القيامة Craterostigma pumilum، في الموقع.

الضوئي الاوكسجينية، والتي تنشأ في البكتيريا الزرقاء القديم، ورثته الطحالب والنباتات البرية الأحداث endosymbiotic التي أدت إلى تطوير عضية بلاستيدات الخضراء. في كل phototrophs الاوكسجينية في العصر الحديث، وتجرى الضوئي نقل الإلكترون وتوليد قوة البروتون الدافع والحد من السلطة في غضون الحويصلات مثل كيس بالارض وصف الأغشية "الثايلاكويد". هذه الأغشية تأوي مجمعات البروتين التي تنفذ ردود الفعل مدفوعة للضوء من التمثيل الضوئي، وتوفير وسيلة لتنبيغ الطاقة. وتختلف الأغشية الثايلاكويد من النباتات و(بعض) الطحالب في مجالين المورفولوجية متميزة: appressed بإحكام المناطق غشاء يسمى "جرانة" والأغشية unstacked أن ربط وجرانة، ودعا 'سدى صفاحات ^"1. وقد أجريت دراسات تجميد كسر مختلفة من النباتات والأغشية الثايلاكويد الطحالب، ابتداء من أوائل 1970s. عندما-بكسر تجميد والأغشيةتقسيم على طول الأساسية مسعور. ^2، وتوليد وجه exoplasmic (EF) ووجه جبلي (PF)، اعتمادا على مقصورة الخلوية التي حدود نصف الغشاء، كما صاغ في الأصل من قبل Branton وآخرون. . في عام 1975 ³ النبات والطحالب ثايلاكويد لها أربعة أنواع مختلفة من وجوه كسر: التماثلية، EFU، PFS وPFU، مع الصورة "وتدل على" مكدسة "و" unstacked "المناطق غشاء 'ش'، على التوالي. المجمعات بروتين الغشاء، والتي لا تقسيم أو كسر، لديهم ميل للبقاء مع إما E أو الجانب P من الغشاء. الملاحظات الأولية التي تواجهها كسر مختلفة من ثايلاكويد تحتوي على جزيئات من مختلف الأحجام والكثافة ^4، والعديد من التحقيقات التي تلت ذلك، أدى إلى تحديد وجود ارتباط بين الجسيمات لوحظ ومجمعات البروتين غشاء التي تنفذ ردود الفعل الخفيفة ^5-13 (انظر أيضا يستعرض ^14،15).

الصحائفوتجرى تجارب إز كسر الأغشية الثايلاكويد عادة خارجا على الاستعدادات من البلاستيدات الخضراء أو الأغشية الثايلاكويد معزولة (ولكن انظر ^16،17)، في خطر من أي تغيير في / أو التنظيم الهيكلي وsupramolecular التي قد تحدث أثناء إجراء العزل. بعد كسر، وعن طريق التبخر من البلاتين / الكربون (حزب العمال / ج) إعداد النسخ المتماثلة، ثم بطبقة سميكة من الكربون (C)، وأخيرا هضم المواد البيولوجية ^(18). وتصور المقلدة من قبل انتقال المجهر الإلكتروني (تيم). تواصل تقنية تجميد كسر طبق الأصل التقليدية ليكون بمثابة أداة هامة لدراسة تنظيم supramolecular الأغشية الضوئي ومواكبة لمختلف، على سبيل المثال، الضوء، وظروف ^19-23.

في دراستنا الأخيرة من النبات القيامة homoiochlorophyllous Craterostigma pumilum ^24، كنا نهدف إلى تحقيق التغييرات في تنظيم س supramolecularالأغشية و الثايلاكويد، وكذلك في تنظيم الخلوية بشكل عام، خلال الجفاف ومعالجة الجفاف. تفرد الأنواع القيامة homoiochlorophyllous هو أن تكون قادرة على البقاء على قيد الحياة ظروف جفاف في الأنسجة النباتية الخاصة بهم (يترك)، مع الاحتفاظ أجهزتها الضوئي. مرة واحدة يتوفر الماء، وهذه النباتات على التعافي واستئناف النشاط الضوئي في غضون ساعات إلى بضعة أيام ^25. لهذه الدراسة، تم الجمع بين البرد مسح EM (SEM) تصوير عينات أوراق بكسر تجميد مع الضغط العالي تجميد لعينة البرد تجميد. توفر هذه الإجراءات وسيلة لتصور العينات البيولوجية المجمدة-المائية في حالة قريبة من الحالة الأصلية الخاصة بهم ^26. واحد الفائدة الرئيسية هي أن العينات يتم فحص مباشرة بعد تجميد كسر وطلاء مع أي خطوات متتالية. وينطبق ذلك بشكل خاص على التحقيق في النباتات على مختلف محتويات المياه النسبي (RWC)، كما حافظت دولة ترطيب أثناء الإعداد. كيفمن أي وقت مضى، واحد عيب الحاسم هو أن العينات المجمدة رطب قد تعاني من التلف شعاع أثناء التصوير، وخصوصا عندما تم مسحها ضوئيا في تكبير عالية، اللازمة لقياس دقيق لحجم المجمعات الضوئي. للتغلب على هذه، وهي طريقة تسمى "طلاء طبقة مزدوجة" (DLC) ^27،28 جنبا إلى جنب مع استخدمت شروط محددة التصوير البرد ووزارة شؤون المرأة. أدت هذه في العينات التي هي أقل بكثير الحزم حساسة ويسمح لاستجلاء معلومات قيمة عن تنظيم supramolecular البروتين الضوئي وغيرها من المكونات الخلوية من محطة القيامة C. pumilum في تكبير عالية في الموقع.

1. كرو-التثبيت من ورقة الأنسجة التي كتبها الضغط العالي التجميد

ملاحظة: يصف هذا القسم كيفية تنفيذ تجميد الضغط العالي للأنسجة ورقة عن تجربة تجميد كسر. لاعتبارات تتعلق عينات النبات نرى ^29. هذا يمكن تكييفها لأنواع أخرى من أنسجة أو العينات مع بعض التعديل.

1. باستخدام زاوية شفرة حلاقة، خدش الجزء السفلي من تجويف 0.1 ملم من 0.1 / 0.2 مم الألومنيوم الصفائح الدموية (الشكل 1). إعداد ما لا يقل عن اثني عشر الصفائح الدموية (6 عينات). أخذ الحيطة والحذر بعدم إنشاء علامات السكين على محيط القرص.
   1. بعد الخدش، وغسل أقراص في الايثانول المطلق، والسماح لهم الجافة وضعها في طبق نظيف.
2. إعداد آلة تجميد ارتفاع ضغط وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ملء غرفة الكحول آلة تجميد ارتفاع ضغط مع الأيزوبروبانول.
3. إعداد infiltratio بمساعدة فراغ محلية الصنعن جهاز ليحل محل الغاز الموجودة في الأنسجة ورقة مع السائل.
   1. بإحكام ربط 200 ميكرولتر ماصة إلى نهاية حقنة 10 مل. قطع ~ 1 سم من الحافة. جعل ثقب في الغطاء من أنبوب microcentrifuge 1.5 مل لتناسب محكم خفض الحافة. يمكن إنشاء فراغ داخل أنبوب عن طريق سحب الغواص من الحقنة.
4. قطع قطعة صغيرة من ورقة من نبات باستخدام شفرة حلاقة ومع ملاقط وضع ورقة داخل أنبوب microcentrifuge شغل نصف مع 1-hexadecene. اختراق مسافات بين من ورقة مع السائل عن طريق سحب بلطف المكبس لخلق فراغ، وعقد لمدة 30 ثانية، ثم حرر ببطء الغطاس.
5. إزالة قطعة ورقة من الأنبوب باستخدام الملقط. تقليم ورقة بشفرة حلاقة في الحالة هو أكثر سمكا من 0.2 ملم وقطع قطعة صغيرة من شأنها أن تندرج في الصفائح الدموية.
6. وضع الصفائح الدموية نظيفة مع الجانب خدش تصل إلى حامل آلة تجميد وثم ضع قطع قطعة من جنيهبالعربية في الصفائح الدموية. ملء المساحة المتبقية المحيطة رقة مع 1-hexadecene. إغلاق شطيرة باستخدام الصفائح الدموية آخر، مع الخدوش التي تواجه رقة.
7. إغلاق وتشديد حامل وأدخله في غرفة الآلة. ثم اضغط على زر "جيت" إلى تجميد (~ 2100 القضبان ل300-500 مللي ثانية)، وسرعان ما نقل حامل في النيتروجين السائل. إزالة بعناية ساندويتش المجمدة من صاحب باستخدام الملقط تبريد مسبقا، مع الحرص على عدم كسر شطيرة.
   ملاحظة: السندويشات المجمدة مغلق يمكن أن يكون تجميد بكسر فورا أو الاحتفاظ بها في النيتروجين السائل لاستخدامها لاحقا. استخدام الملابس الواقية والنظارات عند التعامل مع النيتروجين السائل.

2. تجميد الكسر وطبقة مزدوجة طلاء ^27،28

1. إعداد آلة كسر التجميد للاستخدام، بما في ذلك البنادق للتبخر من البلاتين / الكربون (حزب العمال / C) والكربون، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. وضع بندقية حزب العمال / ج في 45 درجة لالثاني بندقية الكربون عند 90 درجة.
   1. قبل برنامج مخطط طلاء طبقة 2 نانومتر من حزب العمال / C (معدل طلاء 0،02-0،04 نانومتر / ثانية) وطبقة 6 نانومتر من الكربون (في ~ 0.1 نانومتر / ثانية).
      1. أدخل الإعداد على شاشة الجهاز تجميد كسر في. تحديد عدد المستخدمين حيث سيتم حفظ مخطط الطلاء.
      2. اختيار حزب العمال / C ل 'طبقة 1 ". تحديد إطار زمني، على سبيل المثال، 5 دقيقة (أن يتجاوز الوقت اللازم اللازمة لإكمال الطلاء). استخدم الأسهم لأعلى إلى أسفل لتحديد سماكة 2 نانومتر.
      3. اضغط على زر 'طبقة' للانتقال إلى طبقة 2. كرر الخطوة 2.1.1.2، باستثناء حدد الكربون وتحديد سماكة 6 نانومتر.
   2. اختبار وضبط عملية بندقية.
      1. حدد "طبقة 1". حدد حزب العمال / C بندقية عن طريق الضغط على زر "GUN1 'واضغط على زر' على 'على وحدة التحكم تبخر آلة تجميد كسر. رصد معدل التبخر وتعديله باستخدام الجهد والانبعاثات المقابض الاتحاد الوطني للعمالايل حيث بلغت نسبة من 0،02-0،04 نانومتر / ثانية. اضغط على "OFF" لإيقاف بندقية حزب العمال / C.
      2. حدد "طبقة 2". كرر 2.1.2.1، باستثناء "GUN2" حدد وضبط معدل تبخر ~ 0.1 نانومتر / ثانية.
2. تبريد مرحلة تجميد نظام كسر ل-140 C أو C -160 (للأوراق رطب أو المجففة، على التوالي). إرفاق المكوك نقل فراغ البرد إلى الجهاز وملء الغرفة مع النيتروجين السائل. الضغط في غرفة تجميد كسر تبريد وعادة ما بين 1-8 × 10 ^-7 ميليبار.
3. إدراج حامل العينة تجميد كسر (مناسبة للالصفائح الدموية 3 ملم) في محطة التحميل. إغراق غرفة محطة التحميل مع النيتروجين السائل.
4. تحميل شطائر اثنين المجمدة على حامل واحد تلو الآخر باستخدام الملقط درجة عالية من الدقة. تشديد ساندويتش الأول في حامل والوجه ثم صاحب أكثر للتأكد من تناسبها في مكان آمن. كرر لشطيرة الثاني.
5. دetach المكوك تبريد من الجهاز كسر التجميد وذلك لربط محطة التحميل. فتح صمام المكوك، وإدخال الذراع التراجع في حامل ووضعه في مكانه. إعادة إطلاق الذراع مع حامل في المكوك وإغلاق صمام المكوك باستخدام مقبض محطة التحميل. إرفاق المكوك إلى آلة تجميد كسر وإدخال حامل في غرفة مع الذراع التراجع. فصل المكوك من الجهاز.
6. محاذاة كسر التجميد مشراح سكين إلى ارتفاع بحيث سوف تدق قبالة أعلى الصفائح الدموية من السندويشات.
7. مع السكين مشراح، وسرعان ما كسر السندويشات، وبعد ذلك على الفور رفع الامر لمنع تلوث العينات بواسطة التشبث الحطام إلى السكين، وتحويل مصراع تبريد فوق الطائرة تعرضت حديثا لحماية العينات من أي تلوث محتمل من قبل جزيئات الماء في الغرفة.
8. معطف العينات مع البلاتين والكربون.
   1. أدخل 'طبقة 1 "على الشوريreen. بدوره على حزب العمال / C بندقية عن طريق الضغط على زر "GUN1 متبوعا على زر" ON ". دراسة معدل التبخر وبمجرد وصولها 0،02-0،04 نانومتر / ثانية، في وقت واحد فضح العينات واضغط على زر 'قياس' لمراقبة سماكة طبقة المودعة.
      ملاحظة: سوف بندقية إيقاف تلقائيا عندما سمك وصلت القيمة المحددة مسبقا.
   2. تغطية العينات مع مصراع عند اكتمال حزب العمال / C التبخر.
   3. اضغط على زر "طبقة" للانتقال إلى "طبقة 2". كرر الخطوات من 2.8.1 و 2.8.2، مع استثناء من اختيار "GUN2" (الكربون) ومعدل التبخر من ~ 0.1 نانومتر / ثانية.
9. تدفئة مرحلة تجميد نظام كسر ل-120 ج.

3. كرو-المجهر الإلكتروني

1. تحضير المجهر الإلكتروني الماسح للعمل البرد.
   1. حدد المرحلة / مرحلة التهيئة من القائمة الرئيسية وتأكيد.
   2. اختر Tools / حصلتس لوحة، وفتح لوحة "غرفة الضغط" عن طريق اختيار من القائمة. انقر على زر "انهيار العمود غرفة صمام. تنفيس غرفة المجهر عن طريق النقر على زر تنفيس تحت علامة التبويب "فراغ" لل.
   3. اختر Tools / لوحة جوتو، وفتح "قائمة المرحلة نقاط" لوحة. حدد موقف البرد الصرف لتحريك المرحلة الإحداثيات الصحيحة لقبول صاحب العينة. ملاحظة: يتم مسبقا و"موقف البرد الصرف" ليكون في المواءمة مع موقف وحدة نقل فراغ.
   4. فتح غرفة العينة مع زوج نظيف من القفازات وإدراج المرحلة البرد على المسرح الرئيسي للمجهر. إغلاق غرفة وانقر على زر مضخة ضمن علامة التبويب "فراغ".
   5. تبريد المجهر ل-120 ج. ملء المجهر ديوار مع النيتروجين السائل. تنشيط وظيفة الحرارة على وحدة التحكم البرد نقل إلى -120 ج مرة واحدة في درجة حرارة مرحلة قطرات أقل من -120 ج.
2. توريمنظمة العمل ضد الجوع المكوك البرد نقل إلى المجهر ونقل صاحب العينة باستخدام ذراع التراجع إلى مرحلة المجهر البرد (كما في الخطوة 2.5). فصل المكوك من المجهر.
3. انقر على زر "فتح العمود غرفة صمام 'في لوحة غرفة الضغط.
4. بعناية نقل صاحب العينة قريب من العدسة الشيئية (العمل عن بعد 1-2 ملم) باستخدام عصا التحكم. حدد الفتحة 10 ميكرون في علامة التبويب "بؤر". انقر نقرا مزدوجا فوق حقل EHT في علامة التبويب "بندقية". إدخال 10 (كيلو فولت) لهدف EHT ثم انقر فوق موافق. انقر فوق علامة التبويب EHT أسفل واختر 'EHT في ".
5. اختر 'InLens "من القائمة المنسدلة كشف في علامة التبويب" كشف ". تحسين ظروف التصوير (التركيز والسطوع والتباين، والمحاذاة شعاع، الاستجماتيزم) حسب مقتضى الحال.
6. انقر على علامة التبويب "المسح الضوئي". اختيار مسح سريع ( 'سرعة المسح الضوئي = 1 "، المقابلة لمدة انتظار 100 NSEC لكل بكسل) للحد من الأضرار شعاع، وو'مخزن قرار "من 1024 × 768 بكسل. حدد "متوسط ​​خط" في القائمة المنسدلة "للحد من الضوضاء. ضبط قيمة N إلى 20 - 30 خطوط للبحث. نقل العينة باستخدام وظيفة "سنتر بوينت" (عن طريق الضغط على ضبط علامة على لوحة المفاتيح) للبحث عن المناطق مع الخلايا والبلاستيدات الخضراء كسر (أرقام 2A و 2B).
7. الحصول على صور من البلاستيدات الخضراء بكسر في تكبير منخفضة (50-70 KX) (الشكل 2C و 2D). استخدام وظيفة "مركز ميزة" (عن طريق الضغط على ضبط التحول علامة على لوحة المفاتيح) لتكبيره في وجوه كسر بلاستيدات الخضراء مثيرة للاهتمام، والحصول على صور في تكبير عالية (100-200 KX، أرقام 3 و 4). استخدام نفس المعلمات كما في الخطوة 3.6 لالتقاط صور، ولكن تغيير قيمة متوسط ​​خط إلى N> 100 للحد من الضوضاء ^30.
   1. الصحافة تجميد على وحدة التحكم الرئيسية المجهر أو في علامة التبويب "المسح الضوئي" لوقف المسح الضوئي وحفظالصورة عن طريق الضغط على زر "حفظ TIFF.

تحليل 4. صورة

ملاحظة: يصف هذا القسم إجراء القصير لتقسيم جزيئات الغشاء من الصور SEM-تجميد كسر باستخدام فيجي ³¹ حزمة مفتوحة المصدر. ويمكن الحصول على نتائج مماثلة مع غيرها من البرامج تحليل الصور.

1. صورة مفتوحة مع فيجي عن طريق سحب ملف الصورة في إطار البرنامج الرئيسي. تحويل الصورة إلى 8 بت عن طريق اختيار صورة / النوع / 8 بت. اختر صورة / ضبط / السطوع / التباين وضبط حسب الضرورة (الشكل 5A).
2. باستخدام أداة الخط المستقيم، رسم خط حجم شريط مقياس صورة المضمنة. اختر تحليل مجموعة مقياس /. أدخل المعلومات على نطاق والصحيحة (المعروفة المسافة وحدة طول) ثم انقر فوق موافق. حفظ هذه الصورة تحجيم تعديل.
3. حدد عملية / مرشحات / التمويه الضبابي (1.5 نانومتر نصف القطر) وانقر فوق موافق (الشكل 5B).
4. اختر صورة / ضبط / النمساس عتبة المحلية (باستخدام طريقة Niblack) وانقر فوق موافق (الشكل 5C).
5. حدد تحرير / المقلوب ثم عملية / ثنائي / مستجمعات المياه (الشكل 5D).
6. رسم الحدود في جميع أنحاء المنطقة ذات الاهتمام (ROI) مع أداة حر الاختيار. إضافة التحديد إلى مدير العائد على الاستثمار من خلال اختيار تحرير / الاختيار / إضافة إلى مدير أو عن طريق النقر 'T'.
7. حدد تحرير / مسح خارج (الشكل 5E).
8. اختر تحليل / تعيين القياسات، واختيار المعلمات المناسبة (على سبيل المثال، منطقة، وتناسب القطع الناقص).
9. حدد تحليل / تحليل الجزيئات. أدخل مجموعة مناسبة لحجم الجسيمات ووضع علامة "عرض النتائج '،' إضافة إلى مدير" وإذا لزم الأمر، و 'استبعاد على حواف' الخيار ثم انقر فوق موافق. تظهر النتيجة في الشكل 5F.
10. فتح حفظ ملف تصوير تحجيم (الخطوة 4.2). اختر "إظهار جميع" وإلغاء "التسميات" في إدارة العائد على الاستثمار. مراجعة partic المختارةوضعت ليه على الصورة الأصلية ويدويا إضافة أو إزالة التحديدات باستخدام 'إضافة' أو 'حذف' أزرار للمدير العائد على الاستثمار. تصحيح أي تحديدات اللازمة باستخدام أداة حر الاختيار والزر 'تحديث' للمدير العائد على الاستثمار (أرقام 5G و5H).
11. تحليل البيانات باستخدام القياسات التي تم الحصول عليها. في نافذة النتائج، انقر فوق نتائج / تلخيص للحصول، على سبيل المثال، متوسط ​​المساحة، ويعني الرئيسية ومحاور الصغيرة من الجسيمات المدرجة في إدارة العائد على الاستثمار. انقر فوق نتائج / توزيع، حدد المعلمة (مثل المنطقة) ثم انقر فوق موافق لعرض الرسم البياني لهذه المعلمة.

ويبين الشكل 1 صور البرد ووزارة شؤون المرأة من الصفائح التي تحتوي على ارتفاع ضغط المجمدة، بكسر تجميد Craterostigma قطع ورقة pumilum. في بعض العينات، ويتم الحصول على مناطق واسعة من الخلايا المنقسمة (الشكل 1A). وفي حالات أخرى، يبقى قطعة ورقة بإحكام إلى القرص العلوي وتربعت معها (الشكل 1B). ومع ذلك، وحتى في الحالة الثانية، وبعض الأنسجة ورقة قد لا تزال تعلق على الأخاديد سكين على الصفائح الدموية (1B الشكل، السهام) وقدرا كبيرا من البيانات لا يزال من الممكن جمعها عن طريق التصوير ورقة "فلول"، شريطة أن يكسر. بعد العثور كسر ناجح، يتم الحصول على انخفاض الصور التكبير من الخلايا لتحديد المناطق ذات الاهتمام، في هذه البلاستيدات الخضراء القضية (الشكل 2).

صور عالية التكبير أعلى من الأغشية الثايلاكويد في C. pumilum وتظهر أوراق في أرقام 3 و 4، وأربعة وجوه كسر مختلفة، التماثلية، EFU، PFS وPFU، ويمكن تمييز (الشكل 3). يقع الضوئي الثاني (PSII)، الذي يعد أكبر مجمع البروتين الموجود في أغشية، في كل من التماثلية (جرانة) وEFU (سدى صفاحات). في الظروف المائية، والكثافة PSII أعلى ~ 3 مرات في التماثلية من في EFU (~ 1550 المجمعات ميكرون ^-2 مقابل ~ 550 ميكرون المجمعات ^-2، الشكل 3). وهذا هو أساس واحد للتمييز بين هذه الوجوه مستمرة اثنين. آخر هو الفرق في خلفيتها. بينما تظهر الخلفية التماثلية نحو سلس، ووجه EFU الخام ويحتوي على الثقوب التي هي آثار أقدام من المجمعات PSI منفصلة، ​​الذي كسر في الوجه مكملا، وPFU ¹⁰ (الشكل 3). ويرد مثال للتجزئة المجمعات PSII من على وجه التماثلية للغشاء الثايلاكويد في الشكل (5).

الشكل 1. صور منخفضة التكبير كرو-SEM من الصفائح الدموية مع بكسر تجميد-C. pumilum ورقة قطعة. (A) ومنطقة كبيرة من الخلايا بكسر (مخطط متقطع) من C. ورقة pumilum. (ب) كان يطرق قطعة ورقة قبالة مع الصفائح الدموية الأولى، ولكن ظلت بعض الأنسجة ورقة تعلق على علامات سكين في الصفائح الدموية السفلي (السهام علامة بعض من هذه). يتم تجميد المناطق المحيطة قطع ورقة 1-hexadecene (النجمة). الحانات الحجم: 200 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. منظمة Supramolecular من الثايلاكويد الأغشية داخل الأنسجة النباتية وبلاستيدات الخضراء كسور التي يمكن أن ينظر إلى وجوه مختلفة كسر الثايلاكويد: وجوه كسر exoplasmic (EF) من كلا مكدسة (EFS) وunstacked (EFU) المناطق غشاء تحتوي الضوئي الثاني (PSII) المجمعات. مواجهة كسر جبلي في مناطق مكدسة (PFS) يحتوي على مجمعات هوائي ضوء الحصاد الطرفية من PSII، LHCII. الضوئي الأول (PSI) وATP كسر سينسيز لمواجهة كسر جبلي من المناطق unstacked (PFU)؛ السيتوكروم ب ₆ و كسور في كلا PFS وPFU. والصورة الممسوحة ضوئيا في التكبير من 203 KX (حقل أفقي نظر = 1.45 ميكرون). شريط الحجم: 100 نانومتر الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4. التغييرات في منظمة الضوئي الثاني خلال تجفيف C. pumilum التماثلية يواجه الأغشية الثايلاكويد من النباتات في مختلف RWC: (أ) 100٪، (B) ~ 40٪، (C) ~ 15٪، و (D و E) 5-10٪. خلال الجفاف، وكثافة PSII في التماثلية تواجه يقلل تدريجيا من ~ 1500 المجمعات ميكرون ^-2 (A) إلى ~ 700 ميكرون المجمعات ^-2 (~ 15٪ RWC، C). والجدير بالذكر، في ظروف أكثر جفافا (5-10٪ RWC)، وبعض PSالثاني المجمعات تنظم إلى صفوف وصفوف (D و E، والسهام). رأس السهم (E) يمثل الوجه PFS، مع هوائي LHCII تظهر التي سيتم تنظيمها أيضا في صفوف، بين الذي من شأنه أن يمكن العثور صفوف PSII في التماثلية التكميلية. للحصول على معلومات إضافية حول هذه البيانات نرى ^24. الحانات الحجم: 100 نانومتر الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5. مثال لتقسيم النظام الضوئي الثاني الجسيمات. باستخدام حزمة مفتوحة المصدر فيجي والمجمعات البروتين يمكن أن تكون مجزأة من الصور مع بضع خطوات (إكمال الإجراء التفصيلي الوارد في الجزء 4 من قسم البروتوكول). وعدم وضوح الصور (A، الصورة الأصلية) مع مرشح جاوس (باء)؛ وthresholded الصورة باستخدام ال المحلية لصناعة السياراتأداة reshold (C)؛ هو مقلوب الصورة ويتم تطبيق خوارزمية مستجمعات المياه من أجل كائنات منفصلة وجدت على اتصال وثيق (D)؛ يتم تحديد المنطقة ذات الاهتمام ويتم مسح الخارج (E)؛ ويتم اختيار الجسيمات (في نطاق حجم المعرفة من قبل المستخدم) باستخدام وظيفة الجسيمات محلل. يظهر قناع مما أدى إلى (F). يتم إضافة جزيئات إلى مدير العائد على الاستثمار ومضافين على الصورة الأصلية (G) للتحقق من وجود أخطاء أو جزيئات خاطئة أو غاب. قائمة رويس يمكن يدويا تحريرها، استبدال أو حذف أو إضافة رويس الجديدة، حسب الاقتضاء. ويظهر اختيار المستخدم تحريرها النهائية في (H). شريط الحجم: 200 نانومتر الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تقنية الموضحة في هذه الورقة تسمح التحقيق في الأغشية كسر التجميد في سياق الأنسجة النباتية المجمدة ذات الضغط العالي المحفوظة جيدا من البرد المجهر الإلكتروني. والميزة الرئيسية لاستخدام هذه الإجراءات هي أن إعداد العينات هو مادي بحت. ضرورية أية خطوات تنطوي على مواد كيميائية أو الجفاف. وهكذا، فإنه يسمح بدراسة الهياكل البيولوجية في حالة شبه الأم ^26،32. الاستفادة من استخدام الأنسجة ورقة هي التي يمكن للمرء الحصول على معلومات عن منظمة الخلوية بشكل عام، وكذلك الأغشية محددة الدراسة، مثل الأغشية الثايلاكويد، ضمن سياق الفسيولوجية الأصلي لها، أي داخل بلاستيدات الخضراء. ميزة أخرى، حتمية لدراسة C. النباتات pumilum على مختلف محتويات المياه النسبي (RWC)، هو أن الدولة ترطيب لهم لا تتغير أثناء التحضير. وعلى عكس ذلك إلى الاستفادة من البلاستيدات الخضراء المعزولة أو الأغشية الثايلاكويد كمادة بدءلتجربة تجميد كسر. في الأخير، على المرء أيضا أن تأخذ في الاعتبار أن بعض التعديلات الهيكلية و / أو supramolecular من المرجح ان يعقد خلال العزلة عضية / الغشاء.

العمل مع عينات الأنسجة النباتية، التي هي سميكة نسبيا [> 50-100 ميكرون، ويمكن أن تكون أكثر سمكا بشكل كبير تبعا لنوع من الأنسجة والأنواع]، يتطلب استخدام الضغط العالي التجمد (HPF) لعينة التزجيج. تطبيق ضغط عال [2100 شريط]، الذي درجة حرارة انصهار الماء حوالي -22 درجة مئوية، ويؤثر على شبكة السندات الهيدروجين من الماء بحيث يبطئ معدل تكوين بلورات الثلج. ولذلك، فإن فرصة الحصول على عينة المزجج عالية حتى في معدلات التبريد البطيئة نسبيا. HPF حاليا الطريقة الوحيدة المتاحة للالتزجيج سميكة، ولكن لا تزيد عن 200 ميكرون، والعينات. خطوة حاسمة لHPF من الأنسجة النباتية هي تسلل من الفراغات الهوائية بين الخلايا مع خاملة(4)؛ حشو الفضاء "قبل التجميد، لمنع انهيار النسيج تحت الضغط العالي (انظر نقد ^29،33) في حالة C. أوراق pumilum، التي يمكن أن تصل إلى 1 مم سمك، لديها الأوراق أيضا إلى تهذيب أو ضعفت قبل HPF.

أساسا، هذه التقنية من إعداد نسخة ¹⁸ ويمكن أيضا أن تطبق على أنسجة ورقة تجميد كسر. ومع ذلك، في تجربتنا، لم يتم الحصول عليها عائد كاف من المناطق بكسر سليمة، منذ المقلدة غالبا ما تفتت إلى قطع صغيرة. وعلاوة على ذلك، والبحث عن منطقة محددة من الفائدة مثل البلاستيدات الخضراء يمكن أن يكون غير عملي في النسخ المتماثلة مجزأة من الأنسجة النباتية. هذا هو السبب الرئيسي وتتألف نسيج الورقة المتوسط ​​(الضوئي) خلايا من فجوة مركزية كبيرة محاطة قطاع حشوية الضيق (الشكل 2A)، والذي يتضمن نواة، البلاستيدات الخضراء وجميع العضيات الأخرى. وهكذا، البلاستيدات الخضراء لا تمثل سوى جزء صغير جدا من المساحة الكلية للكسر منالأنسجة نسيج الورقة المتوسط. البرد SEM التصوير العينات بكسر تجميد يقدم حلا لهذه المشكلة منذ وتصور عينات مباشرة بعد كسر (والطلاء / التظليل). ومع ذلك، يعاني هذا الأسلوب من القيود التي العينات المجمدة رطب مراعية للشعاع وبالتالي الضوئي في تكبير عالية بسهولة الأضرار العينة على الفحص الأول. طلاء طبقة مزدوجة (DLC) ^27،28 يقدم حلا لهذا العيب الخطير.

في DLC، والمغلفة عينات كسر بطريقة مماثلة إلى الكيفية التي يتم إعداد طبق الأصل. أولا، طبقة رقيقة - يبخر (1 3 نانومتر) من حزب العمال / C على العينة، وتوفير التباين والتوصيل. وتبع ذلك أكثر سمكا (5-10 نانومتر)، طبقة واقية من الكربون. تم استخدام DLC جنبا إلى جنب مع الجهد المتسارع عالية (10 كيلو فولت) لعينات صورة باستخدام إشارة الإلكترون الأشعة المرتدة (BSE) ^28. إشارة مرض جنون البقر، التي تنشأ من طبقة البلاتين تتيح الحصول على المعلومات من خلال سطح الكربونوربما بخار الماء طبقة الملوث، والتي تتسم بالشفافية عمليا لمرض جنون البقر في الفولتية تسارع عالية (تلوث المياه تتراكم في التجارب التي لم يتم استخدام وحدة نقل فراغ البرد ويتعرض سطح بكسر في الغلاف الجوي، حتى لو كان هذا هو لجزء من الثانية). وبالإضافة إلى ذلك، والتصوير باستخدام إشارة مرض جنون البقر التقليل من مشكلة شحن الآثار التي هي واضحة في الثانوية كشف الإلكترون (SE) ^27. مع الإعداد المجهر الموصوفة هنا، والتصوير للإشارة SE مع وعدسة SE كشف في 10 كيلوفولت أسفرت عن تعادل المعلومات إلى أن الحصول عليها عندما كانت مغلفة عينات فقط مع 2-3 نانومتر من حزب العمال / C وتصويرها في الفولتية تسريع منخفضة. والفرق هو أن العينات التي DLC إعداد وتصوير كما هو موضح كانت أقل بكثير شعاع الحساسة. هذا مكننا من مسح عليها في تكبير عالية وفي كثير من الحالات حتى مرارا وتكرارا، ويسمح بالحصول على معلومات قيمة عن supramolecul البروتين الضوئيمنظمة ع والمكونات الخلوية الأخرى (الشكلان 2-4) ^24.

وأخيرا، فإن الإجراءات الموضحة هنا يمكن تعديلها لدراسة تنظيم بروتين بنية و / أو الغشاء في أنواع أخرى من العينات. ونحن قد استخدمت بنجاح هذه التقنية لدراسة تنظيم supramolecular الأغشية الضوئي في الخلايا السيانوبكتيريا والطحالب (Shperberg-أفني آخرون بيانات غير منشورة). والاعتبار الرئيسي هو إيجاد التوازن بين وجود رقيقة عينة وقت ممكن، من أجل زيادة فرصة للالتزجيج، مع الحفاظ intactness عينة. لأنواع مختلفة من العينات، التي يمكن أن تكون الايقاف أو الأنسجة الحيوانية / نبات، وينبغي أن تستخدم التعبئة والتغليف المختلفة (على سبيل المثال، من حيث نوع الصفائح المستخدمة لارتفاع ضغط التجميد). مرة واحدة ويتحقق النجاح البرد تجميد، والجمع بين تجميد كسر، DLC والتصوير البرد ووزارة شؤون المرأة ويوفر وسيلة ممتازة للحصول على تقنية المعلوماتاملعلومات لتنظيم بروتين الغشاء في تضخم عالية مع الضرر شعاع ضئيل.

The authors declare they have no competing financial interests.

نشكر اندريس Kaech (جامعة زيوريخ) للحصول على المشورة المفيدة له على مسح التصوير المجهر الإلكتروني. وأيد هذا العمل من قبل صندوق الولايات المتحدة-إسرائيل ثنائية القومية للبحوث الزراعية والتنمية (منح رقم 4334-10 الولايات المتحدة، ZR)، ومؤسسة العلوم اسرائيل (منح رقم 1034/12، ZR)، وبرنامج العلوم الحدودي الإنسان (RGP0005 / 2013، ZR). أجريت دراسات المجهر الإلكتروني في ايرفينغ موسكوفيتش ومركز Cherna للنانو والحيوية نانو التصوير في معهد وايزمان للعلوم.