通过低温扫描电子显微镜研究光合膜内冻结，割断叶片组织的超分子组织

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

冷冻断裂样品的冷冻扫描电子显微镜（SEM）允许在接近天然条件的生物结构的调查。在这里，我们描述了叶片样品中学习光合（类囊体）膜的超分子组织的技术。这是由叶组织的高压冷冻，冷冻压裂，双层涂层和最后低温SEM成像实现的。双层涂覆方法的使用允许获得高倍率（> 100000）与到冷冻水合样品最小光束损害以及最小充电效果的图像。使用所描述的过程，我们在采取复苏植物Craterostigma细叶脱水过程中进行，现场光系统和捕光天线蛋白复合物超分子分布调查改变。

氧光合作用，原产于古代的蓝藻，是由内共生事件，导致叶绿体细胞器的开发继承了藻类和陆生植物。在所有现代的产氧光养，光合作用电子传输和质子动力的产生，并减少功率被称为"类囊体"膜扁平囊样小泡内进行。这些膜容纳该进行光合作用的光驱动反应和提供能量转换介质中的蛋白复合物。植物和（部分）藻类的类囊体膜分化成两个不同的形态结构域:紧紧贴伏膜的区域称为"基粒"和互连基粒未叠加膜，称为"基质片层^1。植物和藻类类囊体膜的各种冷冻断裂研究已经进行，在70年代初开始。当冷冻断裂，膜沿着它们的疏水芯²分割，生成exoplasmic面（EF）和原生质面（PF），这取决于蜂窝隔室其中半膜的边界，如最初由Branton 等人提出的。 。在1975年³植物和藻类类囊体有四种不同的裂缝面:EF文件，EFU，PFS和PFU，用's'和'U'表示'堆积'和'拆散'膜的区域，分别为。膜蛋白复合物，这是不分裂或破裂，必须保持与E或膜的P一侧的倾向。最初的意见，即类囊体的不同裂缝面包含不同大小的颗粒和密度^4，以及随之而来的大量调查，导致了开展光反应所观察到的颗粒和膜蛋白复合物的鉴定和相关^5-13 （见还回顾^14,15）。

FRE类囊体膜的结-断裂试验通常进行于叶绿体或分离的类囊体膜的制剂（但见^16,17），在任何改变的在结构和/或超分子组织的分离过程期间可能发生的危险。继骨折，复制是铂/炭（PT / C）的蒸发法制备，再由碳（C）厚厚的一层，最后是生物材料¹⁸的消化。复制是透射电子显微镜（TEM）观察。传统的冷冻断裂-复制技术继续作为用于研究光合膜的超分子组织和它们适应于不同的一个重要的工具， 例如 ，光，条件^19-23。

在我们最近的homoiochlorophyllous复苏植物Craterostigma细叶 ²⁴的研究中，我们的目的是探讨在超分子组织为O的变化˚F类囊体膜，以及在整体蜂窝组织，脱水和复水过程中。该homoiochlorophyllous复活的物种的独特性在于它们能够生存在他们的营养组织（叶子）干燥的条件下，同时保持其光合机构。一旦水可用时，这些植物恢复和恢复小时内光合活性几天^25。在这项研究中，冻结，割断叶样品的冷冻扫描EM（SEM）成像用高压冷冻样品冷冻固定组合。这些程序提供了在接近其原生状态²⁶的状态可视化冷冻水合生物样品的方法。一个主要的好处是，样品冷冻断裂和涂层，没有连续的步骤后直接检查。这是在不同的相对含水量（RWC）植物的调查尤为重要，因为他们的水合状态，制备过程中保持不变。怎么样以往，人们关键缺点是，当在高放大倍率，光合复合物的大小的精确测量需要扫描冷冻水合样品可从光束损坏成像期间遭受，更是如此。为了克服这一点，一种方法被称为"双层涂层^{'（DLC）27,28}与分别利用特定冷冻SEM成像条件相结合。这导致那些显著光束敏感较少样本和允许的有价值的信息，对光合蛋白质超分子组织和复苏植物C.其他细胞成分的阐明细叶 在原地高放大倍率。

叶片组织1.超低温固定用高压冻结

注意:本节介绍了如何进行叶片组织的高压冻结的冻结破裂实验。对于与植物样品的考虑看^29。这可以适用于其他类型的组织或样品与一些修改。

1. 使用刀片的角，挠0.1 / 0.2 mm铝血小板的0.1毫米空腔的底部（ 图1）。至少准备一打血小板（6个样本）。采取小心不要在盘的圆周创建刀痕。
   1. 搔抓后，洗碟无水乙醇，让他们干，保持一个干净的菜。
2. 根据制造商的说明制备高压冷冻机。填充用异丙醇高压冷冻机的酒精室。
3. 制备自制真空辅助infiltratioÑ​​设备来替换与液体的叶组织中发现的气体。
   1. 紧紧一个200μl的移液管尖端连接到10毫升注射器的端部。切断〜1厘米尖。使在1.5ml微量离心管的盖，以一个孔紧密地配合切割尖端。真空可在管内通过拉动注射器的柱塞被创建。
4. 从使用刀片的植物切一小片叶子并用镊子放置一个离心管中一半填充有1-十六内的叶。通过轻轻拉动柱塞创建真空渗入与液体叶子的细胞间隙，保持约30秒，然后缓慢释放柱塞。
5. 删除用镊子管中的叶片。修剪用刀片的情况下，它是0.2mm以上厚的叶和切一小片，将适合成血小板。
6. 将一个洁净的血小板与抓伤的一面朝上放入冻机的支架，然后将切下的乐AF成血小板。填充周围用1-十六叶的剩余空间。使用其他血小板关闭三明治，但面向叶划痕。
7. 关闭并拧紧固定器，并将其插入到机器的腔。然后按'喷气机'按钮冻结（〜2100条300 - 500毫秒），并迅速持有者转移到液氮中。使用预冷却的镊子，小心不要折断夹心从支架小心取出冷冻的三明治。
   注意事项:密闭冷冻三明治可以冻结裂隙立即或保存在供以后使用液氮。液氮操作时，使用的防护服和护目镜。

2.冷冻断裂和双层涂层^27,28

1. 制备冷冻断裂机的使用，包括枪为铂/碳（铂/ C）和碳的蒸发，根据制造商的说明。放置的Pt / C枪在45度的次在90度的碳枪。
   1. 预编程的Pt / C（涂敷速度0.02 - 0.04纳米/秒）的2纳米层的一个涂覆方案和碳的6纳米层（在〜0.1纳米/秒）。
      1. 进入冷冻断裂机的屏幕上的安装。选择在哪里，该涂层方案将被保存在用户数。
      2. 选择的Pt / C为"1层"。选择一个时间框架， 例如 ，5分钟（超过完成涂层所需的必要的时间）。使用上下箭头来定义的厚度为2纳米。
      3. 按"层"按钮移动到2层重复步骤2.1.1.2，只不过选择碳和定义，厚度为6纳米。
   2. 测试和调整喷枪作业。
      1. 选择"图层1"。按"GUN1"按钮选择的Pt / C枪，然后按冷冻断裂机的蒸发器上的"打开"按钮。监视蒸发速率和使用的电压和发射旋钮UNT调整它IL达到0.02的速率 - 0.04纳米/秒。按"OFF"关闭的Pt / C的枪。
      2. 选择"2层"。重复2.1.2.1，除了选择'GUN2'并调整为0.1nm /秒的〜的蒸发速率。
2. 酷（分别为水合或脱水叶）冷冻断裂系统的阶段-140℃或-160˚C。装上真空冷冻班车服务的机器，并用液氮填补其室。毫巴^-7 8×10 -压在冷却冷冻断裂室通常在1之间。
3. 插入冷冻压裂试样保持器（适合于3毫米血小板）到装载站。洪水用液氮装载站室中。
4. 采用高精度等级镊子一个装载两个冷冻三明治到持有人之一。拧紧第一块三明治到支架，然后翻转持有人过来检查到位牢固地安装。重复第二个三明治。
5. ðetach从冷冻断裂机冷却班车和它连接到装载站。打开梭阀，引进收回臂插入支架，并将其锁定到位。重新引入与保持到穿梭臂以及使用该装载站旋钮关闭梭阀。附加穿梭于冷冻断裂机和引入保持件与所述收回臂的腔室。从分离机的班车。
6. 对准冷冻断裂切片刀的高度，使得其将敲落三明治的顶端血小板。
7. 随着切片刀，迅速突破了三明治，然后立即提出来，以防止样品污染的碎片执着刀，并把新暴露的平面上方的冷却快门由水分子免受可能的污染样品室中。
8. 大衣搭配铂和碳样本。
   1. 输入"图层1"的SC颖。按"GUN1"按钮，然后按"ON"按钮打开的Pt / C的枪。审查的蒸发速率和一旦达到0.02 - 0.04纳米/秒，同时暴露出样品，并按下"测量"按钮来监测沉积层的厚度。
      注:当厚度已经达到了预选值枪会自动关闭。
   2. 盖与快门样本时完成的Pt / C的蒸发。
   3. 按"层"按钮移动到"2层"。重复步骤2.8.1和2.8.2，以选择"GUN2'（碳）和0.1纳米/秒的〜的蒸发速率的异常。
9. 温冷冻断裂系统的阶段-120˚C。

3.超低温扫描电子显微镜

1. 制备用于低温工作的扫描型电子显微镜。
   1. 从主菜单，确认选择舞台/舞台初始化。
   2. 选择工具/ GOTO面板，并从列表中选择打开"气密室"面板。点击"关闭柱箱阀门"按钮。通过点击"真空"选项卡下的通风排气按钮，在显微镜室。
   3. 选择工具/转到面板，打开"阶段点列表"面板。选择低温交换位置向载物台移动到正确的坐标用于接收试样架。注意:"低温交换位置"被预设为在对准与真空传送单元的位置。
   4. 开用干净的一对手套的试样腔室和插入低温阶段到显微镜的主要阶段。关闭室，然后点击"真空"标签下泵按钮。
   5. 酷显微镜-120˚C。填写显微镜用杜瓦瓶液氮。激活低温传送控制单元上的热作用到-120˚C一旦阶段的温度低于-120˚C。
2. ATTACH的低温传送梭显微镜并使用收回臂进入显微镜低温阶段（如在步骤2.5）传送样品架。分离从显微镜的班车。
3. 点击气密室面板中的"打开柱箱阀门"按钮。
4. 小心移动样品支架接近物镜（工作距离1 - 2mm）的使用操纵杆。选择在"孔径"选项卡10微米的孔径。在"枪"选项卡中双击EHT领域。输入10（千伏）的EHT目标，然后单击确定。点击底部EHT标签，选择"EHT开"。
5. 在"探测器"选项卡中选择从检测器下拉列表"InLens"。优化成像条件（对焦，亮度和对比度，光束对准，散光）为宜。
6. 点击"扫描"选项卡。选择一个快速扫描（"扫描速度= 1'，对应于100纳秒每像素的驻留时间），以最小化光束的损坏，并1,024×768像素一个"存储分辨率"。在"降噪"下拉列表中选择"平均线"。 N的值调整为20 - 30线搜索。使用"中心站"的功能（通过按下键盘上的控制标签）来搜索与裂隙细胞和叶绿体（ 图2A和2B）的区域移动样品。
7. （ - 70的kX 50）（ 图2C和2D）在低放大倍率获得裂缝叶绿体的图像。使用（按键盘上的控制移选项卡）的'中心功能'功能放大到有趣叶绿体裂缝面，在高放大倍率获取图像（100 - 200的kX， 图3和图4）。使用相同的参数，在步骤3.6图像采集，但改线平均价值N> 100降噪^30。
   1. 主显微镜控制单元上或在"扫描"选项卡按冻结，停止扫描并保存按"保存TIFF"按钮图像。

4.图像分析

注意:本节介绍使用斐济³¹开源包冷冻断裂的SEM图像颗粒膜分割一小段程序。类似的结果可以与其他图像分析软件来获得。

1. 通过拖动图像文件到主程序窗口斐济打开图像。通过选择图像/类型/ 8位图像转换为8位。选择图像/调整/亮度/对比度和根据需要调整（ 图5A）。
2. 采用直线工具画一条线嵌入图像比例尺的大小。选择分析/设置比例。输入正确的档位信息（长度已知的距离和单位），然后单击确定。保存此调整缩放后的图像。
3. 选择Process /过滤器/高斯模糊（1.5纳米半径），并单击OK（ 图5B）。
4. 选择图像/调整/ AUTØ局部阈值（使用Niblack法）并单击OK（ 图5C）。
5. 选择编辑/翻转，然后再处理/二进制/流域（ 图5D）。
6. 绘制手绘选择工具感兴趣区域（ROI）的区域周围的边框。通过选择编辑/选择添加选择的投资回报率经理/添加到管理器或通过点击"T"。
7. 选择编辑/清除外（ 图5E）。
8. 选择分析/集测量，选择合适的参数 （ 如面积，配合椭圆形）。
9. 选择分析/分析颗粒。输入一个适当的范围颗粒的尺寸和标记"显示结果"，"添加到管理器"，如果有必要，"排除在边缘"选项，然后单击确定。该结果示于图5F。
10. 打开保存的缩放成像文件（步骤4.2）。选择"显示所有"，并在投资回报率经理取消选择"标签"。查看所选partic莱放置到原始图像和手动添加或使用"添加"或"删除"的投资回报率经理的按钮移除选项。更正通过使用写意选择工具和投资回报率经理（ 图5G和5H）的"更新"按钮，任何必要的选择。
11. 分析使用所获得的测量数据。在结果窗口中，单击结果/总结获得，例如平均面积，平均主要和投资回报率管理器中列出的粒子的短轴。点击结果/配送，选择参数（例如面积），然后单击确定以查看该参数的直方图。

图1显示了包含高压冻结，冻结，割断Craterostigma细叶叶片血小板冷冻SEM图像。在一些样品中，裂缝单元的大区域被获得（ 图1A）。在其他情况下，叶片保持紧密结合到上盘并与它一起（ 图1B）脱落。然而，即使在第二种情况下，某些叶组织可保持附着在血小板（ 图1B，箭头）和数据的相当数量的刀槽仍可以通过成像叶"残余"被收集，提供它们断裂。成功的断裂被发现后，将细胞的低倍的图像获取的识别感兴趣的区域，在这种情况下，叶绿体（ 图2）。

在C类囊体膜的更高倍率的图像细叶叶示于图3和4，这四个不同的断裂面，EFS EFU，PFS和PFU，可以区分（ 图3）。光系统II（PSII），这是在膜中发现的最大的蛋白质复合物，位于两个的EF（基粒）和EFU（基质片层）。在水合条件下，PSII密度在EF文件比EFU（〜1550络合物微米^-2 与 〜550配合微米^-2， 图3）更高〜3倍。这是这两个连续的面区分一的基础。另一个是在其背景的差别。同时的EF背景显示光滑，EFU面是粗糙的，并且包含有分离的PSI复合物，其断裂的互补面，所述PFU ^10（ 图3）的足迹孔。用于从类囊体膜的的EF面PSII络合物的分割的例子示于图5。

图1.低倍率的Cryo-SEM血小板图像与冻结，割断 C.一个C的细叶 叶件。（A）大的区域断裂细胞（虚线） 细叶叶。 （B）叶片打掉，顶血小板，但一些叶组织仍然附着在底部血小板刀痕（箭头标出其中的一些）。围绕叶片的区域被冻结1-十六（星号）。比例尺:200微米请点击此处查看该图的放大版本。

图3.植物组织内囊体膜的超分子组织骨折叶绿体中的类囊体不同的裂缝面可以看出:无论堆叠（EFS）和拆散（EFU）膜区的exoplasmic裂缝面（EF）含有光系统II （PSII）配合;堆放区的原浆裂缝面（PFS）中含有PSII，LHCII的周边捕光天线复合物;光系统I（PSI）和ATP合酶骨折拆散地区的原浆裂缝面（PFU）;细胞色素b ₆ F 骨折既PFS和PFU。图像203的kX的倍率（水平视场= 1.45微米）的扫描。比例尺:100纳米请点击此处查看该图的放大版本。

图4.变化光系统II C. 组织脱水过程中 细叶的EF面临在不同的RWC植物类囊体膜的:（A）的100％;（B）〜40％，（C）〜15％，和（D和E）5 - 10％。脱水过程中，PSII中的EF密度面对逐渐下降，从1500〜复合微米^-2（一）〜700微米的复合物^{-2（〜15％RWC，C）。}值得注意的是，在干燥的条件（5 - 10％RWC），一些PSII复合组织到行和数组（D和E，箭头）。箭头（E），标志着将PFS脸，LHCII天线看似也行主办，其间PSII行将互补的EF被发现。有关此数据的其他信息，请参阅^24。比例尺:100纳米请点击此处查看该图的放大版本。

图5为例进行分割光系统II颗粒。使用斐济开源包，蛋白质复合物可以从图片包含有几个步骤（完成该协议部分的第4部分中发现的详细过程）分段。图像（A，原始图像）与高斯滤波器（B）模糊;该图像是使用一个自动本地个阈值化reshold工具（C）;图像被反转并且分水岭算法是为了在紧密接触（D）的发现单独的对象施加;感兴趣的区域被选择和外面被清除（E）; （用户定义的大小范围内）的颗粒所使用的颗粒分析器功能中选择。将所得掩模示于（F）。颗粒被添加到的ROI管理器和覆盖在原始图像（G）中，以检查是否有错误或故障或遗漏的颗粒。 ROI的名单可以手动修改，替换，删除或添加新的ROI，适当。最终用户编辑的选择示于（H）。比例尺:200纳米请点击此处查看该图的放大版本。

本文中所描述的技术允许保存完好的高压冷冻的植物组织的由低温扫描电子显微镜的范围内冻结，割断膜调查。使用这些程序的主要优点是样品制备是纯物理;涉及化学品或脱水任何步骤是必要的。因此，它可以在一个近乎原生状态^26,32研究生物结构。用叶组织的好处是，可以得到在整体蜂窝组织的信息，以及作为研究特定的膜，如类囊体膜，其天然生理环境， 即内，叶绿体内。另一个优势，迫切需要研究C.在不同的相对含水量（RWC） 细叶植物，是他们的水合状态不准备期间改变。这是相对于利用分离叶绿体或类囊体膜作为原料对于冻结破裂试验。在后者，人们还必须考虑到一些结构和/或超分子改变可能采取在细胞器/膜隔离的地方。

植物组织样品，这是相对厚的工作[> 50 - 100微米，并且可以根据组织和物种的类型显著较厚]，决定冷冻（HPF）为样品的玻璃化使用高的压力。高压[2100巴]，在该水的熔融温度为约-22℃，应用影响水的氢键网络，使得其减慢的冰晶体形成的速率。因此，获得一种玻璃化的样品的机会是，即使在相对慢的冷却速度高。 HPF是目前可用于厚玻璃化的唯一方法，但不超过200微米的样品。对于HPF植物组织的一个关键步骤是用一种惰性的细胞间的空气空间的渗透4;空间填料"冷冻前，为了防止在高压下组织崩溃（参见评论^29,33）在C.细叶叶，其厚度可以高达1毫米的情况下，叶也必须被修整或先于HPF变薄。

从本质上讲，复制品制备¹⁸的技术也可以适用于冷冻断裂叶组织。然而，在我们的经验，没有得到完好断裂地区足够的产量，因为副本往往片段小块。此外，搜索感兴趣的特定区域，如叶绿体可以是植物组织的零散副本内不切实际的。这主要是因为叶肉（光合）的细胞含有一个大的中央液泡一狭细胞质带（ 图2A），它包括细胞核，叶绿体和所有其它细胞器所包围的。因此，叶绿体仅代表总裂缝面积的一小部分叶肉组织。冷冻断裂样品的冷冻SEM成像提供了一个解决这个问题，因为样品被直接可视以下骨折（和涂层/阴影）。但是，这种方法从冷冻的水合的样品在高放大倍率容易损害在第一次扫描的样品是光束敏感，因而扫描的限制受到影响。双层涂层^{（DLC）27,28}提供了一个解决这个严重的缺点。

在DLC，断裂的样品涂在类似他们如何是副本准备的一种方式。首先，一薄层 - 的Pt / C（1 3毫微米）蒸发到样品上，提供对比度和导电性。这之后是一个较厚的（5 - 10纳米），碳的保护层。 DLC具有高加速电压（10千伏）联合用于使用背散射电子（BSE）信号²⁸图像样本。 BSE信号，从铂层始发允许通过碳获得表面信息和，可能的话，水蒸汽污染物层，其实际上是透明的疯牛病在高加速度电压（水的污染积累在其中一个真空冷冻传送单元不使用与断裂面被暴露于大气中的实验中，即使这为几分之一秒）。此外，使用BSE信号摄像最小的充电装置，它是在二次电子（SE）检测²⁷表观效应问题。与这里所描述的显微镜设置，以在10千伏的In-透镜SE检测器SE的信号的成像产生相当于当样品用2只涂覆获得的信息 - 的Pt / C的3纳米和在低加速电压成像。所不同的是由类金刚石制备和成像为所述样品相当少束敏感。这使我们以高放大倍数，而且在许多情况下甚至反复进行扫描，并允许获得对光合蛋白supramolecul有价值的信息AR组织和其他细胞成分（ 图2 - ^4）24。

最后，这里描述的过程可以被修改以研究其他类型的样品的结构和/或膜蛋白的组织。我们已经成功地采用技术来研究光合膜的蓝藻和藻类细胞的超分子组织（Shperberg，主治医生等人未公布的数据）。主要考虑的是找到具有薄的样品成为可能，以增加用于玻璃化的机会之间的平衡，同时保持样品完整性。对不同类型的样品，其可以是混悬液或动物/植物组织，不同的包装应使用（ 例如 ，在用于高压冷冻利用血小板的类型方面）。一旦成功低温固定实现时，冷冻断裂，DLC和低温扫描电镜成像的组合提供了一种获得的Infor极好装置在高放大倍率最小束损伤息对膜蛋白组织。

The authors declare they have no competing financial interests.

我们感谢安德烈Kaech（苏黎世大学）为他的扫描电子显微成像有用的建议。这项工作是由美国 - 以色列两国农业研究和发展基金（批准号:US-4334-10，ZR），以色列科学基金会（批准号:1034年至1012年，ZR），和人类前沿科学计划支持（RGP0005 / 2013，ZR）。透射电镜研究在欧文和Cherna莫斯科维茨中心纳米和生物纳米成像在魏茨曼科学研究所进行。