El estudio de la Organización Supramolecular de membranas fotosintéticas dentro de los tejidos foliares fracturados-Freeze por Cryo-Microscopía Electrónica de Barrido

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

microscopía electrónica de Cryo-barrido (SEM) de las muestras de congelación-fractura permite la investigación de estructuras biológicas en condiciones nativas cerca. A continuación, describimos una técnica para el estudio de la organización supramolecular de fotosintéticos membranas tilacoides () dentro de las muestras de hojas. Esto se consigue mediante la congelación de alta presión de tejidos de las hojas, congelación-fractura, recubrimiento de doble capa y, finalmente, formación de imágenes cryo-SEM. El uso del método de recubrimiento de doble capa permite la adquisición de gran aumento (> 100,000X) imágenes con daño haz mínimo para las muestras congeladas hidratado así como los efectos de carga mínimas. Utilizando los procedimientos descritos investigamos las alteraciones en la distribución del fotosistema supramolecular y proteínas antena captador de luz complejos que tienen lugar durante la deshidratación de la planta de la resurrección Craterostigma pumilum, in situ.

fotosíntesis oxigénica, originarios de la antigua cianobacterias, fue heredado por las algas y las plantas de la tierra por los acontecimientos que llevaron a endosymbiotic desarrollo del cloroplasto. En todos los oxigénica fototrofas de hoy en día, el transporte de electrones fotosintética y la generación de la fuerza protón-motriz y el poder reductor se llevan a cabo dentro de las vesículas en forma de sacos aplanados denominadas membranas tilacoides ''. Estas membranas albergan los complejos de proteínas que llevan a cabo las reacciones impulsada por la luz de la fotosíntesis y proporcionan un medio para la transducción de energía. Las membranas de los tilacoides de plantas y (algunos) las algas se diferencian en dos dominios morfológicas distintas: las regiones de membrana fuertemente adpresas llamados «grana» y las membranas apiladas que interconectan la grana, llamados 'estroma laminillas ^«1. Se han realizado diversos estudios de congelación-fractura de la planta y membranas tilacoides de algas, a partir de la década de 1970. Cuando por congelación fracturado, membranasdividir a lo largo de su núcleo hidrofóbico ^2, generando una cara exoplasmic (EF) y una cara protoplasmática (PF), en función del compartimento celular que las fronteras de entramado de membrana, como acuñado originalmente por Branton et al. . en 1975 ³ Planta y tilacoides de algas tienen cuatro diferentes caras de fractura: los EF, EFU, SLP y la UFP, con 's' y que denotan y regiones de membrana '' 'no apiladas apilados' 'U', respectivamente. Los complejos de proteínas de membrana, que no se dividen o se rompe, tienen la tendencia a permanecer ya sea con el E o P lado de la membrana. Las observaciones iniciales de que las diferentes caras de fractura de los tilacoides contienen partículas de diferentes tamaños y densidades ^4, y las numerosas investigaciones que siguieron, condujeron a la identificación y correlación entre las partículas observadas y los complejos de proteínas de membrana que llevan a cabo las reacciones de luz ^5-13 (véase también revisa ^14,15).

Freexperimentos eze-fractura de membranas tilacoides se llevan a cabo normalmente en preparaciones de cloroplastos o membranas tilacoides aisladas (pero véase ^16,17), con el riesgo de cualquier alteración en la organización estructural y / o supramolecular que pueda ocurrir durante el procedimiento de aislamiento. Después de la fractura, las réplicas se preparan por evaporación de platino / carbono (Pt / C), a continuación, por una gruesa capa de carbono (C), y finalmente digestión del material biológico ^18. Réplicas se visualizan por microscopía electrónica de transmisión (TEM). La técnica tradicional de congelación-fractura-réplica continúa sirviendo como una herramienta importante para el estudio de la organización supramolecular de las membranas fotosintéticas y su adaptación a las diferentes, por ejemplo., La luz, las condiciones de ^19-23.

En nuestro reciente estudio de la planta de la resurrección homoiochlorophyllous Craterostigma pumilum ^24, que tuvo como objetivo investigar los cambios en la organización supramolecular omembranas tilacoides f, así como en la organización celular en general, durante la deshidratación y la rehidratación. La singularidad de las especies de resurrección homoiochlorophyllous es que son capaces de sobrevivir a las condiciones de desecación en sus tejidos vegetativos (hojas), al tiempo que conserva su aparato fotosintético. Una vez que se dispone de agua, estas plantas recuperar y reanudar la actividad fotosintética en cuestión de horas a unos pocos días ^25. Para este estudio, EM crio-barrido (SEM) de imágenes de muestras de hojas de congelación-fractura se combinó con alta presión de congelación para la muestra crio-inmovilización. Estos procedimientos proporcionan un medio para visualizar muestras biológicas congelados-hidratados en un estado cercano a su estado natal ^26. Un beneficio principal es que las muestras se examinan directamente después de congelación-fractura y revestimiento sin pasos sucesivos. Esto es particularmente pertinente para la investigación de las plantas en diferentes contenidos de agua relativos (RWC), ya que su estado de hidratación se mantiene durante la preparación. Cómosiempre, una desventaja fundamental es que las muestras congeladas hidratado pueden sufrir de daño haz durante la exploración, especialmente cuando se escanea con grandes aumentos, necesarias para la medición precisa del tamaño de los complejos fotosintéticos. Para superar esto, un método llamado "recubrimiento de doble capa '(DLC) ^27,28 combinado con se utilizaron condiciones específicas de formación de imágenes cryo-SEM. Estos dieron lugar a muestras que son significativamente menos sensibles a la viga y se dejan para el esclarecimiento de información valiosa sobre la organización supramolecular proteína fotosintética y otros constituyentes celulares de la planta de la resurrección C. pumilum con grandes aumentos en situ.

1. Cryo-fijación de tejidos de hojas por medio de congelamiento de alta presión

Nota: En esta sección se describe cómo llevar a cabo la congelación de alta presión de los tejidos de las hojas para un experimento de congelación-fractura. Por consideraciones relacionadas con muestras de plantas ver ^29. Esto se puede adaptar para otros tipos de tejidos o muestras con alguna modificación.

1. El uso de la esquina de una hoja de afeitar, rayar la parte inferior de la cavidad de 0,1 mm de una plaqueta de aluminio 0,1 / 0,2 mm (Figura 1). Preparar al menos una docena de plaquetas (6 muestras). Tome la precaución de no crear marcas de cuchillo en la circunferencia del disco.
   1. Después de rascarse, lavar los discos en etanol absoluto, dejarlos secar y guardar en un plato limpio.
2. Preparar la máquina de congelación de alta presión de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Llene la cámara de alcohol de la máquina de congelación de alta presión con isopropanol.
3. Preparar una infiltratio asistida por vacío caseron dispositivo para reemplazar el gas que se encuentra en el tejido de la hoja con el líquido.
   1. conectar firmemente una punta de pipeta 200 l al final de una jeringuilla de 10 ml. Cortar ~ 1 cm de la punta. Hacer un agujero en la tapa de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a encajar con firmeza la punta de corte. De vacío puede ser creado en el interior del tubo, tirando del émbolo de la jeringa.
4. Cortar un pequeño trozo de hoja de la planta utilizando una cuchilla de afeitar y con pinzas colocar la hoja en el interior de un tubo de microcentrífuga medio lleno con 1-hexadeceno. Infiltrarse en los espacios intercelulares de la hoja con el líquido tirando suavemente el émbolo para crear el vacío, mantenga durante unos 30 segundos, y luego liberar lentamente el émbolo.
5. Retire la pieza de la hoja del tubo con unas pinzas. Recorte la hoja con una hoja de afeitar en caso de que es más gruesa que 0,2 mm y cortar un pedazo pequeño que quepa en una plaqueta.
6. Colocar una plaqueta limpia con la cara arañada en el soporte de la máquina de congelación y luego colocar la pieza cortada de leaf en la plaqueta. Llenar el espacio restante que rodea la hoja con 1-hexadeceno. Cerrar el sándwich utilizando otro plaquetas, con los arañazos que se enfrenta la hoja.
7. Cierre y apriete el soporte y la inserta en la cámara de la máquina. A continuación, pulse el botón 'Jet' para congelar (~ 2.100 bares durante 300 - 500 ms), y transferir rápidamente el soporte en nitrógeno líquido. Retirar con cuidado el sándwich de helado del soporte con unas pinzas pre-enfriado, teniendo cuidado de no fracturar el sándwich.
   Nota: bocadillos congelados cerrado puede ser helada fracturada inmediatamente o guardado en nitrógeno líquido para su uso posterior. Use ropa protectora y gafas de protección al manejo de nitrógeno líquido.

2. Freeze-fractura y doble capa de revestimiento ^27,28

1. Preparar la máquina de fractura por congelación para su uso, incluyendo tanto los cañones para la evaporación de platino / carbono (Pt / C) y de carbono, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Coloque la pistola de Pt / C a 45 grados unand la pistola de carbono a 90 grados.
   1. Pre-programa de un sistema de protección de una capa de 2 nm de Pt / C (velocidad de revestimiento 0,02-0,04 nm / sec) y una capa de 6 nm de carbono (a ~ 0,1 nm / seg).
      1. Entrar en la configuración en la pantalla de la máquina de congelación-fractura. Seleccionar un número de usuario donde se guardará el sistema de protección.
      2. Elija Pt / C de 'capa 1'. Seleccione un marco de tiempo, por ejemplo., 5 min (para superar el tiempo necesario necesario para completar el recubrimiento). Utilice las flechas arriba-abajo para definir un espesor de 2 nm.
      3. Pulse el botón 'Capa' para mover a la Capa 2. Repita el paso 2.1.1.2, excepto que seleccione carbono y definir un espesor de 6 nm.
   2. Probar y ajustar el funcionamiento del arma.
      1. Seleccione 'capa 1'. Seleccione la pistola Pt / C pulsando el botón 'gun1' y presione el botón "ON" en la unidad de control de la evaporación de la máquina de congelación-fractura. Monitorear la tasa de evaporación y ajustarlo mediante los mandos de tensión y de emisión until alcanzando una tasa de 0,02 - 0,04 nm / seg. Presione "OFF" para apagar la pistola de Pt / C.
      2. Seleccione 'Capa 2'. Repita 2.1.2.1, excepto 'GUN2' para seleccionar y ajustar una velocidad de evaporación de ~ 0,1 nm / seg.
2. Se enfría la etapa de congelación del sistema de fracturas a -140 ºC o -160 ° C (para hojas hidratadas o deshidratadas, respectivamente). Una el servicio de traslado al crio de vacío a la máquina y llenar su cámara con nitrógeno líquido. La presión en la cámara de congelación-fractura enfriado es por lo general entre 1 - 8 x 10 ^-7 mbar.
3. Inserte un soporte de muestras congelación de fracturación (adecuado para las plaquetas de 3 mm) en la estación de carga. Inundar la cámara de la estación de carga con nitrógeno líquido.
4. Cargar dos bocadillos congelados sobre el titular de uno por uno con unas pinzas de grado alto de precisión. Apretar el primer sándwich en el soporte y luego darle la vuelta al titular a comprobar que se ajusta de forma segura en su lugar. Repita para el segundo sándwich.
5. reEtach el servicio de transporte refrigerado de la máquina de fractura por congelación y conectarlo a la estación de carga. Abra la válvula de doble efecto, introducir el brazo de retracción en el soporte y bloquearlo en su sitio. Reintroducir el brazo con el soporte en el servicio de transporte y cierre la válvula de doble efecto con el mando de la estación de carga. Una el servicio de transporte a la máquina de congelación-fractura e introducir el soporte en la cámara con el brazo de retracción. Separar el servicio de transporte de la máquina.
6. Alinear la cuchilla del micrótomo fractura de congelación a una altura tal que va a golpear de las plaquetas superiores de los sándwiches.
7. Con el cuchillo microtomo, se rompe con facilidad los sándwiches, e inmediatamente después levantarlo para evitar la contaminación de las muestras por el apego escombros para el cuchillo, y girar el obturador enfriado por encima del plano recién expuesta para proteger las muestras de la posible contaminación por moléculas de agua en la Cámara.
8. Cubrir las muestras con platino y carbono.
   1. Entre 'capa 1' en la screen. Encienda el arma Pt / C pulsando el botón 'gun1' seguido por el botón 'ON'. Examinar la tasa de evaporación y una vez que se alcanza de 0.02 - 0,04 nm / seg, al mismo tiempo exponer las muestras y pulse el botón "Medir" para controlar el espesor de la capa depositada.
      Nota: Pistola se apagará automáticamente cuando el espesor se ha alcanzado el valor preseleccionado.
   2. Cubrir las muestras con el obturador cuando se completa Pt / C evaporación.
   3. Pulse el botón 'Capa' para pasar a "capa 2 '. Repetir los pasos 2.8.1 y 2.8.2, con la excepción de la selección 'GUN2' (por carbono) y una velocidad de evaporación de ~ 0,1 nm / seg.
9. Se calienta la fase del sistema de fracturas congelación a -120 ° C.

3. Cryo-Microscopía Electrónica de Barrido

1. Preparar el microscopio electrónico de barrido para el trabajo crio.
   1. Seleccione la etapa / de la etapa de iniciación en el menú principal y confirme.
   2. Seleccione Herramientas / Goto Panel, y abra el panel "bolsa de aire", seleccionándolo de la lista. Haga clic en el botón "Cerrar Columna cámara de la válvula. Ventilar la cámara microscopio haciendo clic en el botón de Vent bajo la etiqueta de 'vacío'.
   3. Seleccione Herramientas / Panel de Goto, y abra el panel "Lista de Puntos de Stage. Seleccione la posición de intercambio de la crio para mover la etapa a las coordenadas apropiadas para aceptar el soporte de muestra. Nota: La posición de intercambio crio 'está programado para estar en alineación con la posición de la unidad de transferencia de vacío.
   4. Abrir la cámara de muestras con un par de guantes limpios e inserte la etapa crio en el escenario principal del microscopio. Cerrar la cámara y haga clic en el botón de la bomba bajo la pestaña de vacío '.
   5. Se enfría el microscopio para -120 ° C. Llenar el microscopio Dewar con nitrógeno líquido. Active la función de calor en la unidad de control de la crio-transferencia a -120 ° C una vez que la temperatura de la fase desciende por debajo de -120 ° C.
2. attACH del transbordador crio-traslado al microscopio y transferir el soporte de la muestra utilizando el brazo de retracción en la platina del microscopio crio (como en el paso 2.5). Separar el transporte desde el microscopio.
3. Haga clic en el botón 'Open Columna cámara de válvula' en el panel de bolsa de aire.
4. mover con cuidado el soporte de la muestra cerca de la lente objetivo (distancia de trabajo de 1 - 2 mm) utilizando el joystick. Seleccione una abertura de 10 micras en la pestaña '' Las aberturas. Haga doble clic en el campo EHT en la pestaña 'Gun'. Introduzca 10 (kV) para el objetivo EHT y haga clic en OK. Haga clic en la pestaña EHT inferior y seleccione 'EHT On'.
5. Seleccionar '' InLens de la lista desplegable de detectores en la pestaña 'Detectores'. Optimizar las condiciones de formación de imágenes (enfoque, brillo y contraste, alineación del balancín, astigmatismo), según proceda.
6. Haga clic en la pestaña 'escaneado'. Elija una exploración rápida ( "Velocidad de exploración = 1 ', que corresponde a un tiempo de permanencia de 100 nseg por píxel) para minimizar el daño del haz, yuna "resolución de la tienda 'de 1.024 x 768 píxeles. Seleccione 'Línea Promedio' en la lista desplegable 'Reducción de ruido'. Ajuste el valor de N a 20 - 30 líneas para la búsqueda. Mover la muestra usando la función 'Centre Point' (pulsando Control-Tab en el teclado) para buscar regiones con células fracturadas y cloroplastos (Figuras 2A y 2B).
7. Adquirir imágenes de los cloroplastos fracturados a bajos aumentos (50 - 70 KX) (Figura 2C y 2D). Utilice la función de 'Centro de funciones' (pulsando Control + Mayúsculas-Tab en el teclado) para hacer zoom en las caras de fractura interesantes cloroplasto y adquirir imágenes con grandes aumentos (100 - 200 kX, las Figuras 3 y 4). Utilizar los mismos parámetros que en el paso 3.6 para la adquisición de imágenes, pero cambiar el valor medio de la Línea N> 100 para la reducción de ruido ^30.
   1. Pulse Freeze en la unidad principal de control microscopio o en la pestaña 'escaneado' para detener el escaneo y guardarla imagen pulsando el botón "Guardar TIFF '.

Análisis 4. Imagen

Nota: En esta sección se describe un procedimiento corto para la segmentación de las partículas de membrana de congelación-fractura imágenes de SEM utilizando el paquete de código abierto Fiji ^31. Resultados similares pueden obtenerse con otro software de análisis de imágenes.

1. imagen abierta con Fiji arrastrando archivo de imagen en la ventana principal del programa. Convertir la imagen a 8 bits mediante la selección de la imagen / Tipo / 8 bits. Seleccionar Imagen / Ajustar / Brillo / Contraste y ajuste si es necesario (Figura 5A).
2. Con la herramienta Línea Recta, dibujar una línea del tamaño de la barra de escala de la imagen incrustada. Seleccione Analizar Escala / Set. Introduzca la información de escala apropiada (distancia conocida y la unidad de longitud) y haga clic en OK. Guardar esta imagen a escala ajustada.
3. Seleccione Proceso / Filtros / desenfoque gaussiano (1,5 NM de radio) y haga clic en OK (Figura 5B).
4. Seleccionar Imagen / Ajustar / AutUmbral o local (utilizando el método de Niblack) y haga clic en OK (Figura 5C).
5. Seleccione Editar / Invertir y luego Proceso / Binario / cuencas (Figura 5D).
6. Dibujar un borde alrededor de la región de interés (ROI) con la herramienta Selección a mano alzada. Añadir la selección al gestor de retorno de la inversión al seleccionar Editar / Selección / Añadir a Manager o haciendo clic en 'T'.
7. Seleccione Editar / Borrar el exterior (Figura 5E).
8. Seleccione Analizar / mediciones indicadas, elegir los parámetros adecuados (por ejemplo, superficie, en forma de elipse).
9. Seleccione Analizar / Analizar partículas. Introduzca un rango apropiado para el tamaño de las partículas y marcar "Mostrar resultados", "Añadir al Administrador 'y, de ser necesario, el' Excluir 'en los bordes opción y haga clic en OK. El resultado se muestra en la Figura 5F.
10. Abrir el archivo guardado fotografiado reducido (paso 4.2). Seleccione 'Mostrar todos' y anular la selección de "etiquetas" en el Administrador de retorno de la inversión. Revisar la partic seleccionadoles deposita sobre la imagen original y añadir o eliminar selecciones mediante el uso de la 'Añadir' o 'Eliminar' botones del Administrador de retorno de la inversión de forma manual. Corregir las selecciones necesarias mediante el uso de la herramienta Selección a mano alzada y el botón de "actualización" del Administrador de retorno de la inversión (figuras 5G y 5H).
11. Analizar los datos utilizando las mediciones obtenidas. En la ventana de resultados, haga clic en Resultados / Resumir para obtener, por ejemplo, el área media, y la media de Major y Minor ejes de las partículas que figuran en el Administrador de retorno de la inversión. Haga clic en Resultados / Distribución, seleccione un parámetro (por ejemplo, la zona) y haga clic en OK para ver un histograma para este parámetro.

La Figura 1 muestra imágenes Cryo-SEM de plaquetas que contienen congelados, trozos de hojas pumilum Craterostigma fracturadas por congelación de alta presión. En algunas muestras, grandes regiones de células fracturadas se obtienen (Figura 1A). En otros, la pieza de la hoja se mantiene fuertemente unido al disco superior y está derribado junto con él (Figura 1B). Sin embargo, incluso en el segundo caso, una parte del tejido de la hoja puede permanecer unido a las ranuras de cuchillo en la plaqueta (Figura 1B, puntas de flecha) y una buena cantidad de datos todavía pueden ser recogidos por imágenes de la hoja "restos", siempre que se fracturaron. Después se encontró fractura éxito, las imágenes de bajo aumento de las células se adquieren para identificar regiones de interés, en este caso los cloroplastos (Figura 2).

Las imágenes de mayor aumento de las membranas tilacoides en C. pumilum las hojas se muestran en las figuras 3 y 4. Las cuatro caras de fractura diferentes, EFS, EFU, SLP y la UFP, se pueden distinguir (Figura 3). Fotosistema II (PSII), que es el mayor complejo de proteína que se encuentra en las membranas, se encuentra tanto en las EF (grana) y EFU (estroma laminillas). En condiciones hidratadas, la densidad PSII es ~ 3 veces mayor en los EF que en EFU (~ 1.550 m ^-2 complejos vs. ~ 550 micras complejos ^-2, Figura 3). Esta es una base para diferenciar entre estas dos caras continuas. Otra es la diferencia en su fondo. Mientras que el fondo aparece FAs suave, la cara EFU es áspera y contiene agujeros que son las huellas de los complejos PSI independientes, que fractura a la cara complementaria, la UFP ¹⁰ (Figura 3). Un ejemplo para la segmentación de los complejos PSII de la cara EFs de la membrana tilacoide se muestra en la Figura 5.

Figura 1. Imágenes de bajo aumento Cryo-SEM de Plaquetas con fractura-Freeze C. pumilum trozos de hojas. (A) una región grande de células fracturadas (línea discontinua) de un C. pumilum hoja. (B) La pieza de la hoja fue eliminado con la plaqueta superior, pero algunos tejido de la hoja se mantuvo unido a las marcas de cuchillo en la parte inferior de plaquetas (puntas de flecha marcan algunas de ellas). Las regiones que rodean a los trozos de hoja se congelan 1-hexadeceno (asteriscos). Las barras de escala:. 200 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. La Organización Supramolecular de membranas tilacoides dentro de los tejidos vegetales Un cloroplasto fractura en el que las diferentes caras de fractura tilacoides se pueden ver:. Las caras de fractura exoplasmic (EF) de ambas regiones (EFU) de membrana apiladas (EFS) y no apiladas contiene fotosistema II complejos (PSII); La cara de la fractura del protoplasma de las regiones apiladas (PFS) contiene los complejos de antena captador de luz periféricos de PSII, LHCII; Fotosistema I (PSI) y la fractura de la ATP sintasa a la cara de fractura del protoplasma de las regiones no apiladas (UFP); Citocromo b ₆ f fracturas en ambos SLP y la UFP. La imagen fue escaneada con una ampliación de 203 Kx (campo de visión horizontal = 1,45 micras). Barra de escala:. 100 nm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Cambios en la Organización Fotosistema II durante la deshidratación de C. Los FAN pumilum caras de las membranas tilacoides de plantas en diferentes RWC: (a) 100%, (B) ~ 40%, (C) ~ 15%, y (D y ​​E) 5 - 10%.. Durante la deshidratación, la densidad de PSII en los EFs cara disminuye gradualmente desde ~ 1500 micras complejos ^-2 (A) a ~ 700 micras complejos ^-2 (~ 15% RWC, C). Cabe destacar que, en condiciones más secas (de 5 - 10% de RWC), algunos PSII complejos organizan en filas y matrices (D y E, flechas). La punta de flecha (E) marca la cara FP, con antena LHCII apareciendo también ser organizados en filas, en el que entre las filas PSII se encontrarían en las EF complementarias. Para obtener información adicional sobre estos datos véase ^24. Las barras de escala:. 100 nm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Un ejemplo de segmentación del Fotosistema II partículas. Usando el paquete de código abierto Fiji, complejos de proteínas puede ser segmentado de las imágenes con unos pocos pasos (completar el procedimiento detallado que se encuentra en la parte 4 de la sección Protocolo). Imágenes (A, imagen original) se difuminan con el filtro de Gauss (B); la imagen se thresholded utilizando un TH local de automóvilesherramienta reshold (C); la imagen se invierte y el algoritmo de cuenca se aplica con el fin de objetos separados que se encuentran en contacto cercano (D); una región de interés se selecciona y el exterior se borra (E); partículas (dentro de un rango de tamaño definido por el usuario) son seleccionadas usando la función de analizador de partículas. La máscara resultante se muestra en (F). Las partículas se agregan al Administrador de ROI y superpuestos en la imagen original (G) para comprobar si hay errores o de partículas defectuosas o perdidas. La lista de regiones de interés se puede editar manualmente, sustituir, eliminar o añadir nuevas regiones de interés, según el caso. La selección editado usuario final se muestra en (H). Barra de escala:. 200 nm Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La técnica descrita en este documento permite la investigación de las membranas de congelación-fractura en el contexto de los tejidos vegetales congelados de alta presión bien conservados mediante microscopía electrónica de crio-escaneo. La principal ventaja de la utilización de estos procedimientos es que la preparación de la muestra es puramente físico; no hay pasos que involucran productos químicos o la deshidratación son necesarios. Por lo tanto, permite el estudio de las estructuras biológicas en un estado casi nativo ^26,32. La ventaja de utilizar tejidos de la hoja es que se puede obtener información sobre la organización celular en general, así como las membranas específicas de estudio, tales como las membranas tilacoides, en su contexto fisiológico nativo, es decir, dentro del cloroplasto. Otra ventaja, imprescindible para el estudio de C. plantas pumilum a diferentes contenidos de agua relativos (RWC), es que su estado de hidratación no se altera durante la preparación. Esto se en lugar de utilizar los cloroplastos aislados o de las membranas tilacoides como material de partidapara un experimento de congelación-fractura. En este último, también hay que tener en cuenta que algunas alteraciones estructurales y / o supramoleculares probable que tengan lugar durante el aislamiento orgánulo / membrana.

Trabajar con muestras de tejido de la planta, que son relativamente gruesa [> 50 - 100 micras, y puede ser significativamente más grueso, dependiendo del tipo de tejido y las especies], dicta el uso de alta presión de congelación (HPF) para la vitrificación de la muestra. Aplicación de alta presión [2100 bar], a la que la temperatura de fusión del agua es de aproximadamente -22 ° C, afecta a la red de enlaces de hidrógeno del agua de manera que se ralentiza la velocidad de formación de cristales de hielo. Por lo tanto, la posibilidad de obtener una muestra vitrificado es alta incluso a velocidades de enfriamiento relativamente lento. HPF es actualmente el único método disponible para la vitrificación de espesor, sin embargo, no superior a 200 micras, muestras. Un paso crítico para HPF de tejidos de la planta es la infiltración de sus espacios de aire intercelulares con una inerte4;. Relleno de espacio "antes de la congelación, para evitar el colapso del tejido bajo la alta presión (ver comentarios ^29,33) En el caso de C. hojas pumilum, cuyo espesor puede ser de hasta 1 mm, las hojas también tienen que ser recortado o diluido antes de HPF.

Esencialmente, la técnica de la preparación de réplica de ¹⁸ también se puede aplicar a congelación-fractura de los tejidos foliares. Sin embargo, en nuestra experiencia, no se obtuvo un rendimiento suficiente de zonas fracturadas intactas, ya que las réplicas a menudo fragmentan en pedazos pequeños. Por otra parte, la búsqueda de una región específica de interés, tales como cloroplastos puede ser poco práctico dentro de las réplicas fragmentada de los tejidos vegetales. Esto es principalmente porque las células mesófilas (fotosintética) se componen de un gran vacuola central rodeado por una tira estrecha citoplásmica (Figura 2A), que incluye el núcleo, cloroplastos y todos los otros orgánulos. Por lo tanto, los cloroplastos representan sólo una fracción muy pequeña de la zona fracturada total detejidos del mesófilo. Cryo-SEM de formación de imágenes de muestras de congelación-fractura ofrece una solución a este problema ya que las muestras se visualizan directamente después de la fractura (y revestimiento / sombreado). Sin embargo, este método adolece de la limitación de que las muestras congeladas-hidratado son sensibles a la viga y por lo tanto la exploración con grandes aumentos fácilmente daña la muestra en la primera exploración. Recubrimiento de doble capa (DLC) ^27,28 ofrece una solución a este grave inconveniente.

En DLC, las muestras fracturadas se recubren de una manera similar a la forma en que son para la preparación de réplicas. En primer lugar, una capa delgada (1-3 nm) de Pt / C se evapora sobre la muestra, proporcionando el contraste y la conductividad. Esto es seguido por una más gruesa (5 a 10 nm), capa protectora de carbono. DLC combinado con un alto voltaje de aceleración (10 kV) se utilizó para las muestras de imagen utilizando la señal de electrones retrodispersados ​​(BSE) ^28. La señal de la encefalopatía espongiforme bovina, procedente de la capa de platino permite la obtención de información de la superficie a través del carbóny, eventualmente, vapor de agua capa de contaminantes, que son prácticamente transparente a la EEB a altos voltajes de aceleración (la contaminación del agua se acumula en experimentos en los que una unidad de transferencia-cryo de vacío no se utiliza y la superficie fracturada se expone a la atmósfera, incluso si esta es por una fracción de un segundo). Además, las imágenes utilizando la señal de la EEB minimiza el problema de los efectos que son evidentes en la detección secundaria de electrones (SE) ²⁷ de carga. Con la configuración microscopio descrito aquí, las imágenes de la señal SE con el detector se en-lente a 10 kV proporcionado información equivalente a la obtenida cuando las muestras fueron recubiertas solamente con 2 - 3 nm de Pt / C y la imagen a bajos voltajes de aceleración. La diferencia es que las muestras preparadas por DLC y la imagen como se describe fueron considerablemente menos haz sensible. Esto nos permitió escanearlos con grandes aumentos y en muchos casos incluso en varias ocasiones, y permitió la obtención de información valiosa sobre supramolecul proteína fotosintéticaar organización y otros constituyentes celulares (Figuras 2 - 4) ^24.

Finalmente, los procedimientos descritos aquí pueden ser modificados para estudiar la organización de proteínas estructura y / o de la membrana en otros tipos de muestras. Hemos empleado con éxito la técnica para estudiar la organización supramolecular de las membranas fotosintéticas en las células de cianobacterias y algas (Shperberg-Avni et al. Datos no publicados). La consideración principal es encontrar el equilibrio entre tener una muestra lo más fina posible, con el fin de aumentar la posibilidad de vitrificación, manteniendo intacto de la muestra. Para los diferentes tipos de muestras, que pueden ser suspensiones o tejidos animales / vegetales, diferentes envases se debe utilizar (por ejemplo, en términos del tipo de plaquetas utilizadas para la congelación de alta presión). Una vez que se logra con éxito la crio-inmovilización, la combinación de congelación-fractura, DLC y la imagen Cryo-SEM proporciona un medio excelente para la obtención de información sobre la organización de proteínas de membrana a alta magnificación con un daño mínimo del haz.

The authors declare they have no competing financial interests.

Agradecemos a Andrés Kaech (Universidad de Zurich) por sus útiles consejos sobre el escaneo de imágenes de microscopía electrónica. Este trabajo fue apoyado por el Fondo de los Estados Unidos e Israel Binacional de Investigación Agrícola y Desarrollo (concesión no. US-4334-10, ZR), la Fundación de Ciencias de Israel (concesión no. 1034/12, ZR), y el Human Frontier Science Program (RGP0005 / 2013, ZR). Se llevaron a cabo los estudios de microscopía electrónica en el Irving Moskowitz y Cherna Centro de Nano y Bio-Imaging Nano en el Instituto de Ciencia Weizmann.