Визуализация субклеточных структур в эмбрионе данио Living

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

В естественных изображений обеспечивает прямую визуализацию клеточных поведения в наиболее физиологическом контексте. Прозрачность эмбрионов данио, их быстрого и внешнего развития и богатым набором генетических инструментов , которые позволяют обозначать флуоресцентный все это способствовало более широкое использование микроскопии в естественных условиях для выяснения динамики ключевых событий в области развития. Визуализационные исследования развития нервной системы у данио есть, например , значительно расширили наши знания о поведении нервных клеток - предшественников и судьбы их потомков , включая их последующей миграции, дифференциации и интеграции схем ^1-8.

Этап теперь установлен для исследования субклеточных динамики, лежащие в основе этих клеточных поведения. Действительно, данио уже эксплуатируются в качестве инструментов в естественных условиях клеточной биологии. Теперь можно визуализировать митохондрии ^9-11, центросомы ^2,8,12-14, Гольджи ¹⁵, Микротрубочки ⁴ и актина ¹⁶ цитоскелета, Эндосомы ¹⁷ и компоненты апикальной мембраны комплекс ^1,18, среди других субклеточных структур в данио эмбрионов в естественных условиях. До сих пор большая часть того, что известно о функции этих органелл происходит от изучения их поведения в культуре клеток. В то время как в пробирке исследования дали огромное понимание биологии клетки, клетки в культуре не в полной мере отражают сложность ситуации в естественных условиях и , следовательно , не обязательно отражают функцию и динамику внутриклеточных органелл в естественных условиях. Эмбрионы рыбок данио предлагают жизнеспособной альтернативы в естественных условиях для изучения субклеточных динамики.

Как позвоночных, данио обладают многие системы органов (например, нейронные сетчатки), которые гомологичны тем , которые встречаются у видов млекопитающих. Кроме того, данио эмбрионов все чаще используются для моделирования заболеваний человека ^19,20 , в том числе связанные с центросомной функции (например, микроцефалия ²¹ и врожденного амавроз ²² Лебера) и к митохондриальной функции (например, болезнь Паркинсона ^23, тауопатий ^10,24 и синдром Барта ^25). В естественных условиях формирования изображения на клеточном и субклеточном уровне в этих случаях позволит лучше понять клеточной биологии, лежащей в основе этих патологических состояний.

Общая цель методов , описанных здесь , чтобы обеспечить полное руководство по расследованию органелл и других субклеточных структур в данио эмбрионов с использованием в естественных условиях световой микроскопии. Весь рабочий процесс вовлечены в визуализации и отслеживания субклеточных структур в естественных условиях описывается - от генетических методов маркировки, с целью генерирования скоротечно выражения и стабильной трансгенные рыбы, и , наконец , к визуализации с использованием широкого поля и конфокальной микроскопии. Хотя каждый из этих прокedures используется многочисленными данио лабораторий, протоколы, описанные оптимизированы и упорядочены для исследования динамики субклеточных структур. Два конкретных аспектов работы, описанной здесь, заслуживают упоминания: Во-первых, использование системы экспрессии Gal4-UAS в различных конфигурациях для генетически меток органелл в конкретных типов клеток. Во- вторых, прямое сравнение широкого поля и конфокальной микроскопии для изображения субклеточных структур в естественных условиях.

Современные стратегии в отношении генетически ярлык органелл и других субклеточных структур в данио либо используют мРНК ^1,4,8 ограничен или ДНК на основе конструкций , где промоторные элементы непосредственно привод экспрессию слитых белков ^9,14,15. В пробирке транскрибируется результаты ограничен РНК в быстрое и широкое выражение, то есть не тканеспецифическая однако. Кроме того, уровни экспрессии уменьшается со временем, поскольку удаляемого РНК разбавляют или деградирует. Таким образом, использование РНК на основеконструирует для изучения динамики органелл на более поздних стадиях развития ограничено (обычно до 3-х дней после оплодотворения).

Эти ограничения могут быть преодолены с помощью ДНК-конструкции, где пространственные и временные контроль экспрессии определяется конкретными элементами промотора. Когда ДНК - конструкции на основе используются в контексте системы Gal4-UAS существенное улучшение уровня экспрессии трансгена наблюдаются ^26,27. В этой двудольного системе экспрессии клеток типа конкретных элементов промотора управления экспрессией транскрипционный активатор Gal4, в то время как гены-репортеры, клонируют ниже по потоку от Gal4-связывающего вверх по течению последовательности активационного (БАС). Объединив UAS репортеров с соответствующими драйверами Gal4, выражение может быть ограничено конкретными типов клеток, обходя необходимость клонировать репортерных генов за различными промоторами каждый раз, когда конкретный паттерн экспрессии желателен. Кроме того, экспрессия множественных генов БАС репортер может бытьдвижимый одного Gal4 активатора. Таким образом, система Gal4-UAS обеспечивает универсальный и гибкий генетический подход к внутриклеточной маркировки.

Широкий поля и конфокальной микроскопы являются лошадки большинства лабораторий. Системы Широкопольные обычно используют дуговую лампу в качестве источника света и обнаружить испускаемый свет с чувствительной камеры, которая находится в конце пути света. Этот механизм визуализации, как правило, ограничивается тонких образцов, как вне фокуса света затемняет в фокусе информации в более толстых образцах. Конфокальные микроскопов отличаются от широко полевых систем в том , что они построены в пользу сигналы, исходящие от фокальной плоскости над теми , которые происходят вне фокуса (т.е., "оптический секционирования") ^28. Для достижения оптического секционирования обскура помещается на пути излучения в сопряженном положении по отношению к точечного источника света. Лазеры используются в качестве источников света и сигналы детектируются с фотоэлектронных умножителей (ФЭУ). На практике лазерлуч прокатывается по образцу точка за точкой и флуоресцентной эмиссии на каждом месте (пиксель) обнаруживается ФЭУ.

Здесь мы изображение те же субклеточных структур в живых эмбрионов данио использованием как широкого поля и конфокальной микроскопии, чтобы обеспечить прямое сравнение обоих методов микроскопии. Основополагающая цель предоставления таких сравнений, чтобы предложить рекомендации по выбору наиболее подходящего метода микроскопии для конкретного вопроса под рукой.

Используя методы, описанные здесь, мы демонстрируем Gal4-UAS на основе генетической маркировки митохондрий и центросомах. Эти органеллы изображаются в различных клеточных типах нервной системы и в мышечных клетках с помощью широкоугольной и конфокальной микроскопии, чтобы продемонстрировать пригодность каждого метода визуализации. Методы, описанные здесь, могут быть легко адаптированы для исследования других органелл и субклеточных структур в живом данио эмбриона.

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с местными правилами правительства Верхней Баварии (Мюнхен, Германия).

1. Маркировка органелл и других субклеточных структур

Примечание: При этом генетический репортер строит что флуоресцентно центросомах тегов, митохондрии и клеточные мембраны описаны.

1. С помощью обычных методов клонирования ²⁹ для создания гибридных белков , которые флуоресцентно маркировать центросомами и митохондрии. Клон кодирующую последовательность данио centrin4 (cetn4) в рамке считывания с флуоресцентным белком ² (FP) , такие как желтый флуоресцентный белок , чтобы генерировать cetn4-YFP. Клонирование митохондриальную последовательность адресности субъединицей VIII цитохром с оксидазы в рамке считывания с FP , такие как Cyan флуоресцентного белка генерировать mitoCFP ^9-11.
2. Для того, чтобы ограничить экспрессию слитых белков (cetn4-YFP или mitoCFP) к конкретным клеткам zebrafиш эмбриона (например , нейроны или мышечные клетки) используют двудольный систему экспрессии Gal4-UAS ^26,27. Во-первых генерации репортерной конструкции UAS. Используйте обычные методы для клонирования слитого белка в выражении UAS вектора, вниз по течению от Gal4-связывающего UAS кассеты (варианты варьируются от 1x до 14x UAS см обсуждения) ^26,27,30 и минимальный промотор (Е1В базальный промотор из карпа βactin гена), а также генерировать UAS: cetn4-YFP и UAS: mitoCFP.
   Примечание: Для того, чтобы подготовить UAS репортер конструкции для стабильной генерации трансгенной линии дополнительные элементы должны быть клонированы (см 3 ниже)
3. Для визуализации клеточного контекста, в котором центросомах или митохондрии меченый, генерируют UAS репортер конструкции, в которых клеточные мембраны помечены FPs. Клон первые двадцать аминокислот данио Gap43 (содержащих пальмитоилирование сайты) в рамке считывания с FP для мишени, FP на клеточной мембране (memFP) ^31,32.
4. Obtaiп конструкции драйверов или трансгенные линии , в которых камерного типа конкретные элементы промотора привода экспрессии активатора транскрипции Gal4-VP16 ^27, Gal4FF ³³ или KalTA4 ^30.
5. Комбинат репортер UAS конструкций с соответствующей конструкцией водителя , чтобы ограничить выражение желаемого типа клеток интерес (например, в нейронах или мышечных клетках). Для того, чтобы сделать это сотрудничество впрыснуть драйвер Gal4 и UAS репортер строит на стадии одной клетки из оплодотворенных яиц (для подробных инструкций см 2 ниже) , чтобы генерировать скоротечно выражения рыбы. В качестве альтернативы, генерировать UAS - репортер стабильной трансгенной линии (за подробные инструкции см 3 ниже) и крест на водителя Gal4 стабильной трансгенной линии для создания потомства подшипник как трансгены.
   Примечание: Можно также вводить БАС репортерной конструкции / с в оплодотворенные яйца от водителя Gal4 стабильной трансгенной линии или драйвер Gal4 конструкции в fertilizEd яйца из UAS-репортера стабильной трансгенной линии.
6. Для того, чтобы совместно выразить несколько белков отличается слитые с использованием системы Gal4-UAS, использовать драйвер Gal4 и UAS - репортер / с в одной из следующих конфигураций: А. Множественные, отдельные UAS репортер конструкций (например, UAS: mitoCFP и UAS: memYFP сотрудничества -injected конструкцией водителя Gal4) ^10, B. Несколько UAS кассеты на одном репортера (например, UAS: cetn4-YFP, UAS: memCerulean) ¹² C. Двунаправленный UAS репортер (например , UAS: memYFP, mitoCFP) ^2,10,24 (Рисунок 1).

Рисунок 1. Стратегии для совместного экспрессии белков , слитых с использованием системы Gal4-UAS.
Совместная экспрессия нескольких белков слияния может быть достигнуто путем использования БАС репортерных кассет в различных конфигурациях: (а) множественный, отдельный UAS управляемой сопзЬructs, (В) несколько UAS кассеты на одной конструкции или (С) двунаправленная UAS кассеты на одной конструкции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

2. Сформировать скоротечно Выражая рыбы

Примечание: Ниже приводится адаптация ранее опубликованных протоколов ^34,35. Базовая установка впрыска должна включать стереомикроскопа с увеличением расстояния до 12x, микроманипулятор с держателем микропипетки и источник давления воздуха. Подготовка 2.1-2.5 загодя:

1. Для приготовления яичных микроинъекции камеры, готовят раствор 1,5% (вес / об) агарозы в воде. Добавить агарозы порошок в воде и микроволновую печь, пока агароза полностью не растворится. Наполните чашку Петри (100 х 15 мм) с этим решением.
   1. Разрешить агарозном раствору остыть до проверoximately 45 ^° С до размещения пластиковый микроинъекции формы (40 мм х 66 мм, с 6х 50 мм длиной гребней, которые шириной 1,5 мм, 1 мм глубиной и разнесенные 3 мм друг от друга) на поверхности расплавленной агарозы, осторожно , чтобы не вводить пузырьков на границе раздела.
   2. После множества агарозы, хранят при температуре 4 ^о CO / N. Осторожно удалите плесень с помощью шпателя. Подготовьте несколько камер микроинъекции в то время, хранить при температуре 4 ^° С и использовать многократно в течение нескольких недель.
2. Используйте микропипетки съемник для создания инъекционные стеклянных капиллярах с длинным хвостовиком ^36.
   Примечание: Конкретные параметры , используемые для получения инъекций капилляры должны быть определены эмпирически. Инъекционные капилляры можно вытянуть заранее и хранить до использования.
3. Измерьте концентрацию плазмидной ДНК (драйвер Gal4 и UAS репортер конструкций) для микроинъекции, используя спектрофотометр в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. Мера60, отношение оптической плотности при длине волны 260 нм и 280 нм (А260 / 280). Развести ДНК до конечной концентрации 100 нг / мкл в нуклеазы без воды.
   Примечание: A / соотношение A260 280 ~ 1.8 означает чистую ДНК. Рассмотрим с использованием коммерческого набора (на основе диоксида кремния на основе связывания матрицы) для очистки ДНК плазмиды, которая будет использоваться для инъекций. Плазмидную ДНК должна быть высокого качества, чтобы предотвратить токсичность.
4. Готовят 10 мкл инжекционных смеси путем комбинирования ДНК (от 0,5 до 2,5 мкл 100 нг / мкл запаса для конечной концентрации от 5 до 20 нг / мкл), раствор Danieau (в 0,33 мкл 30х запаса), феноловый красный (0,25 мкл, по желанию) и нуклеазы без воды до общего объема 10 мкл.
   Примечание: Эмпирически определить концентрацию ДНК , которая дает подходящее выражение. водитель Gal4 и UAS репортер плазмиды должны быть совместно введены. Нет выражение не будет иметь место, если только водитель Gal4 или UAS репортер плазмиды вводят в дикого типа оплодотворенных яиц. Если же тон оплодотворил яйца от линии водителя Gal4 затем инъекции одного или нескольких UAS-репортерами плазмид хватает. И наоборот, если microinjecting в репортерной линии БАС, только плазмида драйвер Gal4 должен быть введен. И, наконец, в то время как феноловый красный может значительно помочь визуализировать инъекции, также сам по себе флуоресцентное соединение. Поэтому Фенол Red может затенить визуализирующих FPs, если визуализация планируется до 24 ч после оплодотворения (ФВЧ), поскольку она не может быть в достаточной степени разбавляется к этому времени.
5. Вечером перед инъекциями планируется, установить несколько пар (как правило, от 5 до 10) мужского и женского данио для разведения. Использование селекционных резервуаров со вставкой, содержащей основание и географической привязкой съемный разделитель, чтобы отделить мужскую и женскую рыбу.
   Примечание: мужская и женская данио как правило , можно отличить по форме тела. Мужчины имеют тенденцию быть стройным в то время как женщины имеют тенденцию проявлять вентрально выступающую часть живота. Мужчины, кроме того, как правило, имеют желтовато-красный седловиныORing на их вентральной области живота.
6. Непосредственно перед началом инъекции ДНК, удалить разделители, чтобы позволить мужского и женского пола к спариванию. Приблизительно от 15 до 30 мин после снятия делителя, проверьте яйца в нижней части бака. Передача взрослых рыб с помощью рыболовной сети на новый разведение танк.
7. Налейте воду, содержащую недавно заложенные оплодотворенную икру, из племенного бака в сито (например, пластиковые ситечко). Мойте яйца в сите с помощью пульверизатора раствора, содержащего Danieau в. Обратить сито на чашку Петри и использовать пульверизатор с раствором Danieau, чтобы восстановить все яйца (как правило, от 50 до 200 яиц в разведении пару взрослых рыб).
8. Использование microloader пипетки, обратно заполнить вытащил инъекции капилляр с ДНК литьевого смеси. Установить инъекционный капилляр в держатель микроманипулятора и обрезать кончик, под визуальным контролем стереомикроскопа, с помощью пинцета, чтобы создать микропипетки, который может Penetrate хориона и цитоплазмы клетки, будучи в состоянии поставить подходящий объем ДНК.
   Примечание: Степень , в которой кончик инъекционной капилляра отделан должна быть определена эмпирически и может быть лучше всего судить при введении яиц.
9. Для определения объема ДНК для инъекций, разрядить каплю раствора для инъекций в минеральное масло. Измерьте радиус (г) капли с помощью калибровочного микрометра и вычислить его объем (4/3 π R ^3). Модулировать объем за счет изменения давления впрыска и / или длительность каждого импульса инжекции.
10. С помощью пластиковой пипетки передавать все собранные яйца (обычно 50-200, от 2,7 выше) в окопах микроинъекции камеры. Под визуальным контролем стереомикроскопа, используйте пинцет, чтобы ориентировать яйца так, чтобы цитоплазме клетки (прозрачный) и желток (плотный, непрозрачный) могут быть легко идентифицированы.
11. Под визуальным контролем стереомикроскоп, вводят ДНК в цитоплазму клетки оплодотворенной яйцеклетки, следя за тем, чтобы гарантировать, что Вводимый объем (от 1 до 2 NL) соответствует приблизительно 10% объема клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фенол красный в слуховыми раствора ДНК в визуализации объема закачиваемой.
12. После инъекции, отвинтить яйца из траншеи для литья под давлением, смывая их с пульверизатор раствором, содержащим Danieau в. Затем перенести яйца в свежей чашке Петри с помощью пластиковой пипетки передачи и поддерживать в 28,5 ^о С инкубатор.
13. Поддерживать Во-впрыскивается яйца как элементы управления, чтобы определить, является ли способствуют инъекции высоких показателей смертности, либо в результате физического ущерба, нанесенного во время проникновения микропипетки или смеси ДНК.
    Примечание: Высокий уровень смертности вследствие инъекции может быть из - за целого ряда факторов, в том числе концентрации или нагнетательных объемов чрезмерно высокой ДНК и / или плазмид с ЗагрязнителиNTS. Для предотвращения токсичности от Preps ДНК низкого качества, могут быть использованы коммерческие наборы (основанные на основе диоксида кремния, связывающей матрицы).
14. Через равные промежутки времени после инъекции, используйте стереомикроскопа для скрининга неоплодотворенных яиц и мертвых или неправильно сформированных эмбрионов и выбросить их.
    Примечание: Deem яйца , которые кажутся на стадии одной ячейки несколько часов после оплодотворения, так как неоплодотворенные. Определение деформированные эмбрионов от грубых анатомических дефектов, таких как скомпрометированных передне-задней оси тела. Аморфный материал в хориона позволяет предположить, что эмбрион не проходят через стадии развития и умер. Для того, чтобы установить , является ли эмбрионы , которые были микроинъекции пройти нормальный курс развития анатомических атласов консультации ^37.
15. Перенос эмбрионов с помощью пластиковой пипетки передачи для решения Danieau, содержащей 1x 1-фенил 2-тиомочевины (1xPTU) от 10 до 24 часов после оплодотворения, чтобы предотвратить образование пигмента. Поддержание эмбрионов в растворе прод Danieau вAining PTU на протяжении всего эксперимента.
    Примечание: В дополнение к меланофорах, иридофоры на поверхности кожи может быть проблематичным для работы с изображениями. В то время как PTU не ингибирует образование iridophore, мутантные линии с уменьшенным количеством иридофоры , таких как Рой Орбисон (Roy) существует и может быть использовано ^38.
16. После эмбрионов люк (как правило, на второй или третий день после оплодотворения, 2 или 3 денье), отбросить хорионов и обменивать решение в Danieau, содержащей PTU.
    Примечание: Эти шаги имеют важное значение для обеспечения качества эмбриона среды и жизнеспособность здоровых эмбрионов.

3. Сформировать Stable Линии Трансгенные

ПРИМЕЧАНИЕ: Стабильная трансгенные линии могут быть эффективно получены с использованием системы транспозонов Tol2. Транспозон вектор Tol2, содержащий трансген интерес совместно вводят вместе с мРНК, кодирующей фермент транспозаза в оплодотворитьг яйца на стадии одной клетки. Транспозаза белок , полученный из закачиваемой мРНК катализирует вырезание трансгенной кассеты из вектора транспозонов и его интеграции в геном ^39.

1. Клонирование трансгенный репортер кассеты (например, UAS: mitoCFP) между Tol2 перевернутой концевыми повторами в одном из векторов Tol2 в настоящее время используются в данио сообщества , как описано ^40.
   Примечание: векторы , содержащие Tol2 селектируемый кассету , в которой промоторные элементы управления экспрессией FP в системах органов , не имеющих отношения к области , представляющей интерес (например, сердце ⁴¹ или линза ⁴²⁾ могут быть использованы для скрининга БАС репортер трансгенных линий в отсутствие Gal4 трансактивации.
2. С помощью коммерческого набора (на основе диоксида кремния на основе связывания матрицы), очищают ДНК плазмиды, которая будет использоваться для инъекций. Убедитесь, что плазмидная ДНК высокого качества для предотвращения токсичности.
3. Расшифруйте Tol2 транспозаза-мРНК, кодирующей с использованиемсоответствующий вектор транскрипции , такие как PCS-TP ^43. Вкратце, линеаризуем PCS-TP и использовать коммерческий набор для создания колпачком мРНК и следовать протоколу производителя. Будьте осторожны , чтобы избежать загрязнения с РНКазами (например, использовать РНКазу пипеток и трубки). Алиготе РНК, при концентрации 100 нг / мкл, для одноразового использования и хранить при температуре -80 ^о С.
4. Утром инъекций, оттепель аликвоту мРНК транспозазы на льду. Смешайте вектор транспозонов ДНК (2 мкл 100 нг / мкл) и транспозазу мРНК (2 мкл 100 нг / мкл) в соотношении 1: 1, и добавить 6 мкл РНКазы воды, чтобы довести общий объем до 10 мкл.
   Примечание: в концентрации 20 нг / мкл рекомендуется для каждого , но оптимальная концентрация должна быть определена эмпирически. Используйте РНКазы воду для разбавления. Используйте перчатки при работе с инъекции смеси ДНК-РНК и держать его на льду в течение всего периода инъекций для предотвращения деградации мРНК.
5. Используя подробные инструкции в разделе 2 выше, впрыскивать инъекции смеси ДНК-РНК в оплодотворенные яйца на стадии одной клетки. Под визуальным контролем стереомикроскопа целевой цитоплазму клеток на стадии одной клетки для самых высоких показателей эффективности трансгенеза. Поддерживать инжектированные эмбрионов на 28,5 ^° С до готовности к экрану для экспрессии трансгенов.
   Примечание: ПЦР может быть сделано для проверки эффективности транспозазы Tol2 , как описано выше ^44.
6. Эмбрионы экрана в чашку Петри для трансгеноза с использованием окуляра флуоресцентного микроскопа рассекает.
   Примечание: Используйте соответствующие наборы фильтров микроскопа для визуализации FP экспрессии селектируемого кассеты (то есть, флуоресценция в сердце или линзы) на 2 или 3 денье. Выявление потенциальных трансгенные эмбрионы выражением (в сердце или линзы) и поднять эти эмбрионы до зрелого возраста (F ₀ поколение) с использованием стандартныхпротоколов ^45. В качестве альтернативы, определить потенциальные трансгенных эмбрионов с помощью ПЦР , как описано в ^46.
7. После того , как репортер F UAS ₀ рыбы 2,5 - 3 - месячного возраста, скрестить их (см 2.5 для подробностей) не-трансгенной дикого типа рыбы , чтобы приобрести яйца по созданию поколения F _1. В качестве альтернативы, пересечь UAS - репортер F ₀ рыбу к линии водителя Gal4 создать поколение F _1. В последнем случае, БАС управляемый трансген может быть непосредственно контролироваться в эмбрионов, полученных с креста.
8. С помощью флуоресцентного микроскопа рассекает для скрининга F ₁ зародыши для экспрессии трансгена или выбираемым кассеты.
   Примечание: Когда выражение подтверждается то трансген может быть охарактеризована зародышевой передается. Трансгенез является неменделевский на стадии F _0. Число эмбрионов, экспрессирующих трансген может варьироваться от небольшого числа для подавляющего большинства в индивидуальном clutches. Интеграция транспозонов в различных F ₀ рыб может сильно различаться, что приводит к различным паттерном экспрессии. Поэтому поддерживать F ₁ рыбы из разных основателей F ₀ в виде отдельных суб-линий. Транспозону интеграций в F ₁ рыбы стабильны и передаются на последующие поколения в Менделя.
9. Поддерживать каждый F ₀ рыбы в отдельных резервуарах для повторного выявления трансгенов носителей.

4. Подготовить зародыши для визуализации на прямой микроскоп

Примечание: Процедуры , описанные здесь , были оптимизированы для работы с изображениями на вертикальных микроскопов с целями долгосрочной работы расстояние воды окунание конуса.

1. С помощью флуоресцентного микроскопа рассекает для скрининга эмбрионов для трансгенной экспрессии.
   Примечание: Выражение репортер трансгена UAS будет зависеть от конкретной линии драйвера Gal4 используется. Выбор эмбрионов для экспериментов визуализации, основанные на желаемом ехрression узор.
2. Передача выбранных эмбрионов с помощью пластиковой пипетки в отдельную чашку Петри, содержащую буфер Danieau с 1x PTU и 1x Tricaine.
   Примечание: Если маркировка редка (только несколько клеток в системе органов) смонтировать эмбрионов в агарозы (см 4.3 - 4.7 ниже) и экран для трансгенной экспрессии с использованием широкого поля микроскопа с высокими целями увеличением (см 5.1 ниже). Tricaine обезболивает рыбу и должны быть эффективными в течение нескольких секунд. Если рыба не иммобилизованных это, вероятно, что Tricaine деградировал. Возможные причины этой деградации включают плохое хранение Tricaine, который является светочувствительным ^47.
3. Подготовьте агарозы встраивать рыбу путем растворения низкой температурой плавления агарозы порошок в буфере Danieau к конечной концентрации 0,7%. Алиготе (1 мл) и держать в плавки- блоке при 40 ° С до готовности к использованию.
   Примечание: Более высокая КонцентратИоны агарозы (до 1,5%), также может быть использован для встраивания рыбы.
4. Добавляют 50 мкл 20х запаса Tricaine и 20 мкл 50x маточного раствора PTU к 1 мл аликвоты с низкой температурой плавления агарозы и хорошо перемешать, нажав на стороне трубки. Возвращение трубки к тепловому-блока. С помощью пластмассовой пипетки передачи, аккуратно пипеткой несколько (1-10) наркозом эмбрионов в агарозы, перенос, как небольшое количество жидкости, как это возможно, чтобы избежать разбавления агарозы.
5. С помощью пластмассовой пипетки все эмбрионы с небольшим количеством агарозы к стеклянным дном чашки Петри.
6. Работая сравнительно быстро, использование щипцов для размещения эмбрионов в нужной ориентации, в зависимости от структуры, которые будут отображены.
   Примечание: Orient эмбрионы на их стороне , если сетчатка или Rohon-Борода (РБ) сенсорные нейроны должны быть отображены.
7. Разрешить агарозы, чтобы затвердеть в течение по крайней мере 15 минут. Добавить буфер Danieau, содержащей 1xPTU и 1xTricaine для покрытия эмбрионов, внедренных в Agaroсе. Поместите блюдо , содержащее агарозном встраиваемый эмбрионов в инкубаторе при температуре 28,5 ^о С до готовности к изображению.

5. визуализации клеточных и субклеточных структур с помощью широкоугольной или конфокальной микроскопией

Примечание: Wide-полевой микроскопии и точка-сканирующей конфокальной микроскопии являются наиболее широко используются методы для получения изображений флуоресцентно меченых эмбрионов данио В таблице 1 приведены основные преимущества и недостатки обеих систем.. Для обеих форм микроскопии, эмбрионы установлены в агарозе , как описано в 4 выше, и выдерживают при 28,5 ^о С в течение всего эксперимента формирования изображения с помощью нагревательной камеры на столик микроскопа. Важно отметить, что блюдо с агарозном встраиваемый эмбрионов уравновешивают до 28,5 ^° С до того, как начинается визуализация колебания температуры вызывают дрейф в г-измерении. При проведении долгосрочных экспериментов визуализации (свыше Северал ч), поставить крышку из плексигласа над чашку Петри, чтобы уменьшить испарение буфера.

Таблица 1. Общее сравнение широкого поля и точка-сканирующей конфокальной микроскопии

1. Широкое поле микроскопии
   Примечание: Здесь представлены рекомендации для работы с изображениями эмбрионов данио с использованием вертикального широкого поля микроскопа с целями долгосрочной работы расстояние воды окунание конуса. Микроскоп оснащен охлаждаемой ПЗС-камерой, а также наборы фильтров для визуализации различных флуорофоров установленный на автоматизированном колеса фильтра для быстрого приобретения нескольких каналов.Получение изображений контролируется μManager, пакет программного обеспечения с открытым исходным кодом микроскопии ^48. Конкретный пример для визуализации митохондрий в RB сенсорных нейронов обеспечивается. RB клетки генетически метили мембраны целевых YFP и их митохондрии CFP-меченый (см 1.1 выше).
   1. Маунт - эмбрионы на их стороне в легкоплавких агарозы , как описано в 4 выше.
   2. Разрешить блюдо с вмонтированной рыбы для уравновешивания до 28,5 ^о С в нагревательной камере на стадии микроскопа перед началом визуализации.
   3. Используйте цель водной окунание конуса малом увеличении и смотреть через окуляры микроскопа, чтобы выбрать область, на поверхности эмбриона к изображению.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если стабильная трансгенная MitoFish репортер линии, Tg (UAS-E1b: mYFP, mitoCFP) ^mde6, используется в сочетании с линией драйверов , таких как Хука: Gal4 тогда большинство RB нейроны помечены, и появляются в виде плотной тезч-работа аксонов беседок на поверхности зародыша. Если микроинъекции ДНК - конструкций используется для достижения разреженный маркировки (например, сенсорными: Gal4-VP16 с БАС: mitoCFP и UAS: MA-YFP), экран эмбрионов для выявления двойных меченных клеток.
   4. Откройте программное обеспечение микроскопа (μManager 1.4) и нажмите на кнопку "Illumination '' разделе" Настройки конфигурации ", чтобы определить правильные наборы фильтров для длины волны интереса (YFP или CFP для текущего примера). В разделе" Настройки фотокамеры "введите время экспозиции требуется, чтобы приобрести подходящее изображение.
      Примечание: "Установки" Освещение предварительно устанавливается пользователем при установке программного обеспечения и загружается при открытии μManager. Если программное обеспечение не настроен для управления фильтром колеса, вручную переместить фильтр колесо в башне в соответствующее положение.
   5. Изменение к цели воды окунание конуса длительный рабочее расстояние в диапазоне от 40-100x увеличения. выберитецель, которая имеет самую высокую числовую апертуру (NA) и хроматично исправлениями (апохромат).
   6. Нажмите на "Live", чтобы выбрать поле зрения: В случае РБ нейроне, изображение митохондриальной транспорта в стебле аксона, исходящий от тела клетки, или в периферической беседке.
      Примечание: Периферийные беседок РБ нейронов в хвостового плавника складки зародыша предоставляют идеальную возможность для изображения большого поля зрения , что является плоской и , следовательно , могут быть захвачены на одном кадре с широким полем микроскопа. Поэтому очень важно, чтобы смонтировать эмбриона, как плоско, как это возможно на его стороне, так что складка хвостового плавника параллельна дну чашки Петри.
   7. После выбора поля зрения, нажмите на кнопку "прямоугольное выделение" в меню ImageJ, определить область интереса (ROI) и нажмите на кнопку "ROI" в окне μManager. После выбора ROI для работы с изображениями, нажмите кнопку "Стоп" и "Сохранить", чтобы таKE изображение канала YFP записать локальную морфологию аксонов / с.
   8. Для изображения митохондриального транспорта нажмите на кнопку "Multi-D Acq." Кнопка. Обратите внимание дополнительное окно ( "Многомерные Acquisition") и выбрать количество временных точек, а также интервал между временными точками на этом окне. Используйте частоту кадров 0,3-1 Гц. Проведение записи по крайней мере 10 минут, чтобы собрать как можно больше данных-точек, как это возможно.
   9. В окне "Многомерные Acquisition", нажмите на "Каналы", добавить и определить длину волны для визуализации (CFP для митохондрий в данном примере) и времени экспозиции. Держите время экспозиции до уровня ниже 400 мс для визуализации митохондриальной транспорта.
   10. Нажмите на кнопку "Сохранение изображений" в окне "Многомерные Приобретение", чтобы автоматически сохранять файлы в определенной папке, изложенной в «корневой директории». Нажмите на кнопку "Acquire" в верхнем правом углу, чтобы начать тимэ покадровой визуализации.
   11. Вручную настроить фокус во время записи в заданный промежуток времени, чтобы компенсировать любой дрейф в размерности г.
       Примечание: Используя эти параметры митохондриальной транспорта в РБ нейронов могут быть отображены до тех пор, как 4 часа.
2. конфокальной микроскопии
   Примечание: Здесь представлены рекомендации для работы с изображениями с вертикальным Olympus FV1000 конфокальной микроскопии и целей воды окунание конуса дальнего рабочей дистанции. Микроскоп оснащен множеством лазерных линий и несколько детекторов (обычных ФЭУ и более чувствительных детекторов арсенид галлия фосфида), которые позволяют для многоканального изображения. Конкретная ссылка на программное обеспечение Olympus Fluoview. Тем не менее, параметры обработки изображений, описанные здесь, должны быть легко передаваемом к другим системам конфокальной.
   1. Mount эмбрионы в легкоплавких агарозном геле в ориентации , соответствующей для органа / структуры , которые будут отображены, как описано в разделе 4 выше.
   2. Разрешить блюдо с вмонтированной рыбы для уравновешивания до 28,5 ^о С в нагревательной камере на стадии микроскопа перед началом визуализации.
   3. Использование дистанционных целей воды окунание-конус дальнего работы для конфокальных микроскопов в вертикальном конфигурации. Выберите цели с максимально возможной NA, чтобы максимизировать количество флуоресцентных сигналов, которые могут быть собраны и имеют лучшую разрешающую способность. При сборе изображения из нескольких каналов выбирают хроматично скорректированные цели (Apochromat).
   4. Откройте программное обеспечение микроскопа и нажмите на кнопку "Trans лампа" или "Эпи лампа" использовать либо переданный или свет флуоресценции, соответственно, определить область интереса через окуляры микроскопа.
   5. Используйте программное обеспечение, чтобы настроить следующие параметры сканирования для получения изображений стеки:
      1. В окне "Настройка" Приобретение убедитесь, что цель выбрана для визуализации соответствует цели, которая появляется на раскрывающемся Дауп меню доступных задач.
         Примечание: Это должно гарантировать , что любые предварительно вычисленные параметры для конкретной цели (например, боковое и осевое разрешение, размер конфокальной апертуры и т.д.) справедливы и могут быть надежно использованы.
      2. Выберите соответствующие линии лазера / с, а также возбуждения и дихроичные эмиссии фильтров к изображению конкретного флуоресцентного белка (ов). Сделайте это, нажав на кнопку "список Краситель" в окне "Image Acquisition Control" и выберите соответствующий флуорофора / с. В качестве альтернативы, нажмите на кнопку "Light пути и красителей", чтобы установить эти параметры вручную.
         ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе опции кнопка "Dye список", программа автоматически выбирает соответствующие лазерные линии, возбуждения и эмиссии дихроичных фильтров и регулирует размер конфокальной апертуры соответствующим образом .
      3. В окне "Настройка" Приобретение, отрегулируйте "Zoom" фактор и "Размер жерехЭСТ отношение "(т.е., 512x512, 1024х1024 и т.д.) отсканированного изображения для получения размера пикселя , необходимые для наилучшего решения структуры изображаемого. Установить размер пикселя составляет около половины теоретического разрешения объектива, тем самым следуя критериям Найквиста . Чтобы определить размер пикселя полученного изображения нажмите на кнопку с символом для информации ( "I") в окне "Image Acquisition Control".
      4. Установите скорость сканирования до самой быстрой (2 мкс / пиксель) в окне "Настройка" Приобретение.
      5. В "Image Acquisition Control" окне на Калмана линии усреднения для уменьшения noise.A коэффициент от 2 до 3, как правило, достаточно.
      6. Выберите режим последовательного сканирования при визуализации флуорофоров с перекрытием спектров. Для этого нажмите на кнопку "Sequential" и "Линия" в окне "Image Acquisition Control".
      7. Регулировка выходной мощности соответствующих лазерных линий / с (как правило,менее 5%). Конкретные значения должны быть определены эмпирически.
      8. Нажмите на кнопку "XY Повторить" или "Фокус x2" или "Фокус x4" кнопку, чтобы непрерывно сканировать выбранный регион во время настройки параметров детектора для каждого канала. Регулируют "HV", "Gain" и "Смещение" для каждого канала, чтобы получить изображения, которые имеют самый высокий динамический диапазон значений серого.
         Примечание: Конкретные значения этих параметров должны быть определены эмпирически. "HV" регулирует напряжение на детекторе, чтобы изменить его чувствительность, "Смещение" регулирует выходной сигнал детектора и "Gain" умножает выходной сигнал детектора с помощью постоянного множителя.
      9. Нажмите сочетание клавиш Ctrl + H, чтобы визуализировать полученные изображения с помощью справочной таблицы (HiLo), который идентифицирует недостаточно насыщены (отображаются синим) и более насыщенных пикселей (появляются красные), оба из которых, как правило, следует избегать. Повторная оценка выходной мощности соответствующего лазера линьд / с и настройки детектора.
         Примечание: Использование высокой мощности лазера и высокие уровни "HV" детектора приведет к большему количеству сигнала. Более высокая мощность лазера будет, однако, приведет к увеличению отбеливания и фото-токсичности. Увеличение "HV" приведет к увеличению шума. Таким образом, компромисс должен быть найден при установке мощности лазера и "HV" , чтобы получать изображения с приемлемым уровнем шума, предотвращая фото-повреждения (см также таблицу 1).
      10. Сбор изображений с определенного объема, сосредоточив внимание на верхней и нижней границ области интереса. В "Приобретение Настройка" окна нажмите на "End Set" и "Start Set" набор кнопок окна Z-стека на верхней и нижней границ объема для включения в образ. Выберите размер шага , который составляет половину от г-разрешением для данной цели (например., Если разрешение г 2 мкм выбрать 1 мкм). Для определения Z-разрешение Объективе нажмите на кнопку с символом для информации ( "I") в окне "Image Acquisition Control".
      11. Настройка временных рядов для сбора Z-стеки на временной частоте, которая подходит для динамики внутриклеточной структуры изображаемого. В подокне "TimeScan" введите частоту, на которой г-стеки должны быть приобретены ( "интервал" ') и количество раз, изображения должны быть приобретены ( "Num").
      12. Нажмите на кнопку "Глубина" и кнопки "Время" в окне "Image Acquisition Control", чтобы подтвердить, что г-стек и временные ряды будут приобретены. Наконец, нажмите на кнопку "XYZT", чтобы начать приобретать покадровой изображения.
      13. После завершения захвата изображения, наблюдать "серии Done" на интерфейсе программного обеспечения. Нажмите на него, а также сохранять изображения в формате "OIB" для записи изображения и метаданные, связанные с ними.
          Примечание: Изображения , полученные наширокого поля микроскопа и конфокальной микроскопии можно визуализировать и анализировать с помощью программного обеспечения, таких как ФИДЖИ, свободной, являющейся общественным достоянием программы обработки изображений.

Здесь использование широкого поля и конфокальной микроскопии в митохондрии изображения и центросомах в живых эмбрионов данио непосредственно сравниваться и противопоставляться. В зависимости от расположения клеток, в которых динамика органелл должны быть рассмотрены и присущего частоты специфических внутриклеточных событий, как правило, либо широкого поля или конфокальной микроскопии является лучшим выбором. Мы в органеллы отображены RB нейронов, расположенных на поверхности зародыша и в клетки сетчатки, расположенные глубже. Поверхностное расположение RB нейронов вместе с их двухмерной геометрией делают их хорошими кандидатами для изображаемого обоими широким полем и конфокальной микроскопии (рис 2). Получение изображения с помощью конфокальной микроскопии, однако значительно медленнее и может привести к недооценке динамики специфических внутриклеточных событий (например, движение митохондрий, рис 2С, D ). Изображения клеток сетчатки, полученных с помощью широкого поля микроскопии страдают от плохого контраста в качестве флуоресцентных сигналов от большого объема ткани затемняет детали в фокальной плоскости. При этом оптическая способность секционирование конфокальной микроскопии результатов в заметно улучшенной контрастности (Рисунок 3).

Чтобы включить одновременную визуализацию органелл и клеточных мембран мы использовали систему Gal4-UAS в трех различных конфигурациях. Во- первых, репортер линия UAS MitoFish Tg (UAS-E1b: mYFP, mitoCFP) использовали ^mde6. Здесь двунаправленным UAS позволяет сопутствующую экспрессию митохондрии-целевой CFP и мембраны целевых YFP. В сочетании с соответствующими линиями водителя Gal4, MitoFish маркировать митохондриях и клеточных мембран RB сенсорных нейронов (рис 2А-С) или клеток сетчатки (рис 3А, В) с CFP и YFP г espectively. Во- вторых, два БАС конструирует (БАС: mitoCFP и UAS: MA-YFP) объединяли с конструкцией водителя Gal4 (Органолептический: Gal4-VP16, сенсорный нейрон-специфический энхансер элементы из гена Островок-1) ⁷ в установившемся инъекций. Мозаичный выражение , которое обычно является результатом этих инъекций допускается отслеживание отдельных клеток в течение нескольких дней (рис 2E). Третий подход применяется использование двух UAS кассет, каждая запуска экспрессии другого слитого белка, на одну непрерывную конструкцию. Эта стратегия была использована для создания CentrinFish Tg (UAS: cetn4-YFP, UAS: MA-Церулеан) ^tum1, в котором слияние centrin4-YFP маркирует центросомами и Церулеан предназначенного для клеточных мембран. В сочетании с определенными строк драйвера Gal4 центросомы и клеточные мембраны клеток сетчатки (рис 3C, D) или мышечных волокон (рис 4) помечены.

Рисунок 3: Сравнение широкого поля и конфокальной микроскопии для органелл изображения в естественных условиях в эмбриональном данио сетчатки.
Otx2 промоторные элементы управления экспрессией CFP в митохондрии и YFP в клеточных мембранах (А и В) или YFP в центросомах и Лазурная в клеточных мембранах (С и D) , в сетчатке 2 DPF эмбрионов данио рерио. Для достижения этой маркировки узор, Otx2: Gal4 трансгенные рыбы либо перешли на MitoFish (А и В) ог CentrinFish (C и D). Объектив апохромат 40x вода окунания-конус (NA 0.80) был использован для получения изображений одного и того же региона в каждой сетчатки с использованием широкого поля (A, C) и конфокальной (B, D) микроскопии. Вставки на А и Б показать деталь области внутреннего ядерного слоя, вклейки в C и D показывают ячейку в М-фазе. Масштабная линейка 20 мкм. Митохондрии целевой CFP (mitoCFP), мембранный целевой YFP (MA-YFP), centrin4-YFP (cetn4-YFP), мембранный целевой Церулеан (MA-Церулеан). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Сравнение широкого поля и конфокальной microscопировать для изображения центросомах в естественных условиях.
Один мышечных волокон с флуоресцентно меченый клеточные мембраны и центросомами (Otx2: Gal4; CentrinFish) изображался с использованием широкого поля (А) и конфокальной (B) микроскопии. В обоих случаях была использована цель A апохромат 40x воды окунание-конус (NA 0,80). Масштабная линейка 10 мкм. Centrin4-YFP (cetn4-YFP), мембранный целевой Церулеан (MA-Церулеан) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Здесь мы демонстрируем универсальность системы экспрессии Gal4-UAS к флуоресцентно митохондрий тегов, центросомах и клеточных мембран специфических типов клеток в естественных условиях в данио эмбрионов. Многие флуоресцентные белки слияния , которые этикетке другие органеллы или субклеточных структур можно найти в опубликованной литературе и могут быть получены из соответствующей лаборатории, коммерческих источников или некоммерческие плазмиды Депозитариев (например, Addgene). Чтобы разработать новый флуоресцентный белок слияния, несколько параметров, необходимо учитывать, в том числе, которые ФП использовать и нужно ли плавить FP на амино- или карбокси-конце белка, представляющего интерес. Для более подробного обсуждения о создании флуоресцентных слитых белков, читатели называют подробные статьи о предмете ^49-51.

Мы выделяем три стратегии для достижения совместного экспрессии слитых белков с использованием UAS-управляемых трансгенов. Многократная, separatе UAS репортерные конструкции позволяют комбинирования различных существующих репортеру конструкций без необходимости дополнительного клонирования. Уровни экспрессии репортер также можно титровать независимо друг от друга. Тем не менее, более высокие уровни коэкспрессией достигаются при использовании либо несколько кассет UAS или двунаправленным БАС кассета на одной конструкции. Так как Рамочные используются в качестве меток относительно легко проверить, коэкспрессии. Следует отметить , что другие методы мульти-cistronic выражения также существуют, в том числе использование внутренних сайтов рибосомных входа ⁴⁰ и вирусных пептидов 2А ^52,53. В качестве альтернативы конструкциям на основе ДНК, в пробирке транскрипции мРНК ограничен могут быть использованы для экспрессии флуоресцентных слитых белков для обозначения субклеточных структур ^1,4,8. Оговоркой этого подхода состоит в том, однако, что выражение применяется только в первые несколько дней развития и не клетка или тканеспецифичны. Независимо от выбранного метода, чтобы выразить слитые белки, очень важночтобы гарантировать, что уровни экспрессии, не приводят к неспецифической маркировки и поставить под угрозу физиологического состояния клеток. В связи с этим, усиление экспрессии гена - репортера , присущих системе Gal4-UAS ²⁷ может быть проблематичным, проявляющиеся, например , как в цитозоле маркировки , даже если ФП адресован конкретной органеллы. При наличии антител следует использовать для проверки того, что паттерны экспрессии, полученные слитые белки отражают эндогенный ситуацию. В некоторых случаях инъекции низких концентрациях (ER) ДНК может смягчить проблему неправильной локализации слитого белка. Альтернативно, векторы с низким числом БАС повторов может помочь титровать вниз уровни экспрессии трансгенов ^30. Аналогично, для активатора Gal4-VP16, существуют модифицированные версии, которые сообщили ему возможность управлять экспрессией сравнительно слабо , и, следовательно , менее токсичны ^30,33. Если неправильно локализации слитого белка сохраняется, несмотря на усилия титрование ДауN уровни экспрессии трансгена, это может быть необходимо, чтобы воздержаться от системы Gal4-UAS и управлять экспрессией промоутером элементов, непосредственно.

Стабильные трансгенные линии, MitoFish ¹⁰ и CentrinFish ^12, мы описываем в этой рукописи были сделаны с использованием 14xUAS кассет. Мы поддерживаем эти строки в фоне линий драйвера Gal4 для обнаружения изменений в экспрессии на протяжении многих поколений, так как репортер линии с несколькими повторами БАС сообщалось, склонны к глушителей ^54. Мы не видели доказательств глушителей в течение 3х поколений компания пропагандирует CentrinFish. Мы однако видели пестрые выражение в MitoFish и поэтому строго выбирать эмбрионов с "полными", сильные уровни экспрессии для распространения для будущих поколений. В современной литературе предполагает, что векторы экспрессии с 5xUAS повторов может быть альтернативой для создания устойчивых трансгенных линий - репортердоведенный до достаточно высоких уровней ³⁰ и сравнительно небольшое число БАС повторяет может сделать его менее склонным к трансгенов глушителей, хотя неповторяющееся UAS повторы , как сообщается , даже менее подвержены ^54.

Палитра FPs доступны для тегов органелл или других субклеточных структур в настоящее время очень широк ^55. При выборе конкретного FP в качестве тега, следует рассмотреть со следующими параметрами: во-первых, возбуждение и излучение спектры ФП для определения конкретной лазерной линии, а также возбуждения и эмиссии фильтров, необходимых для его визуализации. Во-вторых, яркость и фото-стабильность FP. В-третьих, скорость, с которой FP созревает следующий перевод. В-четвертых, имеет ли FP тенденцию к агрегации в слитых. Что касается последнего параметра, следует проявлять осторожность и контрольные эксперименты следует сделать, чтобы проверить пригодность каждого FP для конкретных экспериментов. Например, в то время как повторноеd FPs mCherry и DsRed широко используются, как сообщается , они образуют агрегаты в некоторых слитых ^56. Мы нашли TagRFP-T ^57, более фото стабильный вариант TagRFP, хорошо работать , когда она нацелена на митохондриях и клеточных мембран (неопубликованные наблюдения). Когда несколько органелл необходимо одновременно визуализировать, FPs с неперекрывающихся спектров следует использовать. Мы успешно использовали комбинации бирюзового FPs (СФП и Лазурная) и YFP (рис 2-4). Эксплуатируя весь спектральный диапазон от синего до ближней инфракрасной области спектра, можно значительно расширить число субклеточных структур , которые могут быть одновременно визуализированных ^2. В дополнение к обычному FPs, фото-активируемый FPs особенно полезны для исследования динамики органелл, например, использование FP Kaede отслеживать судьбу отдельных митохондрий ^58.

Какой метод микроскопии - широкого поля или конфокальной - это самыйподходит для обработки изображений, зависит от ряда факторов, в том числе расположения клеток, подлежащих изображаемого, и скорость, с которой определенные субклеточных или клеточных событий, как ожидается, будут иметь место. Широкое поле микроскопия является предпочтительным методом в поверхностных местах и ​​редко меченых образцов. Он предлагает низкую фото-токсичность и изображений на высокой скорости по разумной цене. Тем не менее, если необходимо выполнить в не поверхностных частях данио, в плотно меченых образцах или получить трехмерную информацию, конфокальный или иной формы оптической микроскопии секционирования изображения становится методом выбора.

Независимо от того, который находится под контролем сотовой или субклеточная структура, часто существует компромисс между приобретением наилучшего изображения и сохранить образец живой и в хорошем физиологическом состоянии для повторного покадровой обработки изображений. Фото-токсичность может проявляться в виде изменений в поведении органелл, аномальным морфологии клеток или даже клеткисмерть. Ключ к снижению фото-отбеливание и фото-токсичности как для широкого поля и конфокальной микроскопии является использование минимально возможных уровней света для получения изображений. В связи с этим, задачи с максимально возможной НС являются ключевыми для максимального количества флуоресцентного сигнала, который может быть собрана. Для конфокальной микроскопии, ряд параметров можно регулировать, чтобы компенсировать использованием более низкой мощности лазера. Детекторы с более высокой квантовой эффективностью по сравнению с обычными ФЭУ, например, детекторы фосфида арсенида галлия, могут быть использованы для обеспечения того , чтобы излучаемых фотонов, более вероятно, будут обнаружены. В качестве альтернативы или дополнительно, более высокие динодной напряжения могут быть применены в РМТ для увеличения чувствительности детекторов. Конфокальной диафрагмы (пинхол) могут быть открыты, чтобы обеспечить сбор большего количества флуоресцентного сигнала, хотя и с потерей осевого разрешения. Для того, чтобы выставить образцы как мало света, как это возможно, сканирование должно быть сделано на высоких скоростях, таких, что время выдержкилазер на пиксель является низкой. Сканирование при более низком пространственном разрешении также имеет эффект увеличения скорости сканирования. Обработки изображений реже имеет дополнительное преимущество воздействия на образец меньше света, тем не менее следует рассматривать только, если он не ставит под угрозу комплексную выборку исследуемых процессов.

В качестве альтернативы, вращающийся диск конфокальной микроскопов и конфокальных микроскопов, которые оснащены так называемой «резонансной» сканера предоставляют возможность для быстрого сканирования. Обе формы имеют то преимущество, что они быстрее и меньше фото-токсичны, чем «классический», точка-сканирующей конфокальной микроскопии. Тем не менее, вращающийся диск конфокальной микроскопы более ограничены в г-разрешением и не может проникнуть как можно глубже в ткани, как точка-сканирующей конфокальной микроскопии. Аналогичным образом, применение резонансного сканера конфокального микроскопа может быть ограничено, как очень коротким пиксельной времени задержки приведет к ухудшению качества изображения, которые могли бы,в свою очередь, исключает обнаружение субклеточных событий (например, двоичная снимки с приглушенным сигнал-шум).

И, наконец, в то время как широкие поля и конфокальной микроскопии выделены здесь, другие формы световой микроскопии , таких как двухфотонное ⁵⁹ и световой микроскопии листа ⁶⁰ может быть более подходящим для конкретных вопросов. Двухфотонное микроскопия основана на возбуждении флуорофора путем одновременного поглощения двух фотонов в инфракрасном диапазоне светового спектра. Совместно с конфокальной микроскопии, он использует сканирование точки для получения изображений из образца и имеет оптические возможности секционирования в силу нелинейности двухфотонного возбуждения. Использование длинных длин волн света для флуорофора возбуждения позволяет визуализацию на глубине нескольких сотен микрон от поверхности. Кроме того, ограничение возбуждения до небольшого объема изображения предотвращает фото-отбеливание и фото-токсичностью вне фокальной плоскости. Однако, не все FPs имеют высокое поглощение многофотонная сечения, проблема, которая особенно распространена в красном FPs. Кроме того, нахождение одного инфракрасного длины волны одновременно возбуждают несколько отдельных FPs трудно, что делает изображения многоканальное громоздким. Светло-лист микроскопия использует тонкий лист '' (как правило, толщиной от 2 до 10 мкм) лазерного света для возбуждения образца и обнаруживает флуоресцентные сигналы от этой освещенной фокальной плоскости под прямым углом с помощью чувствительного камеры. Оптический секционирование достигается путем освещения одной плоскости, в то время. Это ограничение возбуждающего света уменьшает возникновение фото-токсичности. Так как сигналы флуоресценции от всей освещенной плоскости собираются одновременно, получение изображений значительно быстрее, чем точка сканирующей конфокальной и многофотонной микроскопов. Все эти характеристики делают световой микроскопии лист особенно подходит для визуализации динамических клеточных событий с высоким пространственно-временным разрешением вбольшие объемы живых образцов. Действительно, с помощью световой микроскопии листа судьбы клеток во всем данио эмбриона был всесторонне отслеживаться в течение первых 24 ч развития ^61. При продолжении улучшения лучшего ^62,63 проникновения изображения и пространственным разрешением ^64, можно предположить , что световой микроскопии листа будет использоваться для исследования динамики не только на клеточном , но и на субклеточном уровне в целом эмбрионов данио.

The authors have nothing to disclose.

P.E. is supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Training Group 1373 and the Graduate School of the Technische Universität München (TUM-GS). G.P. was supported by TUM-GS. L.T. is supported by an EMBO fellowship (EMBO ALTF 108-2013). D.P.'s work on zebrafish was supported by the DFG through the Sonderforschungsbereich "Molecular Mechanisms of Neurodegeneration" (SFB 596); the Center for Integrated Protein Sciences (Munich) and the European Community's Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) under Grant agreement no. 200611 (MEMOSAD). He is currently a New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow and was supported by a fellowship from the German Academy of Sciences Leopoldina. L.G. is supported by funding from the DFG through SFB 870 "Assembly and Function of Neuronal Circuits", Project A11.

We are grateful to Kristina Wullimann for maintaining our fish facility, Yvonne Hufnagel for technical support and Thomas Misgeld for comments on the manuscript. We are grateful to R. Köster (Technische Universität Braunschweig) for providing the M1 Medusa vector (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP) from which we cloned out Centrin-YFP and S.C. Suzuki and T. Yoshimatsu (University of Washington) for providing the 14xUAS:MA-cerulean cassette which we used to generate the reporter construct to make CentrinFish. We further thank S.C. Suzuki and T. Yoshimatsu (University of Washington) for the Otx2:Gal4 transgenic line, A. Sagasti for the Sensory:Gal4-VP16 construct (UCLA) and M. Nonet (Washington University in St. Louis) for the pCold Heart Tol2 vector. We acknowledge Bettina Schmid, Alexander Hruscha and Christian Haass (German Center for Neurodegenerative Diseases Munich - DZNE) for contributing to the development of MitoFish.