Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

In - vivo - Bildgebung bietet eine direkte Visualisierung von zellulären Verhalten in der die meisten physiologischen Kontext. Die Transparenz der Genaktivität, deren schnelle und externe Entwicklung und eine reiche Auswahl an genetischen Werkzeugen , die Fluoreszenz - Markierung ermöglichen , sind alle auf den wachsenden Einsatz von In - vivo - Mikroskopie beigetragen , die Dynamik der wichtigsten Entwicklungsereignisse aufzuklären. Imaging - Studien von Entwicklung des Nervensystems in Zebrabärbling haben zum Beispiel unser Wissen über das Verhalten von neuralen Vorläuferzellen und das Schicksal ihrer Nachkommen einschließlich ihrer späteren Migration erweitert, Differenzierung und Schaltungsintegration ^1-8.

Die Bühne ist nun eingestellt, die subzellulären Dynamik zu untersuchen, diese zellulären Verhaltensweisen zugrunde liegen. Tatsächlich sind, Zebrabärbling bereits als Werkzeuge werden für die in vivo Zellbiologie ausgebeutet. Es ist nun möglich , die Mitochondrien zu visualisieren ^9-11, Zentrosomen ^2,8,12-14, Golgi ¹⁵, Die Mikrotubuli ⁴ und Aktin - Zytoskelett ^16, Endosomen ¹⁷ und Komponenten des Apikalmembran komplexen ^1.18 unter anderem subzellulärer Strukturen in Zebrafischembryonen in vivo. Bisher viel von dem, was über die Funktion dieser Organellen bekannt ist, kommt von ihrem Verhalten in kultivierten Zellen zu studieren. Während in - vitro - Studien enormen Einblick in die Zellbiologie ergeben haben, Zellen in Kultur repräsentieren nicht vollständig die Komplexität der in vivo - Situation und daher nicht notwendigerweise die Funktion und Dynamik subzellulärer Organellen in vivo widerspiegeln. Zebrabärbling - Embryonen bieten eine tragfähige in vivo alternative subzellulären Dynamik zu untersuchen.

Da Vertebraten besitzen Zebrabärbling viele Organsysteme (beispielsweise neurale Netzhaut), die mit denen in Säugetierspezies gefunden homolog sind. Zusätzlich werden Genaktivität zunehmend eingesetzt, um menschliche Krankheiten zu modellieren ^19,20 (Mikrozephalie ²¹ und Leber ²² kongenitale Amaurose zB) einschließlich und auf die mitochondriale Funktion im Zusammenhang mit zentrosomalen Funktion (zB Parkinson - Krankheit ^23, Tauopathies ^10,24 und Barth - Syndrom ^25). In - vivo - Bildgebung auf zellulärer und subzellulärer Ebene in diesen Fällen wird ein besseres Verständnis der Zellbiologie erlauben diese pathologischen Zustände zugrunde liegen.

Das übergeordnete Ziel der hier beschriebenen Methoden ist es, eine umfassende Anleitung zur Verfügung zu stellen Organellen und andere subzellulärer Strukturen in Zebrafischembryonen in vivo Lichtmikroskopie zu untersuchen. Der gesamte Arbeitsablauf beteiligt bei der Visualisierung und Verfolgung von subzellulärer Strukturen in vivo beschrieben - von der genetischen Markierung Ansätze zur Erzeugung von transiente Expression und stabile transgene Fische und schließlich mit großem Feld und konfokale Mikroskopie auf Bildgebung. Während jedes dieser procedures von zahlreichen Zebrabärbling Laboratorien verwendet wird, die beschriebenen Protokolle werden optimiert und rationalisiert für die Dynamik subzellulärer Strukturen zu untersuchen. Zwei spezifische Aspekte der Arbeit hier beschriebenen rechtfertigen erwähnt: Erstens, die Verwendung des Gal4-UAS-Expressionssystems in verschiedenen Konfigurationen zu genetisch Etikett Organellen in bestimmten Zelltypen. Zweitens ist ein direkter Vergleich der Weitfeld und konfokale Mikroskopie Bild subzellulärer Strukturen in vivo.

Aktuelle Strategien zur genetisch Label Organellen und andere subzellulärer Strukturen in Zebrabärbling entweder nutzen verkappte mRNA ^1,4,8 oder DNA - basierte Konstrukte , wo Promotorelemente , die Expression von Fusionsproteinen ^9,14,15 direkt fahren. In vitro transkribierten RNA gekappt Ergebnisse in schnelle und breite Ausdruck, das ist aber nicht gewebespezifisch. Zusätzlich verringern Expressionsniveaus im Laufe der Zeit als das verkappte RNA verdünnt wird oder abgebaut. Somit ist die Verwendung von RNA-basiertenKonstrukte zu Organell Dynamik in späteren Stadien in der Entwicklung beschränkt ist (in der Regel bis zu 3 Tage nach der Befruchtung) untersuchen.

Diese Einschränkungen können durch die Verwendung von DNA-Konstrukten überwunden werden, wo räumliche und zeitliche Kontrolle der Expression durch spezifische Promotorelemente bestimmt wird. Wenn DNA - Konstrukte basieren in Kontext der Gal4-UAS - System wesentliche Verbesserungen an Transgen - Expressionsniveaus verwendet werden , werden ^26,27 beobachtet. In diesem bipartite Expressionssystem, Zelltyp-spezifische Promotorelemente treiben, die Expression eines Transkriptionsaktivators Gal4, während Reportergenen stromabwärts von der Gal4-Bindungsstromaufwärts Aktivierungssequenz kloniert werden (UAS). Durch UAS Reporter mit entsprechenden Gal4 Treiber kombinieren, können die Expression auf bestimmte Zelltypen beschränkt werden, wodurch die Notwendigkeit umgangen werden jedes Mal zu klonen Reportergene hinter verschiedenen Promotoren eine spezifische Expressionsmuster gewünscht wird. Des Weiteren kann die Expression mehrerer UAS Reportergene seindurch einen einzigen Gal4 Aktivator angetrieben. Das Gal4-UAS-System stellt somit ein vielseitiges und flexibles genetischer Ansatz für subzelluläre Kennzeichnung.

Breitfeld und konfokale Mikroskope sind die Arbeitstiere der meisten Laboratorien. Weitfeldsysteme typischerweise eine Bogenlampe als Lichtquelle verwenden, und das emittierte Licht mit einer empfindlichen Kamera erkennen, die am Ende des Lichtweges angeordnet ist. Diese Bildgebungsverfahren wird in der Regel auf dünne Proben beschränkt, wie Out-of Fokus Licht verschleiert im Fokus befindlichen Informationen in dickeren Proben. Die konfokale Mikroskope unterscheiden sich von Weitfeld - Systemen dadurch , dass sie gebaut werden Signale zu bevorzugen , die von der Fokusebene über diejenigen , die ihren Ursprung außerhalb des Fokus (dh "optischen Schneidens") ²⁸ stammen. Zu erreichen optischen Schneidens wird ein Pinhole im Emissionspfad in einer konjugierten Position zu der Punktlichtquelle angeordnet. Laser werden als Lichtquellen verwendet, und Signale werden mit Photomultipliern (PMTs) nachgewiesen. Praktisch wird ein LaserStrahl über die Probe Punkt-für-Punkt und der Fluoreszenzemission bei jedem Punkt (Pixel) swiped von der PMT detektiert wird.

Hier Bild, das wir die gleichen subzellulärer Strukturen in Genaktivität leben beide mit großem Feld und konfokaler Mikroskopie mit einem direkten Vergleich der beiden Mikroskopie Modalitäten zur Verfügung zu stellen. Die zugrunde liegende Ziel solcher Vergleiche der Bereitstellung ist es, Richtlinien zu bieten für die am besten geeignete Mikroskopietechnik für die spezifische Frage auf der Hand entschieden haben.

Mit Hilfe der beschriebenen Ansätze hier zeigen wir Gal4-UAS basiert die genetische Markierung der Mitochondrien und Zentrosomen. Diese Organellen sind in verschiedenen Zelltypen des Nervensystems und in Muskelzellen abzubildenden Verwendung Weitfeld und konfokale Mikroskopie die Eignung jedes Bildgebungsmodalität zu demonstrieren. Die hier beschriebenen Verfahren können leicht zur Untersuchung von anderen Organellen und subzellulären Strukturen im lebenden Zebrafischembryo angepasst werden.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den örtlichen Vorschriften der Regierung von Oberbayern (München, Deutschland) durchgeführt.

1. Labeling Organell und andere subzellulärer Strukturen

HINWEIS: Hier genetische Reporter - Konstrukte , dass fluoreszenz Tag Zentrosomen, Mitochondrien und Zellmembranen beschrieben werden.

1. Verwenden Sie herkömmliche Klonierungsverfahren ²⁹ - Fusionsproteine ​​zu erzeugen , die fluoreszenz Zentrosomen und Mitochondrien beschriften. Klon der kodierenden Sequenz von Zebrabärbling centrin4 (cetn4) in-frame mit einem fluoreszierenden Protein ² (FP) , wie beispielsweise Yellow fluorescent protein cetn4-YFP zu erzeugen. Klonieren die mitochondriale Targeting - Sequenz der Untereinheit VIII der Cytochrom - c - Oxidase in-frame mit einer FP wie Cyan fluorescent protein mitoCFP ^9-11 zu erzeugen.
2. Um zu verhindern, die Expression der Fusionsproteine ​​(cetn4-YFP oder mitoCFP) auf bestimmte Zellen des zebrafish Embryo (zB Neuronen oder Muskelzellen) verwenden , um die zweiteiligen Gal4-UAS - Expressionssystem ^26,27. Erzeugen Sie zunächst ein UAS-Reporterkonstrukt. Verwenden herkömmliche Verfahren für das Fusionsprotein in einem UAS - Expressionsvektor zu klonieren, stromabwärts von der Gal4-UAS - Bindungskassette (Varianten liegen im Bereich von 1x bis 14x UAS, siehe Diskussion) ^26,27,30 und einen Minimalpromotor (E1b basalen Promotor aus dem Karpfen βactin-Gen), und erzeugen UAS: cetn4-YFP und UAS: mitoCFP.
   HINWEIS: UAS Reporter Zur Vorbereitung Konstrukte für stabile transgene Linie Generation zusätzliche Elemente müssen geklont werden (siehe 3 unten)
3. Um den zellulären Kontext zu visualisieren, in der Zentrosomen oder Mitochondrien markiert sind, erzeugen UAS Reporterkonstrukte, in denen die Zellmembranen von FPs markiert sind. Klon , der die ersten zwanzig Aminosäuren von Zebrabärbling GAP43 (Palmitoylierung Stellen enthält) im Rahmen mit einem FP zum Ziel , dass FP an die Zellmembran (memFP) ^31,32.
4. obtain Treiberkonstrukte oder transgenen Linien in dem Zelltyp - spezifischen Promotor - Elemente treiben die Expression des transkriptionellen Aktivators Gal4-VP16 ^{27, 33} oder Gal4FF KalTA4 ^30.
5. Kombinieren der UAS - Reporter mit einem geeigneten Treiber Konstrukt Expressionskonstrukte auf den gewünschten Zelltyp von Interesse zu beschränken (beispielsweise in Neuronen oder Muskelzellen). Dazu Co-injizieren Gal4 Treiber und UAS - Reporter - Konstrukte an der einen Zellstadium der befruchteten Eier (für detaillierte Anweisungen siehe 2 unten) zu erzeugen transient Fisch Ausdruck zu bringen. Alternativ können Sie eine UAS Reporter stabile transgene Linie erzeugen (für detaillierte Anweisungen 3 unten) und überqueren auf einem Gal4 Treiber stabil transgene Linie Nachkommen zu erzeugen beide Transgene tragen.
   HINWEIS: Es ist auch möglich , UAS Reporterkonstrukts / s in befruchtete Eier aus einer Gal4 - Treiber stabilen transgenen Linie oder einer Gal4 - Treiber - Konstrukts in - Dünger einzuspritzened Eier aus einer UAS Reporter stabil transgene Linie.
6. Um coexprimieren mehrere verschiedene Fusionsproteine ​​mit dem Gal4-UAS - System, verwenden Sie einen Gal4 Treiber und UAS - Reporter / s in einer der folgenden Konfigurationen: A. mehrere separate UAS Reporterkonstrukte (zB UAS: mitoCFP und UAS: memYFP co -injected mit einem Gal4 - Treiber - Konstrukt) ^10, B. Multiple UAS - Kassetten auf einem einzelnen Reporter (zB UAS: cetn4-YFP, UAS: memCerulean) ¹² C. Bidirektionale UAS Reporter (zB UAS: memYFP, mitoCFP) ^2,10,24 (Abbildung 1).

Abbildung 1. Strategien zur coexprimierender Fusionsproteine ​​die Gal4-UAS - System.
(A) mehrere separate UAS-driven konst: Co-Expression mehrerer Fusionsproteine ​​können unter Verwendung von UAS Reporter Kassetten in verschiedenen Konfigurationen erreicht werdenructs, (B) mehrere UAS - Kassetten auf einem einzigen Konstrukt oder (C) eine bidirektionale UAS - Kassette auf einem einzigen Konstrukt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. Generieren Sie transient Fisch Ausdruck

HINWEIS: Das folgende ist eine Anpassung der bisher veröffentlichten Protokolle ^34,35. Eine grundlegende Injektion Setup sollte ein Stereomikroskop mit einem Vergrößerungsbereich von bis zu 12-fach, einen Mikromanipulator mit einer Mikropipette Halter und eine Luftdruckquelle umfassen. Bereiten Sie 2,1-2,5 vor der Zeit:

1. Ei Mikroinjektionskammern, bereiten eine Lösung von 1,5% (w / v) Agarose in Wasser herzustellen. Hinzufügen Agarose Pulver für Wasser und Mikrowellen, bis die Agarose vollständig gelöst ist. Füllen Sie eine Petrischale (100 x 15 mm) mit dieser Lösung.
   1. Lassen Sie die Agarose-Lösung zur Kühlung auf ca.oximately 45 ^o C vor einer Kunststoffmikroinjektionsform (40 mm x 66 mm, mit 6x 50 mm langen Rippen , die 1,5 mm breit, 1 mm tief und im Abstand von 3 mm auseinander) Anordnen auf der Oberfläche des geschmolzenen Agarose, dabei nicht auf einführen Blasen an der Grenzfläche.
   2. Nachdem die Agarose - Sets, bei 4 ^o CO / N. Entfernen Sie vorsichtig die Form einer Spachtel. Bereiten Sie mehrere Mikroinjektionskammern zu einem Zeitpunkt, bei 4 ^° C und verwenden immer wieder über mehrere Wochen.
2. Verwenden Sie eine Mikropipette Puller Glas Injektionskapillaren mit einem langen Schaft ³⁶ zu erzeugen.
   HINWEIS: Die spezifischen Einstellungen verwendet Injektionskapillaren zu erzeugen sollte empirisch bestimmt werden. Injektions Kapillaren vor der Zeit gezogen werden und vor dem Gebrauch gelagert.
3. Messen der Konzentration von Plasmid-DNA (Gal4-Treiber und UAS Reporterkonstrukte) für die Mikroinjektion eines Spektrophotometers nach Herstelleranleitung verwendet wird. Messen60, wobei das Verhältnis der Absorption bei 260 nm und 280 nm (A260 / 280). Verdünne die DNA bis zu einer Endkonzentration von 100 ng / ul in Nuclease-freiem Wasser.
   HINWEIS: Ein A260 / 280 - Verhältnis von ~ 1,8 bedeutet reine DNA. Betrachten wir einen kommerziellen Kit (bezogen auf Siliciumdioxid basierende Bindematrix), um die Plasmid-DNA zu reinigen, zur Injektion verwendet werden. Plasmid DNA sollte von hoher Qualität sein Toxizität zu verhindern.
4. Herstellung von 10 & mgr; l Injektionsmischung durch Kombinieren von DNA (0,5 bis 2,5 ul einer 100 ng / ul Lager für eine Endkonzentration von 5 bis 20 ng / ul), Danieau-Lösung (0,33 & mgr; l 30x Lager), Phenolrot (0,25 & mgr; l, optional) und Nuklease-freies Wasser bis zu einem 10 & mgr; l Gesamtvolumen.
   HINWEIS: Empirisch die Konzentration von DNA bestimmen , die geeigneten Expressions ergibt. GAL4 UAS Fahrer und Reporterplasmide müssen coinjiziert werden. Kein Ausdruck wird folgen, wenn nur der Gal4-Treiber oder UAS Reporterplasmid in Wildtyp befruchteten Eier injiziert wird. Wenn jedoch ter befruchtete Eier sind von einem Gal4 Fahrer dann Injektion eines oder mehrerer UAS Reporter Plasmide genügt. Umgekehrt, wenn in eine UAS reporter Leitung Mikroinjizieren nur der Gal4-Treiber Plasmid muss injiziert werden. Schließlich, während Phenolrot stark Injektionen kann helfen, zu visualisieren, es ist auch eine fluoreszierende Verbindung selbst. Daher könnte Phenol Red Visualisierung FPs verschleiern wenn die Bildgebung vor 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF) geplant ist, da es nicht ausreichend Zeit verdünnt werden können.
5. Am Abend vor Injektionen sind geplant, mehrere Paare (in der Regel 5 bis 10) der männlichen und weiblichen Zebrabärbling für die Zucht eingerichtet. Verwenden Zuchtbecken mit einem Einsatz eines gerasterten Boden und eine herausnehmbare Trennwand mit dem männlichen und weiblichen Fische zu trennen.
   HINWEIS: Männliche und weibliche Zebrabärbling kann in der Regel durch ihre Körperform zu unterscheiden. Männer neigen dazu, schlank zu sein, während Frauen einen ventral vorstehende Bauch zu zeigen neigen. Männer neigen dazu, zusätzlich eine gelblich-rot col habenoring auf ihrem ventralen Bauchbereich.
6. Unmittelbar vor der DNA-Injektionen, entfernen Sie die Teiler der männlichen und weiblichen zu ermöglichen, sich zu paaren. Etwa 15 bis 30 min nach dem Entfernen Teiler am Boden des Tanks für Eier überprüfen. Übertragen Sie die erwachsenen Fische ein Fischernetz an einen neuen Zuchtbecken mit.
7. Gießen Sie das Wasser, die neu verlegten befruchtete Eier enthält, aus dem Zuchtbecken in ein Sieb ( zum Beispiel ein Kunststoff Teesieb). Waschen Sie die Eier in das Sieb mit einer Sprayflasche mit Danieau-Lösung verwendet wird. Kehren Sie die Sieb auf eine Petrischale und verwenden Sie eine Sprühflasche mit Danieau Lösung alle Eier zu erholen (in der Regel 50 bis 200 Eier pro Brutpaar von erwachsenen Fischen).
8. Mit Hilfe einer Micropipette Rück füllen eine zog Injektionskapillare mit der DNA-Injektion-Mix. Montieren Sie die Injektionskapillare in den Halter eines Mikromanipulators und schneiden Sie die Spitze unter der visuellen Kontrolle eines Stereomikroskops, Zange mit einer Mikropipette zu schaffen, die Penetrate das Chorion und Zytoplasma, während in der Lage, ein geeignetes Volumen der DNA zu liefern.
   HINWEIS: Der Grad , bis zu dem die Spitze der Injektions kapillaren getrimmt wird , sollte empirisch bestimmt werden und kann am besten beurteilt werden , wenn Eier injizieren.
9. Um das Volumen von DNA zur Injektion Bestimmung Entladen eines Tropfens der Injektionslösung in Mineralöl. Messen der Radius (r) des Tropfens eines Kalibrierungsmikrometers und berechnen dessen Volumen (4/3 π r ^3). Modulieren des Volumens durch den Einspritzdruck eingestellt und / oder die Dauer der einzelnen Einspritzimpulses.
10. Mit Hilfe einer Plastikpipette, übertragen alle gesammelten Eier ( in der Regel 50 bis 200, von 2,7 oben) in die Gräben einer Mikroinjektionskammer. Unter der visuellen Kontrolle eines Stereomikroskops, verwenden Zange um die Eier zu orientieren, so dass die Zelle Zytoplasma (transparent) und Dotter (dichte, nicht-transparent) leicht identifiziert werden.
11. Unter der visuellen Kontrolle eines StereoMikroskop, DNA in das Zytoplasma der befruchteten Eizelle zu injizieren, darauf, dass das injizierte Volumen (1 bis 2 nl) entspricht etwa 10% des Zellvolumens, um sicherzustellen, nehmen.
    HINWEIS: Phenolrot in der DNA - Lösung hilft bei der Visualisierung des Volumens eingespritzt.
12. die Eier aus den Schützengräben der Spritzgießform Nach der Injektion lösen, indem sie mit einer Sprühflasche enthält Danieau-Lösung gespült wird. Anschließend übertragen Eier in eine frische Petrischale eine Plastiktransferpipette und in einem 28,5 ^o C Inkubator erhalten.
13. Pflegen un-injizierten Eier als Kontrolle, um zu bestimmen, ob Injektionen zu hohe Sterblichkeitsraten beitragen, entweder als Ergebnis einer physischen Beschädigung während der Mikropipette Penetration oder der DNA-Mischung aufrechterhalten.
    HINWEIS: Hohe Sterblichkeitsraten folgenden Injektionen könnten aufgrund zahlreicher Faktoren, einschließlich der zu hohen DNA - Konzentration oder Injektionsvolumina und / oder Plasmide mit contaminants. Um die Toxizität von geringer Qualität DNA-Preps, kommerzielle Kits (auf Basis von Silica-basierte Bindematrix) zu verhindern, können verwendet werden.
14. In regelmäßigen Abständen folgenden Injektionen, verwenden Sie ein Stereomikroskop für unbefruchtete Eier und tote oder ungültiges Embryonen zu screenen und diese zu verwerfen.
    HINWEIS: halten , damit die Eier , die mehrere Stunden bei der eine Zellstadium nach der Befruchtung zu sein scheinen, wie unbefruchtete. Identifizieren Sie ungültiges Embryonen, die durch grobe anatomische Defekte wie ein geschwächtes anterior-posterioren Körperachsen. Amorphous Materials innerhalb eines Chorion legt nahe, dass der Embryo nicht durch Entwicklungsstadien gehen und starb. Um festzustellen , ob Embryonen , die einen normalen Verlauf der Entwicklung mikroinjiziert wurden unterziehen ³⁷ anatomischen Atlanten konsultieren.
15. Transfer der Embryonen eine Kunststofftransferpipette zu Danieau Lösung verwendet, enthaltend 1x 1-Phenyl-2-thioharnstoff (1xPTU) zwischen 10 und 24 hpf Pigmentbildung zu verhindern. Pflegen Sie die Embryonen in Danieau Lösung containing PTU für die Dauer des Experiments.
    HINWEIS: Zusätzlich zu den Melanophoren, Iridophoren auf der Oberfläche der Haut kann für die Bildgebung problematisch sein. Während PTU nicht hemmt Iridophoren Bildung, existieren Mutantenlinien mit reduzierter Anzahl von Iridophore wie Roy Orbison (roy) und ³⁸ verwendet werden.
16. Nach Embryonen Luke (in der Regel am zweiten oder dritten Tag nach der Befruchtung, 2 oder 3 dpf), die Chorion zu verwerfen und die Danieau die Lösung, die PTU auszutauschen.
    Hinweis: Diese Schritte sind wichtig , um die Qualität des Embryos Medium und die Lebensfähigkeit der gesunden Embryonen zu gewährleisten.

3. Generieren Stabile transgene Linien

HINWEIS: Stabile transgene Linien effizient erzeugt werden können , die Tol2 Transposon - System. Ein Tol2 Transposon-Vektor das Transgen von Interesse ist Co-Injections zusammen mit mRNA codiert, das Transposaseenzym in befruchten enthältd Eier an der Ein-Zell-Stadium. Transposase - Protein aus der injizierten mRNA abgeleitet katalysiert die Exzision der Transgen - Kassette aus dem Transposon - Vektor und seiner Integration in das Genom ^39.

1. Klonieren das Transgen Reporterkassette (zB UAS: mitoCFP) zwischen Tol2 invertierten terminalen Repeats in einer der Tol2 Vektoren gegenwärtig in der Zebrabärbling - Gemeinschaft verwendet wie ⁴⁰ beschrieben.
   HINWEIS: Tol2 Vektoren einen selektierbaren Kassette enthält , in dem Promotorelemente FP - Expression in Organsysteme nicht mit dem Bereich von Interesse Antrieb (zB Herz ⁴¹ oder Linse ⁴²⁾ sind nützlich für das Screening von UAS reporter transgenen Linien in Abwesenheit von GAL4 - Transaktivierungs .
2. Verwendung eines kommerziellen Kits (bezogen auf Siliciumdioxid basierende Bindematrix), reinigen die Plasmid DNA für die Injektion verwendet werden. Sicherzustellen, dass die Plasmid-DNA von hoher Qualität ist die Toxizität zu verhindern.
3. Transkribieren Tol2 Transposase kodierenden mRNA unter Verwendung einesentsprechende Transkriptionsvektor wie PCS-TP ^43. Kurz gesagt, linearisieren PCS-TP und eines kommerziellen Kits verwenden, um mit einer Kappe bedeckt mRNA erzeugen und Protokoll des Herstellers folgen. Achten Sie darauf , eine Kontamination mit RNasen zu vermeiden (zB verwenden RNAse-freie Pipettenspitzen und Rohre). Aliquot der RNA, bei einer Konzentration von 100 ng / ul, für den Einmalgebrauch und bei -80 ^o C
4. Am Morgen der Injektionen, eine aliquote Menge von Transposase mRNA auf Eis auftauen. Mischen Sie die Transposon-DNA-Vektor (2 ul 100 ng / ul) und Transposase mRNA (2 ul 100 ng / ul) in einem Verhältnis 1: 1, und fügen Sie 6 ul Wasser RNAse-frei, das Gesamtvolumen bringen zu 10 ul.
   HINWEIS: Eine Konzentration von 20 ng / & mgr; l für jede empfohlen , aber die optimale Konzentration sollte empirisch bestimmt werden. Verwenden Sie RNAse-freies Wasser zur Verdünnung. Verwenden Sie Handschuhe, wenn die DNA-RNA-Injektion Mix Handhabung und halten Sie sie auf Eis für den gesamten Zeitraum von Injektionen Abbau des m zu verhindernRNA.
5. Mit den detaillierten Anweisungen in Abschnitt 2, injizieren , um die DNA-RNA - Injektion Mischung in befruchtete Eier an der Ein-Zell - Stadium. Unter visueller Kontrolle eines Stereomikroskops an der Ein-Zell-Stadium Zytoplasma der Zelle Ziel für die höchsten Raten von Transgene Effizienz. Pflegen Sie die injizierten Embryonen bei 28,5 ^° C , bis sie bereit für die transgene Expression zu screenen.
   HINWEIS: Die PCR kann für die Effizienz des Tol2 Transposase zu überprüfen durchgeführt werden , wie zuvor ⁴⁴ beschrieben.
6. Bildschirm Embryonen in einer Petrischale für die Transgenese unter Verwendung der Okulare eines Fluoreszenz Binokular.
   HINWEIS: Verwenden Sie die entsprechenden Filtersätze des Mikroskops FP Expression des selektierbaren Kassette (dh Fluoreszenz im Herzen oder Linse) bei 2 oder 3 dpf zu visualisieren. Identifizieren Sie potenzielle transgenen Embryos durch den Ausdruck (in Herz oder Linse) und heben diese Embryonen bis zum Erwachsenenalter (F ₀ -Generation) unter Verwendung von StandardProtokolle ^45. Alternativ identifizieren potenzielle transgenen Embryonen , die durch PCR , wie in ⁴⁶ beschrieben.
7. Sobald die UAS Reporter F ₀ Fische sind 2,5 - 3 Monate alt, überqueren sie (siehe 2.5 für weitere Details) zu nicht-transgenen Fisch Wildtyp - Eier zum Erwerb eines F - ₁ Generation zu etablieren. Alternativ überqueren die UAS Reporter F ₀ Fisch zu einer Gal4 Fahrer eine F ₁ zu etablieren. Im letzteren Fall wird die UAS-driven Transgen direkt in den von dem Quer erhaltenen Embryonen überwacht werden kann.
8. Verwenden eines Fluoreszenz Präpariermikroskop F ₁ Embryonen für die Expression des Transgens oder auswählbare Kassette zu screenen.
   HINWEIS: Wenn die Expression bestätigt wird , dann kann das Transgen gesagt werden Keimbahn übertragen werden. Transgene nicht-Mendelschen an der F ₀ Bühne. Die Anzahl der Embryonen, die das Transgen exprimieren, aus einer kleinen Zahl an die überwiegende Mehrheit in den einzelnen clutche variieren kanns. Transposon Integration in verschiedenen F ₀ Fische können stark variieren, was zu unterschiedlichen Expressionsmuster. Daher F ₁ Fisch aus verschiedenen F ₀ Gründer als separate Unterlinien halten. Transposon - Integrationen in F ₁ Fische sind stabil und werden auf die nachfolgenden Generationen in einem Mendelschen Art und Weise weitergegeben.
9. Pflegen Sie jede F ₀ Fische in separaten Tanks Transgen Träger neu zu identifizieren.

4. Bereiten Sie Embryonen für Imaging auf einem aufrechten Mikroskop

HINWEIS: Die hier beschriebenen Verfahren wurden für die Bildgebung auf aufrechte Mikroskope mit langen Arbeitsabstand Wasser-Tauchen-Kegel Ziele optimiert.

1. Verwenden Sie ein Fluoreszenz Binokular Embryonen für die transgene Expression zu screenen.
   HINWEIS: Die Expression eines Reporter UAS Transgen hängt von der spezifischen verwendeten Gal4 Treiber abhängig Linie. Wählen Embryonen für die Bildgebung Experimente basieren auf Wunsch expression Muster.
2. Übertragen Sie die ausgewählten Embryonen eine Plastikpipette in eine separate Petrischale mit Danieau Puffer mit 1x PTU und 1x Tricaine enthält.
   HINWEIS: Bei der Kennzeichnung spärlich ist (nur wenige Zellen in einem Organsystem) montieren Sie die Embryonen in Agarose (siehe 4,3-4,7 unten) und Bildschirm für die Expression Transgen ein Weitfeldmikroskop mit stark vergrößernden Objektiven (siehe 5.1 unten) verwenden. Tricaine betäubt die Fische und sollten innerhalb von Sekunden wirksam sein. Wenn Fische nicht immobilisiert werden, ist es wahrscheinlich, dass die Tricaine verschlechtert hat. Mögliche Gründe für diese Verschlechterung sind schlechte Lagerung von Tricaine, die lichtempfindliche ^47.
3. in Danieau-Puffer auf eine Endkonzentration von 0,7% bereiten die Agarose den Fisch zum Einbetten von niedrigschmelzenden Agarose-Pulver aufzulösen. Aliquot (1 ml) und halten in einem Wärmeblock bei 40 ° C bis zur Verwendung.
   HINWEIS: Höhere KonzentratIonen von Agarose (bis 1,5%) können auch einzubetten Fisch verwendet werden.
4. In 50 ul eines 20x Lager von Tricaine und 20 ul einer 50x Stammlösung von PTU zum 1 ml aliquote Menge von niedrig schmelzenden Agarose und gut mischen, indem Sie die Seite des Rohres tippen. Bringen Sie das Rohr mit dem Wärmeblock. Mit Hilfe einer Plastiktransferpipette, Pipette vorsichtig ein paar (1-10) narkotisiert Embryonen in die Agarose, so wenig Flüssigkeit wie möglich zu übertragen zu vermeiden, die Agarose zu verwässern.
5. Verwendung einer Kunststoffpipettentransfer alle Embryonen mit einer kleinen Menge von Agarose zu einem Glasboden Petrischale.
6. Arbeitet relativ schnell, Verwenden einer Pinzette die Embryonen in der gewünschten Ausrichtung zu positionieren, in Abhängigkeit von der Struktur abgebildet werden.
   HINWEIS: Richten Sie Embryonen auf ihrer Seite , wenn die Netzhaut oder Rohon-Beard (RB) sensorischen Neuronen sollten abgebildet werden.
7. Lassen Sie die Agarose für mindestens 15 Minuten zu verfestigen. In Danieau Puffer 1xPTU und 1xTricaine enthält die Embryonen in agaro eingebettet zu deckense. Die Schale enthält Agarose eingebetteten Embryonen in einem Inkubator bei 28,5 ^o C bis bereit zu Bild.

5. Imaging zellulärer und subzellulärer Strukturen Weitfeld oder konfokale Mikroskopie mit

HINWEIS: Weitfeldmikroskopie und Punkt-Scanning - konfokale Mikroskopie sind die am häufigsten verwendeten Modalitäten Bild fluoreszenzmarkierten Genaktivität Tabelle 1 fasst die wichtigsten Vor- und Nachteile der beiden Systeme.. Für beide Formen der Mikroskopie, sind Embryonen in Agarose montiert , wie in 4 oben beschrieben, und bei 28,5 ^o C während des gesamten Abbildungsexperiment gehalten durch eine Heizkammer auf dem Tisch des Mikroskops verwendet wird . Wichtig ist, dass die Schale mit Agarose eingebetteten Embryonen erlaubt 28,5 ^o C äquilibrieren , bevor Abbildungs ​​beginnt, Temperaturschwankungen Drift in der z-Dimension führen. Bei der Durchführung von Langzeit Bildgebung Experimente (über several Stunden), legen Sie eine Plexiglasabdeckung über der Petrischale Verdampfen des Puffers zu reduzieren.

Tabelle 1. Allgemeine Vergleich von Breitfeld und Punkt-Scanning - konfokale Mikroskopie

1. Weitfeldmikroskopie
   HINWEIS: Hier Richtlinien zur Abbildung Genaktivität unter Verwendung eines aufrechten Weitfeldmikroskop mit Langarbeitsabstand Wassertauchkegel Ziele zur Verfügung gestellt. Das Mikroskop ist mit einer gekühlten CCD-Kamera ausgestattet und Filtersets für die Visualisierung verschiedener Fluorophore montiert auf einem automatisierten Filterrades für die schnelle Erfassung mehrerer Kanäle.Die Bildaufnahme wird durch μManager, einem Open - Source - Mikroskopie - Software - Paket ⁴⁸ gesteuert. Ein konkretes Beispiel für Mitochondrien in RB sensorischen Neuronen Bebilderung bereitgestellt. RB - Zellen sind genetisch mit Membran gezielt YFP markiert und ihre Mitochondrien sind GFP-markierten (siehe 1.1 oben).
   1. Mount Embryonen auf ihrer Seite in niedrig schmelzenden Agarose , wie in 4 oben beschrieben.
   2. Dann wird die Schale mit montiertem Fisch auf 28,5 ^o C in einer Heizkammer auf dem Tisch des Mikroskops äquilibrieren vor der Bilderzeugung begonnen wird .
   3. Verwenden Sie eine niedrige Vergrößerung Wasser-Tauchen-Kegel Ziel und schauen Sie durch die Okulare des Mikroskops einen Bereich auf der Oberfläche des Embryos Bild auszuwählen.
      HINWEIS: Wenn die stabile transgene MitoFish Reporter Linie, Tg (UAS-E1b: mYFP, mitoCFP) ^mde6, in Verbindung mit einer Treiberleitung verwendet wird, wie HuC: Gal4 dann die meisten RB Neuronen markiert und erscheinen als dichte mesh-Arbeit von Neuriten Dorne auf der Oberfläche des Embryos. Wenn die Mikroinjektion von DNA - Konstrukte verwendet wird spärliche Beschriftung zu erreichen (zB Sensory: Gal4-VP16 mit UAS: mitoCFP und UAS: MA-YFP), Bildschirm Embryonen doppelt markierten Zellen zu identifizieren.
   4. Öffnen Sie die Mikroskop-Software (μManager 1.4) und klicken Sie auf "Illumination '' unter" Konfigurationseinstellungen ", um die richtige Filtersätze für die Wellenlänge von Interesse (YFP oder GFP für das aktuelle Beispiel) definieren. Unter" Kameraeinstellungen "geben Sie die Belichtungszeit erforderlich, um ein geeignetes Bild zu erhalten.
      HINWEIS: Die "Illumination Settings" ist so voreingestellt , durch den Benutzer bei der Installation der Software und geladen wird , wenn μManager öffnen. Wenn die Software nicht konfiguriert ist, das Filterrad zu steuern, manuell das Filterrad in dem Turm in die entsprechende Position zu bewegen.
   5. Wechseln Sie zu einem langen Arbeitsabstand Wassertauchkegel Ziel im Bereich von 40-100x Vergrößerung. WählenDas Ziel, die den höchsten numerischen Apertur (NA) und wird chromatisch korrigiert (Achromat) aufweist.
   6. Klicken Sie auf "Live" das Sichtfeld zu wählen: Bei der RB Neuron, Bild mitochondrialen Transport am Stamm Axon, ausgehend von dem Zellkörper oder im peripheren Laube.
      HINWEIS: Die peripheren Dorne von RB Neuronen in der Schwanzflosse Falte des Embryos eine ideale Gelegenheit bieten ein großes Sichtfeld zu Bild , das flach ist und kann daher mit einem Weitfeldmikroskop auf einem einzigen Rahmen erfasst werden. Es ist daher wichtig, den Embryo möglichst flach auf der Seite zu montieren, so dass der Schwanzflosse Falte ist parallel zu dem Boden der Petrischale.
   7. Nach einem Sichtfeld der Wahl, klicken Sie auf den "rechteckige Auswahl" in der ImageJ Menü eine Region of Interest (ROI) und klicken Sie auf "ROI" im μManager Fenster definieren. Nach den ROI für die Bildgebung der Auswahl, klicken Sie auf "Stop" und "Speichern", um take ein Bild des YFP Kanal die lokale Morphologie der Neuriten / s aufzuzeichnen.
   8. Um das Bild klicken mitochondrialen Transport auf der "Multi-D Acq." Taste. Beachten Sie ein zusätzliches Fenster ( "Mehrdimensionale Acquisition") und wählen Sie die Anzahl der Zeitpunkte sowie das Intervall zwischen den Zeitpunkten in diesem Fenster. Verwenden Sie eine Bildrate von 0,3-1 Hz. Führen Sie die Aufnahmen für mindestens 10 Minuten, so viele Daten-Punkte wie möglich zu sammeln.
   9. In der "Mehrdimensionale Acquisition" Fenster, klicken Sie auf "Kanäle", hinzufügen und die Wellenlänge für die Bildgebung (GFP für Mitochondrien in diesem Beispiel) und die Dauer der Exposition definieren. Halten Sie Belichtungszeiten unter 400 ms für mitochondriale Transport Bildgebung.
   10. Klicken Sie auf die Option "Speichern von Bildern" in der "Mehrdimensionale Acquisition" Fenster, um automatisch die Dateien in einem bestimmten Ordner speichern im "Directory-Root 'skizziert. Klicken Sie auf "Acquire" in der rechten oberen Ecke tim zu startene-Lapse-Imaging.
   11. nachstellen manuell den Fokus während der Zeitrafferaufnahme für jede Drift in der z-Dimension zu kompensieren.
       HINWEIS: diese Parameter mitochondrialen Transport in RB Neuronen verwenden, können so lange wie 4 Stunden abgebildet werden.
2. Konfokalmikroskopie
   HINWEIS: Hier Richtlinien für die Bildgebung mit einem aufrechten Olympus FV1000 konfokalen Mikroskop und Langarbeitsabstand Wassertauchkegel Ziele zur Verfügung gestellt. Das Mikroskop ist mit mehreren Laserlinien und mehrere Detektoren (konventionelle PMTs und empfindlicher Galliumarsenid-Phosphid-Detektoren) ausgestattet, die für Mehrkanalaufnahmen ermöglichen. Spezifische wird auf Olympus FluoView Software. die Abbildungsparameter hier beschrieben werden, sollten andere konfokale Systeme übertragbar jedoch leicht.
   1. Mount Embryonen in niedrigschmelzenden Agarose in einer Orientierung geeignet für die Organ- / Struktur abgebildet werden, wie in 4 oben beschrieben.
   2. Die Schale wird mit montierter Fisch auf 28,5 ^° C in einer Wärmekammer auf der Bühne des Mikroskops äquilibrieren vor der Belichtung beginnt.
   3. Verwenden Sie lange Arbeitsabstand Wasser-Tauchen-Kegel Ziele für die konfokale Mikroskope in einer aufrechten Konfiguration. Wählen Ziele mit möglichst hoher NA die Menge an Fluoreszenzsignalen zu maximieren, die gesammelt werden können, und haben die beste Auflösungsvermögen. Bei der Erfassung der Bilder mehrerer Kanäle wählen chromatisch korrigierten Ziele (Apochromat).
   4. Öffnen Sie die Mikroskop-Software und klicken Sie auf "Trans-Lampe" oder "Epi Lampe" entweder übertragen oder Fluoreszenzlicht zu verwenden, die jeweils die Region von Interesse über die Okulare des Mikroskops zu identifizieren.
   5. Verwenden Sie die Software die folgenden Scan-Parameter einzurichten, um Bildstapel zu erwerben:
      1. In der "Acquisition Setting" Fenster überprüfen, ob das Ziel für die Bildgebung gewählt, um das Ziel übereinstimmt, die auf dem Dropdown-dow erscheintn-Menü der verfügbaren Ziele.
         Hinweis: Dies ist , um sicherzustellen , dass alle vorher berechneten Parameter für ein bestimmtes Ziel (beispielsweise laterale und axiale Auflösung, die Größe der konfokalen Öffnung etc.) halten wahr und zuverlässig eingesetzt werden kann.
      2. Wählen Sie die entsprechenden Laserlinie / s und Anregungs- und Emissions dichroitische Filter zur Bild spezifische fluoreszierende Protein (s). Tun Sie dies, indem Sie auf die "Dye-Liste" in der "Image Acquisition Control" Fenster klicken und wählen Sie den entsprechenden Fluorophors / s. Alternativ klicken Sie auf den "Lichtpfad und Farbstoffe" Taste manuell diese Parameter einzustellen.
         HINWEIS: Wenn das "Dye List" Tastenoption gewählt wird, wählt die Software automatisch die entsprechenden Laserlinien, Anregungs- und Emissions dichroitischen Filter und passt die Größe der konfokalen Öffnung geeignet.
      3. In der "Acquisition Setting" Fenster, stellen Sie den "Zoom" Faktor und "Größe aspect Verhältnis "(dh, 512x512, 1024x1024 etc.) des gescannten Bildes notwendig , um die Pixelgröße zu erhalten , lösen , um am besten die Strukturen abgebildet werden. Stellen Sie die Pixelgröße etwa die Hälfte der theoretischen Auflösung des Objektivs zu sein, wodurch die Stichprobenkriterien folgende Nyquist . Um die Pixelgröße des erfassten Bildes klicken Sie auf die Schaltfläche mit dem Symbol für Informationen ( "i") in der "image Acquisition Control" Fenster bestimmen.
      4. Stellen Sie die Scan-Geschwindigkeit auf die schnellstmögliche (2 & mgr; s / Pixel) im "Acquisition Setting" Fenster.
      5. In der "Image Acquisition Control" Fenster klicken Sie auf Lungs Kalman Linie noise.A Faktor von 2 bis 3 reicht in der Regel zu reduzieren.
      6. Wählen Sie einen sequentiellen Scan-Modus, wenn Fluorophore Bildgebung mit Spektren überlappen. Um dies zu tun, klicken Sie auf "Sequential" und "Line" in der "Image Acquisition Control" Fenster.
      7. Passen Sie die Leistung der jeweiligen Laserlinie / s (typischerweiseunter 5%). Die spezifischen Werte müssen empirisch bestimmt werden.
      8. Klicken Sie auf "XY Repeat" oder die "Focus x2" oder "Focus x4" Taste kontinuierlich den ausgewählten Bereich zu scannen, während die Detektoreinstellungen für jeden Kanal eingestellt werden. Stellen Sie "HV", "Gain" und "Offset" für jeden Kanal Bilder zu erwerben, die den größten Dynamikbereich von Grauwerten haben.
         HINWEIS: Die spezifischen Werte für diese Einstellungen empirisch bestimmt werden müssen. "HV" stellt die Spannung am Detektor seine Empfindlichkeit zu verändern, "Offset" stellt das Ausgangssignal des Detektors und "Gain" multipliziert das Ausgangssignal des Detektors mit einem konstanten Faktor.
      9. Drücken Sie Strg + H, um die aufgenommenen Bilder über eine Look-Up-Tabelle (HiLo) sichtbar zu machen, die unter tigten identifiziert (blau erscheinen) und über-gesättigten Pixel (erscheinen rot), welche beide sollten generell vermieden werden. Neubewertung der Ausgangsleistung des jeweiligen Laser line / s und die Detektoreinstellungen.
         HINWEIS: Die Verwendung hoher Laserleistung und ein hohes Maß an der "HV" des Detektors wird zu mehr Signal führen. Höhere Laserleistung wird jedoch zu einem erhöhten Bleichen und Phototoxizität führen. Eine Erhöhung der "HV" führt zu einer erhöhten Lärm führen. Daher ist ein Kompromiss gefunden werden muss , wenn Laserleistungseinstellung und "HV" , um Bilder mit akzeptablen Mengen an Rauschen erwerben , während Foto-Schäden zu verhindern (siehe auch Tabelle 1).
      10. Sammeln von Bildern von einem definierten Volumen durch die Konzentration auf die oberen und unteren Grenzen des Bereichs von Interesse. In der "Acquisition Setting" Fenster klicken Sie auf den "End-Set" und "Start Set" Set Tasten der z-Stack-Fenster an den oberen und unteren Grenzen des Volumens abgebildet werden. Wählen Sie eine Schrittweite , die die Hälfte der z-Auflösung für das gegebene Ziel (z. B. wenn z Auflösung von 2 & mgr; m wählen 1 & mgr; m). Um die z-Auflösung des objektiv bestimmen,e Klicken Sie auf die Schaltfläche mit dem Symbol für Informationen ( "i") in der "Image Acquisition Control" Fenster.
      11. Legen Sie eine Zeitreihe bis z-Stacks mit einer zeitlichen Frequenz sammeln, die für die Dynamik der subzellulären Struktur abzubildenden geeignet ist. In der "Timescan" Unterfenster geben Sie die Frequenz, bei der z-Stapeln sollte ( "Intervall" ') und die Anzahl der Male die Bilder erworben werden sollen ( "Num") erworben werden.
      12. Klicken Sie auf die "Tiefe" und "Time" Schaltflächen in der "Image Acquisition Control" Fenster, um zu bestätigen, dass ein Z-Stapel und Zeitreihen wird erworben werden. Klicken Sie abschließend auf "XYZT", um zu beginnen Zeitrafferbilder zu erwerben.
      13. Nach Abschluss der Bildaufnahme, beobachten "Series Done" auf der Software-Schnittstelle. Klicken Sie darauf, und speichern Sie die Bilder in "OIB" Format, um die Bilder und Metadaten, die mit ihnen verbunden sind aufzuzeichnen.
          HINWEIS: Bilder auf die erhaltenemit einer Software wie FIJI, einem freien öffentlichen Bereich Bildverarbeitungsprogramm Weitfeldmikroskop und konfokalen Mikroskop visualisiert und analysiert werden.

Hier wird die Verwendung von Weitfeld und konfokale Mikroskopie Bild Mitochondrien und Zentrosomen in Genaktivität leben direkt verglichen und gegenübergestellt. Je nach Lage der Zellen in dem Organell Dynamik untersucht und die Eigenfrequenz der spezifischen subzellulären Ereignisse zu werden, im allgemeinen entweder Weitfeld oder konfokalen Mikroskopie ist die bessere Wahl. Wir abzubildenden Organellen in RB Neuronen auf der Oberfläche des Embryos und in Netzhautzellen befindet tiefer. Die oberflächliche Lage des RB - Neuronen zusammen mit ihren zweidimensionalen Geometrie machen sie zu guten Kandidaten für sowohl Weitfeld und konfokale Mikroskopie (Abbildung 2) abgebildet wird. Importieren von Bildern der konfokalen Mikroskopie ist jedoch deutlich langsamer und zu einer Unterschätzung der Dynamik von spezifischen subzellulären Ereignissen führen können (zB Bewegung der Mitochondrien, 2C, D ). Bilder von retinalen durch Weitfeldmikroskopie erfasst Zellen leiden unter schlechten Kontrast als Fluoreszenzsignale aus einem großen Volumen von Gewebe Detail in der Brennebene verdeckt. Hier wird die optische Sektionierung Fähigkeit der konfokalen Mikroskopie Ergebnisse in deutlich verbesserten Kontrast (Abbildung 3).

Zu ermöglichen gleichzeitige Visualisierung von Organellen und Zellmembranen verwendeten wir das Gal4-UAS-System in drei verschiedenen Konfigurationen. Zunächst wird die UAS MitoFish Reporter Linie Tg (UAS-E1b: mYFP, mitoCFP) wurde ^mde6 verwendet. Hier ermöglicht eine bidirektionale UAS gleichzeitige Expression von mitochondrial gezielte GFP und Membran gezielt YFP. In Kombination mit geeigneten Gal4 Treiberleitungen, bezeichnen MitoFish den Mitochondrien und Zellmembranen von RB sensorischen Neuronen (2A-C) oder Netzhautzellen (3A, B) mit CFP und YFP r espectively. Zweitens zwei UAS - Konstrukte (UAS: mitoCFP und UAS: MA-YFP) wurden mit einem Gal4 Treiber Konstrukt kombiniert (Sensory: Gal4-VP16, sensorischen Neuronen-spezifischen Enhancer - Elemente aus der kleinen Insel-1 - Gen) ⁷ in transienten Injektionen. Das Mosaik Ausdruck, der im Allgemeinen aus diesen Injektionen ergibt erlaubt die Verfolgung einzelner Zellen über Tage (Abbildung 2E). Ein dritter Ansatz verwendet, um die Verwendung von zwei UAS-Kassetten, die jeweils die Expression einer anderen Fusionsproteins auf einem einzigen zusammenhängenden Konstrukts antreibt. Diese Strategie wurde verwendet , CentrinFish Tg (UAS: cetn4-YFP, UAS: MA-Cerulean) zu erzeugen ^tum1, in dem ein centrin4-YFP Fusions Etiketten Zentrosomen und Cerulean richtet sich an Zellmembranen. In Kombination mit speziellen Linien Gal4 Treiber die Zentrosomen und Zellmembranen von Retinazellen (3C, D) oder Muskelfasern (Abbildung 4) sind markiert.

Figur 3: Vergleich der Weitfeld und konfokale Mikroskopie zu Bildorganellen in vivo in der embryonalen Zebrabärbling Retina.
OTX2 Promotorelemente treiben die Expression von GFP in den Mitochondrien und YFP in Zellmembranen (A und B) oder YFP in Zentrosomen und Cerulean in Zellmembranen (C und D) in der Netzhaut von 2 dpf Genaktivität. Um dieses Markierungsmuster zu erreichen, Otx2: Es wurden Gal4 transgene Fische entweder gekreuzt MitoFish (A und B) or CentrinFish (C und D). Verwendung von Weitfeld (A, C) und konfokaler (B, D) Mikroskopie A 40x Wassertauchkonus apochromatischen Objektiv (NA 0,80) wurde verwendet , um Bilder von der gleichen Region in jeder Netzhaut zu erfassen. Einfügungen in A und B zeigen Detail einer Region der inneren Kernschicht, einfügungen in C und D zeigen eine Zelle in M-Phase. Maßstabsbalken 20 um. Mitochondrial gezielte GFP (mitoCFP), Membran gezielte YFP (MA-YFP), centrin4-YFP (cetn4-YFP), Membran gezielte Cerulean (MA-Cerulean). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4: Vergleich der Weitfeld und konfokaler Microscopy zu Bild Zentrosomen in vivo.
Eine einzelne Muskelfaser mit fluoreszierend markierten Zellmembranen und Zentrosomen (Otx2: Gal4; CentrinFish) wurde unter Verwendung von Breitfeld abgebildet (A) und konfokale (B) Mikroskopie. In beiden Fällen wird ein 40x Wasser-Tauchen-Kegel Apochromat Objektiv (NA 0,80) verwendet. Maßstabsbalken 10 um. Centrin4-YFP (cetn4-YFP), Membran gezielte Cerulean (MA-Cerulean) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Hier zeigen wir die Vielseitigkeit des Gal4-UAS - Expressionssystem zur fluoreszenz tag Mitochondrien Zentrosomen und die Zellmembranen von spezifischen Zelltypen in vivo in Zebrabärbling - Embryonen. Viele fluoreszierende Fusionsproteine ​​, die andere Organellen oder subzellulärer Strukturen beschriften kann in der veröffentlichten Literatur zu finden und kann von dem jeweiligen Labor, kommerziellen Quellen oder nichtkommerziellen Plasmid Hinterlegungsstellen (zB Addgene) erhalten werden. Zu entwerfen, müssen ein neues fluoreszierendes Fusionsprotein, mehrere Parameter berücksichtigt werden, darunter die FP zu verwenden, und ob die FP am Amino- oder Carboxy-Terminus des Proteins von Interesse zu fusionieren. Für eine gründlichere Diskussion über fluoreszierende Fusionsproteine ​​zu erzeugen, werden die Leser zu ausführlichen Artikel über das Thema ^49-51 bezeichnet.

Wir heben drei Strategien zur Erreichung Co-Expression von Fusionsproteinen UAS-driven Transgene verwenden. Mehrere, separate UAS Reporterkonstrukte erlauben verschiedene bestehende Reporter für die Kombination von Konstrukten ohne die Notwendigkeit von zusätzlichen Klonen. Reporter-Expressionsniveaus kann auch unabhängig titriert werden. Allerdings höhere Co-Expression erreicht werden, wenn entweder mehrere UAS Kassetten oder eine bidirektionale UAS-Kassette auf einem einzigen Konstrukt verwendet werden. Da FPs als Tags verwendet werden, ist es relativ einfach, die Co-Expression zu verifizieren. Es sollte beachtet werden , dass andere Verfahren für Multi-cistronische Expression auch existieren, einschließlich der Verwendung von internal ribosomal entry Seiten ⁴⁰ und viralen 2A Peptide ^52,53. Als Alternative zu DNA basierten Konstrukten in vitro transkribiert verkappte mRNA verwendet werden können , fluoreszierende Fusionsproteine ​​zu exprimieren subzellulären Strukturen ^1,4,8 zu etikettieren. Der Nachteil dieses Ansatzes ist jedoch, dass die Expression in den ersten Tagen der Entwicklung begrenzt ist, und wird die Zelle oder das Gewebe nicht spezifisch. Unabhängig von der gewählten Methode Fusionsproteine ​​zu exprimieren, ist es entscheidendum sicherzustellen, dass die Expressionsniveaus den physiologischen Zustand der Zellen führen nicht zu einer nicht-spezifischen Kennzeichnung und Kompromisse. In dieser Hinsicht kann die Verstärkung der Expression des Reportergens inhärent in dem Gal4-UAS System ²⁷ problematisch sein, beispielsweise als cytosolische Kennzeichnung manifestieren , auch wenn der FP zu einer bestimmten Organelle ausgerichtet ist. Wenn vorhanden, sollten Antikörper verwendet werden, um zu überprüfen, ob die Expression erhaltenen Muster von Fusionsproteinen, die endogene Situation widerspiegeln. In einigen Fällen kann die Injektion von niedrig (er) DNA-Konzentrationen konnte das Problem der Fehllokalisierung des Fusionsproteins zu mildern. Alternativ Vektoren mit einer geringen Anzahl von UAS Wiederholungen könnte helfen , die Konzentration Transgen - Expression ³⁰ bis titrieren nach unten. Ähnlich wird für den Aktivator Gal4-VP16, modifizierte Versionen existieren, das die Expression berichtet vergleichsweise schwach zu treiben und sind daher weniger toxisch ^30,33. Wenn mis-Lokalisierung des Fusionsproteins besteht trotz Bemühungen dow titrierenn Transgen-Expressionsniveaus, kann es notwendig sein, die Gal4-UAS-System zu verzichten und Antriebs Expression durch Promotorelemente direkt.

Die stabilen transgenen Linien, MitoFish ¹⁰ und CentrinFish ^12, beschreiben wir in diesem Manuskript wurden mit 14xUAS Kassetten gemacht. Wir halten diese Zeilen im Hintergrund von Gal4 Treiberleitungen Veränderungen über Generationen hinweg in Ausdruck zu erfassen, da Reporter Linien mit mehreren UAS wiederholt berichtet , wurden zum Schweigen zu bringen ⁵⁴ anfällig zu sein. Wir haben keine Beweise für die drei Generationen zum Schweigen zu bringen über gesehen wir die CentrinFish ausgebreitet haben. Wir haben jedoch bunten Ausdruck in MitoFish und deshalb stringent wählen Embryonen mit 'voll', starke Ausdrucksebenen für zukünftige Generationen zu verbreiten gesehen. Die aktuelle Literatur legt nahe, dass Expressionsvektoren mit 5xUAS Wiederholungen könnte eine Alternative zur Erzeugung von stabilen transgenen Linien sein - der Reporterangetrieben hoch genug Ebenen ³⁰ und die vergleichsweise geringe Anzahl von UAS wiederholt kann es weniger machen anfällig für Transgen - Silencing, obwohl sich nicht wiederholende UAS Wiederholungen weniger angeblich sogar über ⁵⁴ anfällig.

Die Palette der FPs derzeit verfügbaren Tag Organellen oder anderen subzellulärer Strukturen ist sehr breit ^55. Wenn eine bestimmte FP als Tag der Auswahl Überlegung sollte auf die folgenden Parameter angegeben werden: Erstens, um die Anregungs- und Emissionsspektren des FP bestimmen für seine Visualisierung erforderlich, um die spezifische Laserlinie sowie die Anregungs- und Emissionsfiltern. Zweitens, die Helligkeit und Photostabilität des FP. Dritte, mit dem die Geschwindigkeit reift der FP folgende Übersetzung. Viertens, ob die FP hat eine Tendenz, in Fusionen zu aggregieren. In Bezug auf den letzten Parameter sollte darauf Experimente ausgeübt und Kontrolle sollte die Eignung jedes FP für bestimmte Experimente zu testen, durchgeführt werden. Zum Beispiel, während die Wiederd FPs mCherry und DsRed sind weit verbreitet, sie ⁵⁶ Berichten zufolge Aggregate in bestimmten Fusionen bilden. Wir haben TagRFP-T ^57, eine photostabile Variante TagRFP, fand eine gute Leistung , wenn an die Mitochondrien zielgerichtet und an Zellmembranen (nicht veröffentlichte Beobachtungen). Wenn mehrere Organellen müssen gleichzeitig visualisiert werden, FPs mit nicht-überlappenden Spektren verwendet werden soll. Wir haben erfolgreich Kombinationen von Cyan FPs (GFP und Cerulean) und YFP (Abbildungen 2-4) verwendet. Durch die Ausnutzung der gesamten Spektralbereich von blau bis zum nahen Infrarot, kann man deutlich die Anzahl der subzellulärer Strukturen erweitern , die gleichzeitig ² sichtbar gemacht werden kann. Zusätzlich zu dem herkömmlichen FPs, photoaktivierbare FPs sind besonders nützlich Organell Dynamik Sonde, beispielsweise die Verwendung des FP Kaede ⁵⁸ das Schicksal einzelner Mitochondrien zu verfolgen.

Welche Mikroskopietechnik - Weitfeld oder konfokalen - ist diegeeignet für Abbildungs ​​hängt von einer Reihe von Faktoren ab, die Lage der Zellen, einschließlich mit dem spezifischen subzellulären oder zelluläre Ereignisse zu erwarten abgebildet werden und die Geschwindigkeit werden. Weitfeldmikroskopie ist die bevorzugte Modalität in den oberflächlichen Lagen und spärlich markierten Proben. Es bietet eine Foto-Toxizität und Bildgebung mit hoher Geschwindigkeit zu einem vernünftigen Preis. Wenn jedoch Bildgebung in nicht-oberflächliche Teile der Zebrabärbling durchgeführt werden muss, in dicht markierten Proben oder dreidimensionale Information, konfokale oder eine andere Form des optischen Schneidens Mikroskopie zu gewinnen wird die Methode der Wahl.

Unabhängig davon, welche zellulären oder subzellulären Struktur überwacht wird, gibt es oft ein Kompromiss zwischen das bestmögliche Bild zu erwerben und die Probe am Leben und in einem guten physiologischen Zustand für wiederholte Zeitraffer-Bildgebung zu halten. Photo-Toxizität können als Veränderungen manifestieren im Verhalten von Organellen, aberrant Morphologie von Zellen oder sogar ZellTod. Schlüssel zur Verringerung Photobleaching und Phototoxizität für beide Breitfeld und der konfokalen Mikroskopie ist es, die höchstmögliche, Licht, um Bilder zu erwerben. In dieser Hinsicht Ziele mit möglichst hoher NA sind Schlüssel die Menge des Fluoreszenzsignals zu maximieren, die gesammelt werden können. Für die konfokale Mikroskopie kann eine Anzahl von Parametern für die Verwendung niedrigerer Laserleistung zu kompensieren, werden eingestellt. Detektoren mit höherer Quantenwirkungsgrad zu herkömmlichen PMTs verglichen, beispielsweise Galliumarsenid - Phosphid - Detektoren kann diese emittierten Photonen sind eher erkannt werden , um sicherzustellen , verwendet werden. Alternativ oder zusätzlich höher Dynode Spannungen können in der PMT angewendet werden, um die Empfindlichkeit der Detektoren erhöhen. Die konfokale Blende (Pinhole) kann geöffnet werden, für die Sammlung von mehr Fluoreszenzsignal zu ermöglichen, wenn auch mit einem Verlust von axialen Auflösung. Um die Proben so wenig Licht wie möglich aussetzen, Scannen sollte, dass die Verweilzeit bei hohen Geschwindigkeiten so getan werden,der Laser pro Pixel ist gering. Scanning bei niedrigeren räumlichen Auflösung hat auch den Effekt, daß die Geschwindigkeit der Abtastung erhöht wird. Imaging weniger häufig hat den zusätzlichen Vorteil, dass die Probe auf weniger Licht ausgesetzt wird, sollte jedoch nur berücksichtigt werden, wenn sie nicht die umfassende Beprobung der untersuchten Prozesse nicht beeinträchtigt.

Als Alternative Drehscheiben-konfokale Mikroskope und konfokale Mikroskope, die mit einem so genannten "Resonanz 'Scanner ausgestattet sind, bieten die Möglichkeit für schnelles Scannen. Beide Modalitäten haben den Vorteil, dass sie schneller und weniger phototoxische als "klassische", Punkt-Scanning-konfokalen Mikroskopen. Allerdings sind sich drehende Scheibe konfokalen Mikroskopen begrenzteren in z-Auflösung und kann nicht so tief in das Gewebe als Punkt-Scanning-konfokale Mikroskope eindringen. In ähnlicher Weise kann die Anwendung von Resonanzscanner konfokale Mikroskope wie die sehr kurze Pixelverweilzeit begrenzt wird zu einer schlechteren Bildqualität führen, die konnte,wiederum schließt die Detektion von subzellulären Ereignisse (zB binäre Bilder mit reduziertem Signal-to-noise).

Schließlich, während Weitfeld und konfokaler Bildgebung hier hervorgehoben werden, andere Formen der Lichtmikroskopie wie Zwei-Photonen - ⁵⁹ und Lichtmikroskopie Blatt ⁶⁰ könnte besser geeignet für bestimmte Fragen sein. Zwei-Photonen-Mikroskopie wird durch die gleichzeitige Absorption von zwei Photonen im infraroten Bereich des Lichtspektrums auf der Anregung eines Fluorophors basiert. Gemeinsam mit der konfokalen Mikroskopie, verwendet es Punkt Scannen von Bildern von der Probe zu erfassen und hat optische Sektionierung Fähigkeiten aufgrund der Nichtlinearität der Zweiphotonenanregung. Die Verwendung von Licht langer Wellenlänge zur Anregung Fluorophor ermöglicht Abbildungstiefen mehreren hundert Mikrometern von der Oberfläche. Des Weiteren die Beschränkung der Anregung zu einem kleinen Abbildungsvolumen verhindert, Photobleaching und Phototoxizität außerhalb der Brennebene. Allerdings sind nicht alle FPs haben eine hohe Multiphotonenabsorption Querschnitte, ein Problem, das besonders weit verbreitet in roten FPs ist. Darüber hinaus, um eine einzelne Infrarot-Wellenlängen finden gleichzeitig mehrere unterschiedliche FPs erregt ist schwierig, Multi-Channel-Bildgebung umständlich macht. Lichtbogen-Mikroskopie verwendet eine dünne "Blatt" (typischerweise Dicke im Bereich von 2 bis 10 & mgr; m) von Laserlicht, um die Probe anzuregen und detektiert Fluoreszenzsignale von dieser beleuchteten Brennebene in einem rechten Winkel eine empfindliche Kamera. Optische Schnitte wird durch die Beleuchtung einer einzigen Ebene zu einer Zeit erreicht. Diese Beschränkung des Anregungslichts verringert das Auftreten von Phototoxizität. Da Fluoreszenzsignale aus der gesamten beleuchteten Ebene gleichzeitig gesammelt werden, ist die Bildaufnahme deutlich schneller als Punktabtastung konfokale und Multiphotonen-Mikroskope. All diese Eigenschaften machen Lichtbogen-Mikroskopie besonders geeignet dynamische zelluläre Ereignisse zu Tomographie mit hoher Raum-Zeit-Auflösung ingroße Mengen von lebenden Proben. Tatsächlich wurde mit Hilfe von Licht-Blatt - Mikroskopie Zellschicksal im gesamten Zebrafischembryo umfassend während der ersten 24 Stunden der Entwicklung ⁶¹ verfolgt. Bei fortgesetzter Verbesserung bessere Abbildungspenetrations ^62,63 und räumlicher Auflösung ⁶⁴ ist es denkbar , dass Lichtbogendynamik Mikroskopie verwendet wird , um die Sonde nicht nur auf zellulärer als auch auf subzellulärer Ebene in ganz Zebrafischembryonen.

The authors have nothing to disclose.

P.E. is supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Training Group 1373 and the Graduate School of the Technische Universität München (TUM-GS). G.P. was supported by TUM-GS. L.T. is supported by an EMBO fellowship (EMBO ALTF 108-2013). D.P.'s work on zebrafish was supported by the DFG through the Sonderforschungsbereich "Molecular Mechanisms of Neurodegeneration" (SFB 596); the Center for Integrated Protein Sciences (Munich) and the European Community's Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) under Grant agreement no. 200611 (MEMOSAD). He is currently a New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow and was supported by a fellowship from the German Academy of Sciences Leopoldina. L.G. is supported by funding from the DFG through SFB 870 "Assembly and Function of Neuronal Circuits", Project A11.

We are grateful to Kristina Wullimann for maintaining our fish facility, Yvonne Hufnagel for technical support and Thomas Misgeld for comments on the manuscript. We are grateful to R. Köster (Technische Universität Braunschweig) for providing the M1 Medusa vector (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP) from which we cloned out Centrin-YFP and S.C. Suzuki and T. Yoshimatsu (University of Washington) for providing the 14xUAS:MA-cerulean cassette which we used to generate the reporter construct to make CentrinFish. We further thank S.C. Suzuki and T. Yoshimatsu (University of Washington) for the Otx2:Gal4 transgenic line, A. Sagasti for the Sensory:Gal4-VP16 construct (UCLA) and M. Nonet (Washington University in St. Louis) for the pCold Heart Tol2 vector. We acknowledge Bettina Schmid, Alexander Hruscha and Christian Haass (German Center for Neurodegenerative Diseases Munich - DZNE) for contributing to the development of MitoFish.