La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

En imágenes in vivo proporciona una visualización directa de los comportamientos celulares en el contexto más fisiológica. La transparencia de los embriones de pez cebra, su rápido desarrollo y externa y una rica variedad de herramientas genéticas que permiten el marcaje fluorescente, han contribuido a la creciente utilización de la microscopía in vivo para dilucidar la dinámica de eventos de desarrollo claves. Los estudios de imágenes del desarrollo del sistema nervioso en el pez cebra tienen, por ejemplo, se expandió enormemente nuestro conocimiento del comportamiento de las células progenitoras neurales y el destino de su progenie, incluyendo su posterior migración, la diferenciación y la integración del circuito ^1-8.

El escenario está listo para investigar la dinámica subcelulares que subyacen a estos comportamientos celulares. De hecho, el pez cebra ya están siendo explotados como herramientas para la biología de las células en vivo. Ahora es posible visualizar las mitocondrias ^9-11, centrosomas ^{2,8,12-14, 15} de Golgi, Los microtúbulos y la actina ^{4 16} citoesqueleto, endosomes ¹⁷ y los componentes de la membrana apical complejo ^1,18, entre otras estructuras subcelulares en embriones de pez cebra en vivo. Hasta ahora, gran parte de lo que se conoce acerca de la función de estos orgánulos proviene de estudiar su comportamiento en células cultivadas. Mientras que los estudios in vitro han dado mucha información sobre los biología celular, las células en cultivo no representan plenamente la complejidad de la situación in vivo y por lo tanto no reflejan necesariamente la función y dinámica de los orgánulos subcelulares in vivo. Embriones de pez cebra ofrecen una alternativa viable en vivo para examinar la dinámica subcelulares.

Como los vertebrados, el pez cebra posee muchos sistemas de órganos (por ejemplo, la retina neural) que son homólogas a las que se encuentran en especies de mamíferos. Además, embriones de pez cebra son cada vez más utilizados para modelar enfermedades humanas ^19,20 , incluidos los relacionados con la función centrosómicas (por ejemplo, microcefalia ²¹ y amaurosis ²² congénita de Leber) y para la función mitocondrial (por ejemplo, enfermedad de Parkinson ^23, tauopatías ^10,24 y el síndrome de Barth ^25). imágenes in vivo a nivel celular y subcelular en estos casos permitirá una mejor comprensión de la biología de las células que subyace a estos estados patológicos.

El objetivo general de los métodos descritos aquí es proporcionar una guía completa para investigar orgánulos y otras estructuras subcelulares en embriones de pez cebra utilizando microscopía de luz en vivo. Todo el flujo de trabajo involucrado en la visualización y el seguimiento de las estructuras subcelulares en vivo se describe - a partir de enfoques genéticos de etiquetado, para generar transitoriamente expresar y peces transgénicos estable, y finalmente a la formación de imágenes usando de campo amplio y microscopía confocal. Aunque cada uno de estos procedures es utilizada por numerosos laboratorios de pez cebra, los protocolos descritos se han optimizado y simplificado para la investigación de la dinámica de las estructuras subcelulares. Dos aspectos específicos del trabajo aquí descrito garantizan mención: En primer lugar, el uso del sistema de expresión Gal4-UAS en múltiples configuraciones para genéticamente orgánulos de la etiqueta en tipos celulares específicos. En segundo lugar, una comparación directa de campo amplio y microscopía confocal a las estructuras subcelulares de imagen in vivo.

Las estrategias actuales para modificar genéticamente los orgánulos de la etiqueta y otras estructuras subcelulares en el pez cebra o bien hacer uso de cubiertas de ARNm ^1,4,8 o construcciones de ADN basada en elementos promotores conducen directamente la expresión de proteínas de fusión ^9,14,15. Transcrito in vitro de ARN en cubiertas resultados rápida y amplia expresión, que no es específica de tejido sin embargo. Además, los niveles de expresión disminuyen con el tiempo que el ARN tapado se diluye o se degrada. Así, el uso de ARN basadoconstruye para examinar la dinámica de orgánulos en las etapas posteriores de desarrollo es limitado (generalmente hasta 3 días después de la fertilización).

Estas limitaciones se pueden superar mediante el uso de construcciones de ADN, donde el control espacial y temporal de la expresión se determina por elementos promotores específicos. Cuando construcciones basadas ADN se utilizan en el contexto del sistema de Gal4-UAS mejoras significativas en los niveles de expresión del transgen se observan ^26,27. En este sistema de expresión bipartito, de tipo celular elementos promotores específicos conducir la expresión de un activador transcripcional Gal4, mientras que los genes informadores son clonados aguas abajo de la secuencia de activación aguas arriba Gal4 vinculante (UAS). Mediante la combinación de UAS reporteros con conductores Gal4 apropiadas, la expresión puede limitarse a tipos de células específicos, eludiendo la necesidad de clonar genes informadores detrás de diferentes promotores cada vez que se desea un patrón de expresión específico. Además, la expresión de múltiples genes indicadores UAS puede serimpulsado por un solo activador Gal4. Así, el sistema Gal4-UAS ofrece un enfoque genético versátil y flexible para el etiquetado subcelular.

De gran campo y microscopios confocal son los caballos de batalla de la mayoría de los laboratorios. sistemas de campo amplia suelen utilizar una lámpara de arco como fuente de luz y detectar la luz emitida con una cámara sensible que se coloca al final de la trayectoria de la luz. Esta modalidad de imagen está normalmente restringido a muestras delgadas como fuera de foco luz oscurece la información de enfoque en las muestras más gruesas. Microscopios confocales difieren de los sistemas de campo amplio en el que se construyen para favorecer las señales que se originan en el plano focal sobre los que se originan fuera de foco (es decir, "seccionamiento óptico") ^28. Para lograr seccionamiento óptico de un agujero de alfiler se coloca en la trayectoria de emisión en una posición conjugada a la fuente de luz puntual. Los láseres son utilizados como fuentes de luz y las señales se detectan con tubos fotomultiplicadores (PMT). Prácticamente, un láserhaz se desliza sobre la muestra de punto por punto y la emisión de fluorescencia en cada punto (pixel) es detectada por el PMT.

Aquí la imagen de las mismas estructuras subcelulares en embriones de pez cebra de estar utilizando tanto de gran campo y la microscopía confocal para proporcionar una comparación directa de ambas modalidades de microscopía. El objetivo subyacente de proporcionar este tipo de comparaciones es ofrecer directrices para la elección de la técnica de microscopía más apropiada para la cuestión específica que nos ocupa.

El uso de los enfoques descritos aquí demostramos Gal4-UAS etiquetado con base genética de las mitocondrias y los centrosomas. Estos orgánulos son imágenes en diferentes tipos de células del sistema nervioso y en las células musculares usando de campo amplio y microscopía confocal para demostrar la idoneidad de cada modalidad de imagen. Los métodos descritos aquí se pueden adaptar fácilmente para la investigación de otros orgánulos y estructuras subcelulares en el embrión de pez cebra vivo.

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las regulaciones locales del gobierno de la Alta Baviera (Munich, Alemania).

1. Etiquetado de orgánulos subcelulares y Otras Estructuras

NOTA: Aquí reportero construye genética que se describen membranas centrosomas etiqueta fluorescente, las mitocondrias y los teléfonos.

1. Utilizar métodos de clonación convencionales ²⁹ para generar proteínas de fusión que etiquetan con fluorescencia centrosomas y mitocondrias. Clonar la secuencia de codificación de centrin4 pez cebra (cetn4) en marco con una proteína fluorescente ² (FP), tales como proteína fluorescente amarilla para generar cetn4-YFP. Clonar la secuencia de direccionamiento mitocondrial de la subunidad VIII de la citocromo c oxidasa en marco con un FP tal como la proteína fluorescente cian para generar mitoCFP ^9-11.
2. Para restringir la expresión de las proteínas de fusión (cetn4-YFP o mitoCFP) a las células específicas de la zebrafish embrión (por ejemplo, neuronas o células musculares) utilizan el bipartito sistema de expresión Gal4-UAS ^26,27. En primer lugar generar un constructo indicador UAS. Utilizar métodos convencionales para clonar la proteína de fusión en un vector de expresión UAS, aguas abajo de la Gal4-UAS casete de unión (variantes van desde 1x a 14x UAS, ver Discusión) ^26,27,30 y un promotor mínimo (promotor basal E1b de la carpa βactin gen), y generar UAS: cetn4-YFP y UAS: mitoCFP.
   NOTA: Para preparar el reportero UAS construye para la generación de la línea transgénica estable elementos adicionales necesitan ser clonado (ver 3 abajo)
3. Para visualizar el contexto celular en el que los centrosomas o mitocondrias están etiquetados, generar reportero UAS construcciones en las que las membranas celulares son etiquetados por los MF. Clonar los primeros veinte aminoácidos de pez cebra GAP43 (que contienen sitios de palmitoylation) en marco con un FP para apuntar que el FP a la membrana celular (memFP) ^31,32.
4. obten construcciones conductor o líneas transgénicas en las que células de tipo elementos promotores específicos conducir la expresión del activador transcripcional Gal4-VP16 ^27, Gal4FF ³³ o ³⁰ KalTA4.
5. Combinar el reportero UAS construye con un constructo controlador apropiado para restringir la expresión al tipo celular deseado de interés (por ejemplo, en las neuronas o células musculares). Para ello co-inyectar Gal4 conductor y reportero UAS construye en la etapa de células de los huevos fecundados (para obtener instrucciones detalladas, consulte 2 a continuación) para generar expresan transitoriamente peces. Por otra parte, generar un reportero UAS línea transgénica estable (para instrucciones detalladas vea 3 abajo) y cruzar a un conductor Gal4 línea transgénica estable para generar descendencia teniendo ambos transgenes.
   NOTA: También es posible inyectar UAS construcción informadora / s en óvulos fecundados de un conductor Gal4 línea transgénica estable o un conductor Gal4 construir en fertilizhuevos de Ed de un reportero UAS línea transgénica estable.
6. Para co-expresar múltiples proteínas de fusión distinto utilizando el sistema Gal4-UAS, utilizar un controlador de Gal4 y UAS reportero / s en una de las siguientes configuraciones: A. múltiple, constructos indicadores UAS separadas (por ejemplo, UAS: mitoCFP y UAS: memYFP co : se inyecta con una construcción Gal4 conductor) ^10, B. múltiples casetes de UAS en un solo indicador (por ejemplo, UAS: cetn4-YFP, UAS: memCerulean) ¹² C. Reportero bidireccional UAS (por ejemplo UAS: memYFP, mitoCFP) ^2,10,24 (Figura 1).

Figura 1. Estrategias para co-expresan proteínas de fusión que utilizan el sistema Gal4-UAS.
Co-expresión de múltiples proteínas de fusión se puede conseguir mediante el uso de casetes reportero UAS en varias configuraciones: (A) múltiple, const UAS guiado separadoructs, (B) múltiples casetes de UAS en un único constructo o (C) un casete UAS bidireccional en una sola construcción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Generar expresión transitoria de los pescados

NOTA: La siguiente es una adaptación de protocolos previamente publicados ^34,35. Una configuración básica de inyección debe incluir un estereomicroscopio con un rango de ampliación de hasta 12x, un micromanipulador con un soporte micropipeta y una fuente de presión de aire. Preparar 2,1-2,5 antes de tiempo:

1. Para preparar cámaras de microinyección de huevos, preparar una solución de 1,5% (v / w) de agarosa en agua. Añadir polvo de agarosa al agua y microondas hasta que la agarosa se disuelva completamente. Llenar una placa de Petri (100 x 15 mm) con esta solución.
   1. Permitir que la solución de agarosa se enfríe a aproxoximately 45 ^° C antes de colocar un molde de plástico microinyección (40 mm x 66 mm, con 6x 50 mm cantos largos que son de 1,5 mm de ancho, 1 mm de profundidad y separados 3 mm de separación) en la superficie de la agarosa fundida, teniendo cuidado de no introducir burbujas en la interfase.
   2. Después de la puesta de agarosa, almacenar a 4 ^° CO / N. Retirar con cuidado el molde con una espátula. Preparar múltiples cámaras de microinyección a la vez, se almacena a 4 ^° C y utilizar en repetidas ocasiones durante varias semanas.
2. Use un extractor de micropipeta de inyección para generar capilares de vidrio con un vástago largo ^36.
   NOTA: Los ajustes específicos que se utilizan para generar los capilares de inyección debe ser determinada empíricamente. capilares de inyección se puede tirar antes de tiempo y se almacenan antes de su uso.
3. Medir la concentración de ADN plásmido (Gal4 conductor y construcciones de reportero UAS) para la microinyección usando un espectrofotómetro de acuerdo con el manual del fabricante. Medida60; la relación de la absorbancia a 260 nm y 280 nm (A260 / 280). Diluir el ADN a una concentración final de 100 ng / l en agua libre de nucleasa.
   NOTA: una relación A260 / 280 de ~ 1,8 significa ADN puro. Considere el uso de un kit comercial (basado en la matriz de unión a base de sílice) para purificar el ADN de plásmido a ser utilizado para la inyección. El ADN del plásmido debe ser de alta calidad para evitar la toxicidad.
4. Preparar 10 l de inyección de mezcla mediante la combinación de ADN (0,5 a 2,5 l de una 100 ng / Stock l para una concentración final de 5 a 20 ng / l), la solución de Danieau (0,33 l de 30x de stock), rojo de fenol (0,25 l, opcional) y libre de nucleasa agua hasta un volumen total de 10 l.
   NOTA: determinar empíricamente la concentración de ADN que produce expresión adecuado. Gal4 conductor y plásmidos indicadores UAS necesitan ser co-inyectado. Ninguna expresión se producirá cuando se inyecta sólo el conductor Gal4 o plásmido reportero UAS de tipo salvaje en huevos fertilizados. Sin embargo, si tque fertiliza los huevos son de una línea Gal4 conductor luego de la inyección de uno o varios plásmidos indicadores UAS basta. A la inversa, si la microinyección en una línea de reportero UAS, sólo el plásmido Gal4 conductor necesita ser inyectado. Finalmente, si bien rojo fenol puede ayudar en gran medida a visualizar inyecciones, también es un compuesto fluorescente en sí. Por lo tanto, rojo fenol podría oscurecer los MF visualización de imágenes si se planea antes de 24 horas después de la fecundación (HPF), ya que no puede ser lo suficientemente diluida por este tiempo.
5. La noche antes de las inyecciones se han previsto, estableció varios pares (típicamente de 5 a 10) del macho y la hembra de pez cebra para la cría. Utilizar tanques de cría con un inserto que contiene una parte inferior cuadriculada y un divisor removible para separar el peces machos y hembras.
   NOTA: Varón y hembra de pez cebra en general, se pueden distinguir por su forma del cuerpo. Los hombres tienden a ser más delgados mientras que las mujeres tienden a mostrar un abdomen ventral que sobresale. Los machos, además, tienden a tener un col rojo amarillentooring en su zona abdominal ventral.
6. Inmediatamente antes de la inyección de ADN, retire los separadores para permitir que el macho y la hembra para aparearse. Aproximadamente de 15 a 30 min después de retirar el divisor, la verificación de los huevos en la parte inferior del tanque. Transferir los peces adultos usando una red de pesca a un nuevo tanque de cría.
7. Verter el agua, que contiene los huevos fertilizados establecidos recientemente, fuera del tanque de cría en un tamiz (por ejemplo, un colador de té de plástico). Lavar los huevos en el tamiz utilizando una botella de spray que contiene la solución de Danieau. Invertir el tamiz en una placa de Petri y el uso de una botella de aerosol con la solución de Danieau para recuperar todos los huevos (típicamente 50 a 200 huevos por cría par de peces adultos).
8. Con una pipeta microloader, volver a llenar un capilar de inyección desmenuzado con la inyección de mezcla de ADN. Montar el capilar de inyección en el soporte de un micromanipulador y recortar la punta, bajo el control visual de un microscopio estereoscópico, el uso de fórceps para crear una micropipeta que puede penetrate el corion y el citoplasma de la célula mientras que ser capaz de entregar un volumen adecuado del ADN.
   NOTA: El grado en que se recorta la punta del capilar de inyección debe ser determinada empíricamente y mejor puede ser juzgado cuando se inyectan los huevos.
9. Para determinar el volumen de ADN para inyección, descargar una gota de la solución de inyección en el aceite mineral. Medir el radio (r) de la gota utilizando un micrómetro de calibración y el cálculo de su volumen (4/3 π r ^3). Modular el volumen mediante el ajuste de la presión de inyección y / o la duración de cada pulso de la inyección.
10. Usando una pipeta de plástico, transferir todos los huevos recogidos (típicamente 50-200, desde el 2,7 anterior) en las trincheras de una cámara de microinyección. Bajo el control visual de un microscopio estereoscópico, el uso de fórceps para orientar los huevos de manera que el citoplasma de la célula (transparente) y la yema (densa, no transparente) pueden ser fácilmente identificados.
11. Bajo el control visual de un equipo de músicamicroscopio, inyectar ADN en el citoplasma de la célula del huevo fertilizado, teniendo cuidado de asegurarse de que el volumen inyectado (1 a 2 nl) corresponde a aproximadamente el 10% del volumen de la célula.
    NOTA: El fenol rojo en las ayudas solución de ADN en la visualización del volumen inyectado.
12. Después de la inyección, aflojar los huevos de las trincheras del molde de inyección mediante el lavado con una botella de spray que contiene la solución de Danieau. Posteriormente transferir los huevos en una placa de petri fresco con una pipeta de transferencia de plástico y mantener en una incubadora a 28,5 ^o.
13. Mantener los huevos de las Naciones Unidas de inyección como controles para determinar si las inyecciones contribuyen a las altas tasas de mortalidad, ya sea como resultado de daños físicos sufridos durante la penetración micropipeta o la mezcla de ADN.
    NOTA: Las altas tasas de mortalidad después de las inyecciones podrían deberse a numerosos factores, entre los volúmenes de concentración o de inyección excesivamente alta de ADN y / o plásmidos con ContaminaNTS. Para evitar la toxicidad de las preparaciones de ADN de baja calidad, kits comerciales (en base a la matriz de unión a base de sílice) se pueden utilizar.
14. A intervalos regulares después de las inyecciones, utilizar un microscopio estereoscópico para la detección de huevos no fertilizados y embriones muertos o con malformaciones y desechar estos.
    NOTA: Deem los huevos que parecen estar en la etapa de una sola célula de varias horas después de la fertilización, ya que no fertilizado. Identificar los embriones malformados por defectos anatómicos, tales como ejes cuerpo anterior-posterior comprometidos. material amorfo dentro de un corion sugiere que el embrión no procedió a través de las etapas de desarrollo y murió. Para determinar si los embriones que con microinyecciones se someten a un curso normal del desarrollo consultar los atlas anatómicos ^37.
15. La transferencia de los embriones utilizando una pipeta de transferencia de plástico para la solución de Danieau que contiene 1x 1-fenil-2 tiourea (1xPTU) entre 10 y 24 HPF para evitar la formación de pigmento. Mantener los embriones en cont solución de Danieauaining PTU para la duración del experimento.
    NOTA: Además de melanóforos, iridophores en la superficie de la piel pueden ser problemáticas para la imagen. Mientras PTU no inhibe la formación de iridophore, líneas mutantes con un número reducido de iridophores como Roy Orbison (Roy) existen y se pueden usar ^38.
16. Después de la eclosión los embriones (por lo general en la post-fertilización segundo o tercer día, 2 o 3 dpf), desechar los chorions e intercambiar la solución del Danieau contiene PTU.
    Nota: estos pasos son importantes para garantizar la calidad del medio de embrión y la viabilidad de los embriones sanos.

3. Generar líneas transgénicas estables

NOTA: Estable líneas transgénicas se pueden generar de manera eficiente utilizando el sistema de transposón Tol2. Un vector transposón Tol2 que contiene el transgén de interés es co-inyectados junto con el ARNm que codifica la enzima transposasa en fertilizand huevos en el estadio de una célula. Proteína transposasa derivado del mRNA inyectado cataliza la escisión del casete del transgén a partir del vector transposón y su integración en el genoma ^39.

1. Clonar el casete reportero transgén (por ejemplo, UAS: mitoCFP) entre Tol2 repeticiones terminales invertidas en uno de los vectores Tol2 utilizados actualmente en la comunidad pez cebra como se describe ^40.
   NOTA: vectores Tol2 que contienen un casete de selección en el que los elementos promotores dirigen la expresión FP en sistemas de órganos no relacionadas con el área de interés (por ejemplo, el corazón ⁴¹ o la lente ⁴²⁾ son útiles para el cribado de líneas transgénicas reportero UAS en ausencia de Gal4 transactivación.
2. El uso de un kit comercial (basado en la matriz de unión basado en sílice), purificar el ADN de plásmido a ser utilizado para la inyección. Asegúrese de que el ADN de plásmido es de alta calidad para prevenir la toxicidad.
3. Transcribir ARNm que codifica la transposasa-Tol2 utilizando unavector de transcripción apropiado tal como PCS-TP ^43. Brevemente, linealizar PCS-TP y el uso de un kit comercial para generar capsulado mRNA y seguir el protocolo del fabricante. Tener cuidado para evitar la contaminación con RNasas (por ejemplo, utilizar puntas de pipeta y tubos de RNasa libre). Alícuota de la ARN, a una concentración de 100 ng / l, para un solo uso y se almacena a -80 ^° C
4. En la mañana de las inyecciones, descongelar una alícuota de ARNm transposasa en hielo. Mezclar el vector de ADN transposón (2 l de 100 ng / l) y transposasa mRNA (2 l de 100 ng / l) en una relación 1: 1, y añadir 6 l de RNasa libre de agua para llevar el volumen total a 10μl.
   NOTA: una concentración de 20 ng / l se recomienda para cada uno, pero la concentración óptima debe determinarse empíricamente. Utilice agua libre de ARNasa para la dilución. Utilizar guantes para manipular la mezcla de la inyección de ADN-ARN y mantenerlo en hielo durante todo el período de inyecciones para prevenir la degradación de la mRNA.
5. Usando las instrucciones detalladas en el apartado 2 anterior, inyectar la mezcla de la inyección de ADN-ARN en los huevos fertilizados en la etapa de una sola célula. Bajo el control visual de un microscopio estereoscópico orientar el citoplasma celular en el estadio de una célula de los índices más altos de eficiencia de la transgénesis. Mantener los embriones inyectados en 28.5 ^° C hasta que esté listo para la detección de la expresión del transgen.
   NOTA: La PCR se puede hacer para buscar la eficiencia de la transposasa Tol2 como se describió anteriormente ^44.
6. embriones de pantalla en una placa de Petri para la transgénesis mediante los oculares de un microscopio de disección de fluorescencia.
   NOTA: Utilice los conjuntos de filtros apropiados del microscopio para visualizar la expresión FP del casete de selección (es decir, la fluorescencia en el corazón o el objetivo) a las 2 o 3 dpf. Identificar posibles embriones transgénicos por la expresión (en el corazón o el objetivo) y elevar estos embriones hasta la edad adulta (F ₀ generación) utilizando el estándar⁴⁵ protocolos. Alternativamente, identificar posibles embriones transgénicos por PCR como se describe en ^46.
7. Una vez que el reportero UAS F ₀ peces son de 2,5 - 3 meses de edad, cruzarlos (véase 2.5 para más detalles) a la de tipo salvaje peces no transgénicos para adquirir huevos para establecer una generación F _1. Alternativamente, cruzar el reportero UAS _F0 peces a una línea Gal4 conductor para establecer una generación F _1. En este último caso, el transgén UAS guiado se puede monitorizar directamente en los embriones obtenidos a partir de la cruz.
8. Use un microscopio de fluorescencia de disección para detectar F ₁ embriones para la expresión del transgén o cassette seleccionable.
   NOTA: Cuando la expresión se confirma a continuación, el transgén se puede decir que se transmite de la línea germinal. La transgénesis es no mendeliana en la etapa F _0. El número de embriones que expresan el transgén puede variar de un número pequeño para la gran mayoría en Clutche individuos. La integración del transposón en diferentes _F0 pescado puede variar en gran medida, lo que resulta en diferentes patrones de expresión. Por lo tanto mantener la _F1 peces de diferentes F ₀ fundadores como sub-líneas separadas. Integraciones transposón en F ₁ peces son estables y se transmiten a las generaciones posteriores de una manera mendeliana.
9. Mantener cada F ₀ peces en tanques separados para volver a identificar a los portadores del transgén.

4. Preparar los embriones de Imagen de un microscopio vertical

NOTA: Los procedimientos descritos aquí se han optimizado para obtener imágenes de microscopios verticales con objetivos a distancia de inmersión de cono de agua-de trabajo de largo.

1. Utilizar un microscopio de fluorescencia para detectar la disección de embriones para la expresión del transgen.
   NOTA: La expresión de un transgén reportero UAS dependerá de la línea específica Gal4 conductor utilizado. Seleccionar embriones para experimentos de imagen deseada en base a expresión patrón.
2. La transferencia de los embriones seleccionados usando una pipeta de plástico a una placa de Petri independiente que contiene tampón de Danieau con 1x 1x PTU y tricaína.
   NOTA: Cuando etiquetado es escasa (sólo unas pocas células en un sistema de órganos) montar los embriones en agarosa (ver 4.3 a 4.7 más adelante) y la pantalla para la expresión del transgen utilizando un microscopio de campo amplio con objetivos de gran aumento (véase 5.1 más adelante). Tricaína anestesia a los peces y debería ser eficaz en cuestión de segundos. Si el pescado no se inmovilizan, es probable que la tricaína ha degradado. Las posibles razones de esta degradación son la mala conservación de Tricaína, que es sensible a la luz ^47.
3. Preparar la agarosa para incrustar el pescado por disolución de polvo de agarosa de bajo punto de fusión en tampón de Danieau a una concentración final de 0,7%. Alícuota (1 ml) y guardar en un bloque de calor a 40 ° C hasta que esté listo para su uso.
   NOTA: Superior concentrationes de agarosa (hasta 1,5%) también se puede utilizar para incrustar pescado.
4. Añadir 50 l de un stock de Tricaína 20x y 20 l de una solución 50x social de la PTU a la alícuota de 1 ml de bajo punto de fusión de agarosa y mezclar bien tocando el lado del tubo. Vuelva a colocar el tubo para el calor-bloque. Usando una pipeta de transferencia de plástico, una pipeta suavemente unos pocos (1-10) embriones anestesiados en la agarosa, la transferencia de tan poco líquido como sea posible para evitar la dilución de la agarosa.
5. Usando una pipeta de transferencia de plástico todos los embriones con una pequeña cantidad de agarosa a una placa de Petri de vidrio inferior.
6. Trabajando relativamente rápido, el uso de fórceps para colocar los embriones en la orientación deseada, dependiendo de la estructura a explorar.
   NOTA: embriones de Oriente, por su parte, si la retina o Rohon-Barba (RB), las neuronas sensoriales deben ser incluidas en la imagen.
7. Dejar que la agarosa solidifique durante al menos 15 minutos. Añadir tampón de Danieau contiene 1xPTU y 1xTricaine para cubrir los embriones incrustados en agarose. Coloque el recipiente que contiene los embriones de agarosa embebidos en una incubadora a 28,5 ^° C hasta el momento de la imagen.

5. Imaging celulares y subcelulares utilizando estructuras de campo amplio o Microscopía Confocal

NOTA: La microscopía de campo amplio y punto microscopía confocal de barrido son las modalidades más utilizadas para obtener imágenes de embriones de pez cebra marcados con fluorescencia Tabla 1 resume las principales ventajas y desventajas de ambos sistemas.. Para ambas formas de microscopía, los embriones se montan en agarosa como se describe en 4 anteriormente, y se mantuvo a 28,5 ^° C durante todo el experimento de formación de imágenes mediante el uso de una cámara de calentamiento en la platina del microscopio. Es importante destacar que, se permite que el plato con embriones de agarosa embebidos que se equilibre a 28,5 ^° C antes del inicio de formación de imágenes como las fluctuaciones de temperatura causan la deriva en la dimensión z. Al llevar a cabo los experimentos de imagen a largo plazo (más de Several hora), colocar una cubierta de plexiglás sobre la placa de Petri para reducir la evaporación de la memoria intermedia.

Tabla 1. Comparación general de campo amplio y punto microscopía confocal de barrido

1. La microscopía de campo amplio
   NOTA: A continuación se proporcionan directrices para obtener imágenes de embriones de pez cebra utilizando un microscopio de campo amplio en posición vertical con objetivos a distancia de inmersión de cono de agua-de trabajo de largo. El microscopio está equipado con una cámara CCD enfriada, y conjuntos de filtros para la visualización de diferentes fluoróforos montado en una rueda de filtros automatizado para la adquisición rápida de múltiples canales.La adquisición de imágenes es controlado por μManager, un paquete de software de ⁴⁸ microscopia de código abierto. Se proporciona un ejemplo específico para obtener imágenes de las mitocondrias en las neuronas sensoriales RB. RB células están etiquetados genéticamente utilizando membrana específica YFP y sus mitocondrias son etiquetados-PPC (véase el apartado 1.1).
   1. Embriones de montaje de su lado en bajo punto de fusión de agarosa como se describe en el punto 4.
   2. Dejar que la cápsula con pescado montada se equilibre a 28,5 ^° C en una cámara de calentamiento en la platina del microscopio antes de comenzar la proyección de imagen.
   3. Use la mínima aumento del objetivo de inmersión en agua de cono y mirar a través de los oculares del microscopio para elegir un área en la superficie del embrión a la imagen.
      NOTA: Si la línea reportero MitoFish transgénico estable, Tg (UAS-E1b: MyEP, mitoCFP) ^mde6, se utiliza en conjunción con una alineación de pilotos como HUC: Gal4 continuación, las neuronas más RB están etiquetados, y aparece como una densa mesh-trabajo de cenadores de neuritas sobre la superficie del embrión. Si la microinyección de construcciones de ADN que se utiliza para conseguir el etiquetado escaso (por ejemplo, sensorial: Gal4-VP16 con UAS: mitoCFP y UAS: MA-YFP), los embriones pantalla para identificar las células de doble etiquetado.
   4. Abra el software de microscopio (μManager 1.4) y haga clic en "Iluminación '' en" Ajustes de configuración "para definir los conjuntos de filtros correctos para la longitud de onda de interés (YFP o PPC para el ejemplo actual). En" Configuración de la cámara "entrar en el tiempo de exposición requerido para adquirir una imagen adecuada.
      NOTA: Los "ajustes de iluminación" es pre-establecido por el usuario durante la instalación del software y se carga al abrir μManager. Si el software no está configurado para controlar la rueda de filtros, mover manualmente la rueda de filtros en la torreta a la posición apropiada.
   5. Cambiar a un objetivo de inmersión en agua de cono distancia larga de trabajo que van desde 40-100x ampliación. Escogerel objetivo que tiene la más alta apertura numérica (NA) y se corrige cromáticamente (Apocromático).
   6. Haga clic en "Live" para seleccionar el campo de vista: En el caso de la neurona RB, el transporte mitocondrial imagen en el axón tallo, que emana del cuerpo de la célula, o en el cenador periférica.
      NOTA: Las pérgolas periféricas de las neuronas RB en el pliegue de la aleta caudal del embrión proporcionan una oportunidad ideal para una imagen de gran campo de visión que es plana y por lo tanto puede ser capturado en un solo cuadro con un microscopio de campo amplio. Por tanto, es importante montar el embrión como de plano como sea posible en su lado, de modo que el pliegue de la aleta caudal es paralela a la parte inferior de la placa de Petri.
   7. Después de elegir un campo de vista, haga clic en el botón "selección rectangular" en el menú de ImageJ, definir una región de interés (ROI) y haga clic en "retorno de la inversión" en la ventana μManager. Después de seleccionar el retorno de la inversión para la formación de imágenes, haga clic en "Stop" y "Guardar" para take una imagen del canal de YFP para grabar la morfología local de la neurita / s.
   8. Para el transporte mitocondrial de imagen, haga clic en el "Multi-D Acq." botón. Observar una ventana adicional ( "multi-dimensional de Adquisición") y seleccione el número de puntos de tiempo, así como el intervalo entre los puntos de tiempo de esta ventana. Utilizar velocidades de fotogramas de 0,3-1 Hz. Llevar a cabo las grabaciones durante al menos 10 minutos para recoger tantos puntos de datos como sea posible.
   9. En la ventana de "multi-dimensional de Adquisición", haga clic en "Canales", agregar y definir la longitud de onda para la imagen (PPC para las mitocondrias en este ejemplo) y el tiempo de exposición. Mantener los tiempos de exposición por debajo de 400 ms para obtener imágenes de transporte mitocondrial.
   10. Haga clic en la opción "Guardar imágenes" en la ventana de "multi-dimensional de Adquisición", para guardar automáticamente los archivos en una carpeta específica se indica en el "directorio raíz". Haga clic en "Adquirir" en la esquina superior derecha para iniciar timimágenes e-lapso.
   11. vuelva a ajustar manualmente el enfoque durante la grabación de lapso de tiempo para compensar cualquier desviación en la dimensión z.
       NOTA: El uso de estos parámetros de transporte mitocondrial en las neuronas RB se pueden obtener imágenes durante el tiempo que 4 hr.
2. Microscopía confocal
   NOTA: A continuación se proporcionan directrices para la formación de imágenes con un microscopio confocal Olympus FV1000 en posición vertical y objetivos de inmersión en agua-cono-distancia de trabajo larga. El microscopio está equipado con múltiples líneas de láser y varios detectores (PMT convencionales y detectores de fosfuro de arseniuro de galio más sensibles) que permiten la formación de imágenes de múltiples canales. Se hace referencia específica al software Olympus Fluoview. Sin embargo, los parámetros de imagen que aquí se describen deben ser fácilmente transferibles a otros sistemas confocal.
   1. Embriones de montaje en bajo punto de fusión de agarosa en una orientación apropiada para el órgano / estructura para obtener imágenes, como se describe en 4 anteriormente.
   2. Dejar que la cápsula con pescado montada se equilibre a 28,5 ^° C en una cámara de calentamiento en la platina del microscopio antes de comenzar la proyección de imagen.
   3. Utilice objetivos de inmersión en agua-cono-distancia de trabajo larga para microscopios confocales en una configuración vertical. Elija objetivos con el más alto posible NA para maximizar la cantidad de señales fluorescentes que pueden ser recogidos y tienen la mejor capacidad de resolución. Cuando las imágenes que recogen de varios canales eligen objetivos cromáticamente corregidas (apocromáticos).
   4. Abra el software de microscopio y hacer clic en "Trans lámpara" o "lámpara Epi" para utilizar la luz transmitida o fluorescencia, respectivamente, para identificar la región de interés a través de los oculares del microscopio.
   5. Utilice el software para configurar los siguientes parámetros de escaneado para adquirir pilas de imágenes:
      1. En la ventana de "Configuración de Adquisición" verificar que el objetivo elegido para la imagen coincide con el objetivo que aparece en el menú Down menú de objetivos disponibles.
         NOTA: Esto es para asegurar que todos los parámetros calculados de antemano para un objetivo particular (por ejemplo, y la resolución axial, lateral, el tamaño de la apertura confocal, etc.) son válidas y se pueden utilizar de forma fiable.
      2. Seleccione los filtros de línea láser / s, y la excitación y de emisión dicroicas adecuadas a la proteína fluorescente específica de la imagen (s). Para ello, al hacer clic en el botón "Lista de tinte" en la ventana de "Adquisición de imágenes de control" y elegir la adecuada fluoróforo / s. Alternativamente, haga clic en el botón "trayectoria de luz y colorantes" para ajustar estos parámetros de forma manual.
         NOTA: Cuando se elige la opción "Lista de Tinte", el software selecciona automáticamente los filtros dicroicos líneas de láser, de excitación y de emisión adecuados y ajusta el tamaño de la abertura confocal adecuadamente.
      3. En la ventana de "Configuración de Adquisición", ajustar el factor de "Zoom" y "Tamaño aspect relación "(es decir, 512x512, 1024x1024, etc.) de la imagen digitalizada para obtener el tamaño de los píxeles necesarios para resolver mejor las estructuras se toman imágenes. Establecer el tamaño de píxel en alrededor de la mitad de la resolución teórica del objetivo, siguiendo así los criterios de muestreo de Nyquist . para determinar el tamaño de píxel de la imagen adquirida clic en el botón con el símbolo de información ( "i") en la ventana de "Adquisición de imágenes de control".
      4. Ajuste la velocidad del análisis y el más rápido posible (2 microsiemens / píxel) en la ventana de "Configuración de Adquisición".
      5. En la "Adquisición de imágenes de control" ventana, haga clic en la línea de Kalman promediado para reducir el factor de noise.A de 2 a 3 suele ser suficiente.
      6. Seleccione un modo de exploración secuencial cuando se generan imágenes fluoróforos con espectros superpuestos. Para ello, haga clic en "secuencial" y "Línea" en la ventana de "Adquisición de imágenes de control".
      7. Ajustar la potencia de salida de la línea de láser / s relevantes (normalmentepor debajo de 5%). Los valores específicos necesitan ser determinados empíricamente.
      8. Haga clic en el botón "XY Repetir" o el "Enfoque x2" o "Focus x4" para escanear continuamente la región seleccionada mientras se ajusta la configuración del detector para cada canal. Ajuste "HV", "ganancia" y "Offset" para cada canal para adquirir las imágenes que tienen el rango dinámico más alto de valores de gris.
         NOTA: Los valores específicos para estos parámetros deben ser determinados empíricamente. "HV" ajusta el voltaje en el detector para cambiar su sensibilidad, "Offset" ajusta la señal de salida del detector y "ganancia 'multiplica la señal de salida del detector por un factor constante.
      9. Presione Ctrl + H para visualizar las imágenes adquiridas a través de una tabla de consulta (Hi-Lo) que identifica insuficientemente saturada (vea azul) y más saturado pixeles (aparecen de color rojo), ambos de los cuales por lo general se deben evitar. Re-evaluar la potencia de salida del láser relevante line / s y la configuración del detector.
         NOTA: El uso de la energía láser de alta y altos niveles de la "alta tensión" del detector conducirá a una mayor señal. Sin embargo la potencia del láser más alto conducirá a un aumento de blanqueo y fototoxicidad. El aumento de la "alta tensión" dará lugar a un aumento del ruido. Por lo tanto, un compromiso necesario encontrar la hora de establecer la potencia del láser y "HV" para adquirir imágenes con niveles aceptables de ruido mientras que la prevención de foto-daño (ver también la Tabla 1).
      10. Recoger las imágenes de un volumen definido, centrándose en los límites superior e inferior de la zona de interés. En la "Adquisición entorno" ventana, haga clic en los botones "End Set" y "Comienzo del" conjunto de la ventana z-pila en los límites superior e inferior de volumen a explorar. Seleccione un tamaño de paso que es la mitad de la z-resolución para el objetivo determinado (por ejemplo., Si z resolución es de 2 micras elegir 1 micra). Para determinar la z-resolución de la objetive Haga clic en el botón con el símbolo de información ( "i") en la ventana de "Adquisición de imágenes de control".
      11. Establecer una serie de tiempo para recoger z-pilas a una frecuencia temporal que es apropiado para la dinámica de la estructura subcelular se toman las radiografías. En el "TimeScan" sub-ventana de entrar en la frecuencia en la que z-pilas deben ser adquiridos ( "Intervalo" ') y el número de veces que las imágenes deben ser obtenidas ( "Num").
      12. Haga clic en el botón "Time" "Profundidad" y en la ventana "Control de Adquisición de imágenes" para confirmar que una pila Z y de series temporales serán adquiridos. Por último, haga clic en el botón "XYZT" para iniciar la adquisición de imágenes con lapso de tiempo.
      13. Tras la finalización de la adquisición de imágenes, observar "Serie Hecho" en la interfaz de software. Haga clic en él y guardar las imágenes en formato "oib" para grabar las imágenes y los metadatos asociados con ellos.
          Nota: Las imágenes obtenidas en elmicroscopio de campo amplio y microscopio confocal pueden ser visualizados y analizados mediante el software como Fiji, un programa gratuito de procesamiento de imágenes de dominio público.

Aquí el uso de campo amplio y microscopía confocal para las mitocondrias de imagen y los centrosomas en embriones de pez cebra que vive está directamente comparado y contrastado. Dependiendo de la localización de las células en las que la dinámica de orgánulos han de ser examinada y la frecuencia propia de los acontecimientos subcelulares específicos, por lo general, ya sea de campo amplio o microscopía confocal es la mejor opción. Nos fotografiado orgánulos en las neuronas RB situados en la superficie del embrión y en células de la retina situadas más profundo. La localización superficial de las neuronas RB junto con sus dos la geometría tridimensional les hacen buenos candidatos para ser fotografiada por tanto de gran campo y microscopía confocal (Figura 2). La adquisición de imágenes mediante microscopía confocal Sin embargo, es significativamente más lento y puede llevar a una subestimación de la dinámica de los acontecimientos subcelulares específicos (por ejemplo, el movimiento de las mitocondrias, la figura 2C, D ). Imágenes de células de la retina adquiridos por microscopia de campo amplio sufren de contraste pobre como señales de fluorescencia de un gran volumen de tejido oscurece detalle en el plano focal. Aquí, la capacidad de seccionamiento óptico de los resultados de microscopía confocal en notablemente mejor contraste (Figura 3).

Para permitir la visualización simultánea de los orgánulos y membranas celulares se utilizó el sistema Gal4-UAS en tres configuraciones diferentes. En primer lugar, la línea reportero UAS MitoFish Tg (UAS-E1b: MyEP, mitoCFP) se utilizó ^mde6. Aquí, un UAS bidireccional permite la expresión concomitante de CFP orientado mitocondrialmente-y la membrana dirigida YFP. En combinación con las líneas de Gal4 conductor apropiadas, MitoFish etiquetar las membranas de las mitocondrias y celulares de las neuronas sensoriales RB (Figura 2A-C) o células de la retina (Figura 3A, B) con PPC y YFP r espectively. En segundo lugar, dos UAS construye (UAS: mitoCFP y UAS: MA-YFP) se combinaron con una construcción Gal4 conductor (sensorial: Gal4-VP16, elementos sensoriales específicos de neuronas potenciador del gen islote-1) ⁷ en inyecciones transitorios. La expresión mosaico que resulta generalmente de estas inyecciones permite el rastreo de células individuales durante días (Figura 2E). Un tercer enfoque emplea el uso de dos casetes de UAS, cada uno que dirige la expresión de una proteína de fusión diferente, en una única construcción contiguos. Esta estrategia se utiliza para generar CentrinFish Tg (UAS: cetn4-YFP, UAS: MA-Cerulean) ^tum1, en ​​el que las etiquetas de una fusión centrin4-YFP centrosomas y Cerulean está dirigida a las membranas celulares. En combinación con las líneas específicas para el conductor Gal4 los centrosomas y las membranas celulares de las células de la retina (Figura 3C, D) o fibras musculares (Figura 4) se etiquetan.

Figura 3: Comparación de campo amplio y microscopía confocal a orgánulos de la imagen in vivo en la retina de pez cebra embrionario.
Otx2 elementos promotores impulsan la expresión de la PPC en las mitocondrias y YFP en las membranas celulares (A y B) o YFP en los centrosomas y Cerulean en las membranas celulares (C y D) en la retina de 2 dpf embriones de pez cebra. Para lograr este patrón de marcación, Otx2: peces transgénicos Gal4 se cruzaron ya sea para MitoFish (A y B) or CentrinFish (C y D). Un objetivo Apocromático 40x de inmersión en agua de cono (NA 0,80) se utilizó para adquirir imágenes de la misma región en cada retina utilizando de campo amplio (A, C) y confocal (B, D) microscopía. Inserciones en A y B muestran el detalle de una región de la capa nuclear interna, inserciones en C y D muestran una celda de M-fase. La barra de escala 20 micras. Mitocondrial específica PPC (mitoCFP), la membrana específica YFP (MA-YFP), centrin4-YFP (cetn4-YFP), la membrana específica Cerulean (MA-Cerulean). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Comparación de campo amplio y microsc confocalopiar de centrosomas imagen en vivo.
Una fibra muscular individual con fluorescencia etiquetada membranas celulares y los centrosomas (Otx2: Gal4; CentrinFish) fue fotografiada usando de gran campo (A) y la microscopía confocal (B). En ambos casos se utilizó un objetivo Apochromat 40x-inmersión de cono agua (NA 0,80). La barra de escala 10 micras. Centrin4-YFP (cetn4-YFP), dirigido membrana Cerulean (MA-Cerulean) Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aquí, se demuestra la versatilidad del sistema de expresión Gal4-UAS a las mitocondrias de la etiqueta fluorescente, centrosomas y las membranas celulares de tipos de células específicas in vivo en embriones de pez cebra. Muchas proteínas de fusión fluorescentes que etiquetan otros orgánulos o estructuras subcelulares se pueden encontrar en la literatura publicada y se pueden obtener en el laboratorio respectivo, de fuentes comerciales o depositarios plásmido no comerciales (por ejemplo, Addgene). Para diseñar una nueva proteína de fusión fluorescente, varios parámetros deben ser considerados, incluyendo los que FP a utilizar y si no se funda la FP en el extremo amino o carboxi terminal de la proteína de interés. Para una discusión más a fondo sobre la generación de proteínas de fusión fluorescentes, se recomienda acudir a los artículos de fondo sobre el tema ^49-51.

Destacamos tres estrategias para lograr la co-expresión de proteínas de fusión utilizando los transgenes UAS-conducida. Múltiple, separate UAS construcciones indicadoras permiten la combinación de diferentes reportero existente construye sin la necesidad para la clonación adicional. los niveles de expresión Reporter también se pueden valorar de forma independiente. Sin embargo, se logran mayores niveles de co-expresión cuando se utilizan ya sea múltiples casetes de UAS o un casete UAS bidireccional en una sola construcción. Desde los MF se utilizan como etiquetas, es relativamente fácil para verificar co-expresión. Debe tenerse en cuenta que también existen otros métodos para la expresión de múltiples cistrónico, incluyendo el uso de sitios de entrada ribosomales internos ⁴⁰ y péptidos 2A virales ^52,53. Como una alternativa a construcciones basadas ADN, transcrito in vitro capsulado ARNm se puede utilizar para expresar proteínas de fusión fluorescentes para etiquetar las estructuras subcelulares ^1,4,8. Sin embargo, la advertencia de este enfoque es que la expresión se limita a los primeros días de desarrollo y no se célula o tejido específico. Independientemente del método elegido para expresar proteínas de fusión, es críticopara garantizar que los niveles de expresión no conducen a etiquetado no específica y comprometen el estado fisiológico de las células. En este sentido, la amplificación de la expresión del gen reportero inherente al sistema Gal4-UAS ²⁷ puede ser problemático, manifestándose por ejemplo como etiquetado citosólica incluso cuando el FP está dirigido a un orgánulo específico. Cuando estén disponibles, los anticuerpos se deben utilizar para verificar que los patrones de expresión obtenidos por proteínas de fusión reflejan la situación endógeno. En algunos casos, la inyección de concentraciones (er) ADN de bajo podría mitigar el problema de la mala localización de la proteína de fusión. Como alternativa, los vectores con un bajo número de repeticiones UAS podrían ayudar a valorar por los niveles de expresión del transgen ^30. Del mismo modo, para el activador, existe Gal4-VP16 versiones modificadas, que se informó para conducir la expresión comparativamente débil y por lo tanto son menos tóxicos ^30,33. Si mala localización de la proteína de fusión persiste a pesar de los esfuerzos para titular Down los niveles de expresión del transgen, puede que sea necesario renunciar al sistema Gal4-UAS y conducir la expresión por elementos promotores directamente.

Las líneas transgénicas estables, MitoFish ¹⁰ y ¹² CentrinFish, se describen en este manuscrito se hicieron usando casetes 14xUAS. Mantenemos estas líneas en el fondo de líneas GAL4 conductor para detectar alteraciones en la expresión a través de generaciones, ya que las líneas de reportero con múltiples repeticiones UAS se han notificado a ser propensos a silenciar a ^54. No hemos visto evidencia de silenciar a lo largo de los 3 generaciones hemos propagados la CentrinFish. Sin embargo, hemos visto variada expresión en MitoFish y por lo tanto estrictamente seleccionar embriones con niveles fuertes 'completo', de expresión para propagar para las generaciones futuras. La bibliografía actual sugiere que los vectores de expresión con repeticiones 5xUAS podría ser una alternativa para la generación de líneas transgénicas estables - el informador esconducido a niveles suficientemente altos ³⁰ y el número comparativamente bajo de la UAS se repite puede hacer que sea menos propenso a silenciamiento del transgén, aunque repite UAS no repetitivas son los informes, incluso menos susceptibles ^54.

La paleta de los programas marco actualmente disponible para la etiqueta orgánulos u otras estructuras subcelulares es muy amplio ^55. Al elegir un FP particular, como una etiqueta, se debe considerar a los siguientes parámetros: En primer lugar, los espectros de excitación y emisión de la FP para determinar la línea de láser específico, así como los filtros de excitación y emisión requeridos para su visualización. En segundo lugar, el brillo y la foto-estabilidad de la FP. En tercer lugar, la velocidad con la que el FP madura después de la traducción. En cuarto lugar, si el FP tiene una tendencia a agregarse en fusiones. En cuanto al último parámetro, se debe tener cuidado y experimentos de control se debe hacer para poner a prueba la idoneidad de cada FP para experimentos específicos. Por ejemplo, mientras que la red PM mCherry y DsRed son ampliamente utilizados, según los informes, forman agregados en ciertas fusiones ^56. Hemos encontrado TagRFP ^T-57, una variante más foto-estable de TagRFP, para un buen desempeño cuando se dirige a las mitocondrias y las membranas celulares (observaciones no publicadas). Cuando varios orgánulos necesitan ser visualizado de forma concomitante, los PM espectros no se solapan debe ser utilizado. Hemos combinaciones de los MF cian (CFP y Cerulean) y YFP (Figuras 2-4) utilizado con éxito. Mediante la explotación de todo el rango espectral del azul al infrarrojo cercano, se puede ampliar en gran medida el número de estructuras subcelulares que pueden ser visualizados simultáneamente ^2. Además de los programas marco convencional, fps fotoactivable son particularmente útiles para investigar la dinámica de orgánulos, por ejemplo, el uso de la FP Kaede para rastrear el destino de las mitocondrias individuales ^58.

¿Qué técnica de microscopía - de campo amplio o confocal - es el másadecuada para la imagen depende de una serie de factores, incluyendo la ubicación de las células a la imagen y la velocidad con la que se espera que los acontecimientos subcelulares o celulares específicos que se produzca. La microscopía de campo amplio es la modalidad preferida en lugares superficiales y muestras escasamente etiquetados. Ofrece baja fototoxicidad y las imágenes a alta velocidad a un precio razonable. Sin embargo, si necesita ser realizado en piezas no superficiales del pez cebra, en muestras marcadas densamente o para obtener información tridimensional, confocal o microscopía de otra forma de seccionamiento óptico de formación de imágenes se convierte en el método de elección.

Independientemente de qué estructura celular o subcelular está siendo monitoreado, a menudo hay un equilibrio entre la adquisición de la mejor imagen posible y manteniendo la muestra viva y en buen estado fisiológico para time-lapse repetida. Fototoxicidad puede manifestarse como cambios en el comportamiento de los orgánulos, morfología aberrante de células o incluso célulasmuerte. La clave para la reducción de la foto-blanqueo y fototoxicidad para ambos de gran campo y microscopía confocal es el uso de los niveles más bajos posibles de la luz para obtener imágenes. En este sentido, los objetivos con la más alta posible NA son la clave para maximizar la cantidad de señal fluorescente que se puede recoger. Para la microscopía confocal, un número de parámetros se puede ajustar para compensar el uso de la energía láser inferior. Detectores con mayor eficiencia cuántica en comparación con tubos fotomultiplicadores convencionales, por ejemplo, detectores de fosfuro de arseniuro de galio, se puede utilizar para asegurar que los fotones emitidos tienen mayor probabilidad de ser detectado. Alternativa o adicionalmente, más altos voltajes dínodo se pueden aplicar en la PMT para aumentar la sensibilidad de los detectores. La abertura confocal (pinhole) se puede abrir para permitir la recogida de señal más fluorescente, aunque con una pérdida de resolución axial. Para exponer las muestras a tan poca luz como sea posible, el escaneado se debe hacer a alta velocidad tal que el tiempo de permanencia deel láser por píxel es baja. El escaneo a una resolución espacial inferior también tiene el efecto de aumentar la velocidad de escaneado. Proyección de imagen con menor frecuencia tiene el beneficio adicional de exponer la muestra a menos luz, sin embargo, sólo debe considerarse si no pone en peligro el muestreo exhaustivo de los procesos investigados.

Como alternativa, los microscopios confocal de disco giratorio y microscopios confocales que están equipadas con un escáner llamado 'resonancia' ofrecen la capacidad para la exploración rápida. Ambas modalidades tienen la ventaja de que son más rápidos y menos microscopios confocal 'clásica', punto de escaneo de foto-tóxico que. Sin embargo, de disco giratorio microscopios confocales son más limitados en z resolución y no pueden penetrar tan profundamente en el tejido como microscopios punto confocal de barrido. Del mismo modo, la aplicación de los microscopios confocales de resonancia del scanner puede ser limitado como el muy corto tiempo de permanencia de píxeles dará lugar a una peor calidad de imagen que podría,a su vez, impedir la detección de eventos sub-celular (por ejemplo, imágenes binarias con reducida relación señal-ruido).

Por último, mientras que en todo el campo y la imagen confocal se destacan aquí, otras formas de microscopía de luz como de dos fotones ⁵⁹ y microscopía de luz de hoja ⁶⁰ pueden ser más apropiados para preguntas específicas. microscopía de dos fotones se basa en la excitación de un fluoróforo por la absorción simultánea de dos fotones en el rango infrarrojo del espectro de luz. En común con la microscopía confocal, se utiliza la exploración punto para adquirir imágenes de la muestra y tiene capacidades de seccionamiento óptico en virtud de la no linealidad de la excitación de dos fotones. El uso de luz de longitud de onda larga para la excitación del fluoróforo permite imágenes a profundidades de varios cientos de micras de la superficie. Además, la restricción de la excitación a un pequeño volumen de formación de imágenes evita foto-blanqueo y foto-toxicidad fuera del plano focal. Sin embargo, no todos FPs tienen alta absorción multifotónica secciones transversales, un problema que es especialmente frecuente en los programas marco rojo. Además, la búsqueda de una sola longitud de onda infrarroja para excitar simultáneamente múltiples programas marco distinto es difícil, por lo engorroso de formación de imágenes multi-canal. microscopía de lámina de luz utiliza una 'hoja' delgada (típicamente un espesor que oscila de 2 a 10 micras) de la luz láser para excitar la muestra y detecta las señales de fluorescencia de este plano focal iluminado en un ángulo perpendicular con una cámara sensible. seccionamiento óptico se consigue mediante la iluminación de un único plano a la vez. Esta restricción de la luz de excitación reduce la aparición de fototoxicidad. Dado que las señales de fluorescencia de todo el plano iluminado se recogen de forma simultánea, adquisición de imágenes es significativamente más rápido que el punto confocal de barrido y microscopios multifotónica. Todas estas características hacen que la microscopía de luz de hoja particularmente adecuado para la formación de imágenes dinámicas eventos celulares con alta resolución espacial y temporal engrandes volúmenes de muestras vivas. De hecho, el uso de hojas luz destino celular microscopía en todo el embrión de pez cebra fue rastreado exhaustivamente durante las primeras 24 h de desarrollo ^61. Con las mejoras continuas a una mejor penetración de ^62,63 formación de imágenes y la resolución espacial ^{de 64 años,} es concebible que la microscopía de luz de hoja se emplea para sondear la dinámica no sólo a nivel celular, sino también a nivel subcelular en embriones de pez cebra enteros.

The authors have nothing to disclose.

P.E. is supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Training Group 1373 and the Graduate School of the Technische Universität München (TUM-GS). G.P. was supported by TUM-GS. L.T. is supported by an EMBO fellowship (EMBO ALTF 108-2013). D.P.'s work on zebrafish was supported by the DFG through the Sonderforschungsbereich "Molecular Mechanisms of Neurodegeneration" (SFB 596); the Center for Integrated Protein Sciences (Munich) and the European Community's Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) under Grant agreement no. 200611 (MEMOSAD). He is currently a New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow and was supported by a fellowship from the German Academy of Sciences Leopoldina. L.G. is supported by funding from the DFG through SFB 870 "Assembly and Function of Neuronal Circuits", Project A11.

We are grateful to Kristina Wullimann for maintaining our fish facility, Yvonne Hufnagel for technical support and Thomas Misgeld for comments on the manuscript. We are grateful to R. Köster (Technische Universität Braunschweig) for providing the M1 Medusa vector (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP) from which we cloned out Centrin-YFP and S.C. Suzuki and T. Yoshimatsu (University of Washington) for providing the 14xUAS:MA-cerulean cassette which we used to generate the reporter construct to make CentrinFish. We further thank S.C. Suzuki and T. Yoshimatsu (University of Washington) for the Otx2:Gal4 transgenic line, A. Sagasti for the Sensory:Gal4-VP16 construct (UCLA) and M. Nonet (Washington University in St. Louis) for the pCold Heart Tol2 vector. We acknowledge Bettina Schmid, Alexander Hruscha and Christian Haass (German Center for Neurodegenerative Diseases Munich - DZNE) for contributing to the development of MitoFish.