הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

בשנת vivo הדמיה מספק ראיה ישירה של התנהגויות הסלולר בהקשר הפיזיולוגי ביותר. השקיפות של עוברי דג זברה, ההתפתחות המהירה והחיצונית שלהם מגוון עשיר של כלים גנטיים המאפשרים תיוג פלורסנט תרמה כולם בשימוש הגובר של מיקרוסקופיה in vivo על מנת להבהיר את הדינמיקה של אירועים התפתחותי חשובים. בדיקות הדמיה של התפתחות מערכת עצבים של דג זברה יש למשל הרחיבו את הידע שלנו מאוד של ההתנהגות של ובתאים עצביים ועל גורל הצאצאים שלהם כוללים שילוב ההגירה, בידול המעגל הבא שלהם ^1-8.

השלב מוגדר כעת לחקור את הדינמיקה subcellular שבבסיס התנהגויות הסלולר אלה. ואכן, דג זברה כבר מנוצל ככלי ביולוגיה של תא vivo. עכשיו זה אפשרי לדמיין המיטוכונדריה ^9-11, centrosomes ^2,8,12-14, Golgi ¹⁵, שלד התא microtubule ⁴ ו אקטין ^16, endosomes ¹⁷ ורכיבים של קרום הפסגה מורכבים ^1,18, בין מבנים subcellular אחרים עוברי דג הזברה in vivo. עד כה, הרבה ממה שידוע על הפונקציה של אברונים אלה מגיעים מלימוד התנהגותם בתאים בתרבית. בעוד מחקרים במבחנה ב הניבו תובנה אדירה לתוך ביולוגיה של התא, התאים בתרבית לא מייצגים במלואם את המורכבות של המצב vivo ולכן לא בהכרח משקפים את תפקוד ודינמיקה של אברונים subcellular in vivo. עוברי דג הזברה מציעים קיימא בחלופה vivo לבחינת הדינמיקה subcellular.

כפי חוליות, דג זברה להחזיק מערכות איברים רבות (למשל, רשתית עצבית) כי הם הומולוגיים לאלה שנמצאו מיני יונקים. בנוסף, עוברי דג הזברה משמשים יותר ויותר למודל מחלות אנושיות ^19,20 , כולל אלה הקשורים בתפקוד centrosomal (למשל, מיקרוצפליה ²¹ amaurosis מולדים לבר ²²⁾ ו לתפקוד המיטוכונדריה (למשל, מחלת פרקינסון ^23, tauopathies ^10,24 ובארט תסמונת ^25). הדמיה בשנת vivo ברמה התאית ו subcellular במקרים אלה יאפשר הבנה טובה יותר של ביולוגיה של התא הבסיסי מצבים פתולוגיים אלה.

המטרה הכללית של השיטות שתוארו כאן היא לספק מדריך מקיף לחקור אברונים מבנים subcellular אחרים עוברי דג הזברה באמצעות במיקרוסקופ אור vivo. עבודת הזרימה כולו מעורבת הדמית מעקב מבני subcellular in vivo מתוארת - מגישות תיוג גנטיות, ליצירה להביע זמנים ודגים מהונדסים יציבים, ולבסוף הדמיה באמצעות שדה רחב מיקרוסקופיה confocal. בעוד כל אחד proc אלהedures משמש מעבדות דג זברה רבות, בפרוטוקולים מתוארים ממוטבות יעילות לחקירת הדינמיקה של מבני subcellular. שני היבטים ספציפיים של העבודה המתוארת כאן מתחייבים להזכיר: ראשית, השימוש במערכת ביטוי Gal4-כטב"מ בתצורות מרובות אברונים תווית גנטי-סוגי תאים מסוימים. שנית, השוואה ישירה של שדה רחב מיקרוסקופיה confocal למבני subcellular תמונת in vivo.

אסטרטגיות שוטפות אברונים תווית גנטית ומבני subcellular אחרים דג זברה או לעשות שימוש ^1,4,8 mRNA כתרים או בונה מבוסס DNA שבו אלמנטי אמרגן ישירות לנהוג הביטוי של חלבוני היתוך ^9,14,15. במבחנת תוצאות RNA כתרים הועתקו מהירה ביטוי רחב, שאינו רקמות ספציפיות זאת. בנוסף, רמות הביטוי להפחית לאורך זמן כמו RNA כתרים הוא מדולל או מושפל. לכן השימוש RNA מבוססבונה לבחון הדינמיקה אברון בשלבים מאוחרים יותר בהתפתחות מוגבלת (בדרך כלל עד 3 ימים לאחר ההפריה).

ניתן להתגבר על מגבלות אלה באמצעות בונת DNA, שבו שליטה במרחב ובזמן של ביטוי נקבעה על ידי גורמי אמרגן ספציפיים. כאשר בונה מבוססת DNA משמשת בהקשר של השיפורים המשמעותיים במערכת Gal4-כטב"מ לרמות ביטוי transgene הם נצפו ^26,27. במערכת ביטוי bipartite זה, אלמנטים האמרגן תא ספציפי מסוג לנהוג הביטוי של Gal4 activator תעתיק, בעוד גנים הכתב הם משובטים במורד הזרם של רצף הפעלת Gal4 מחייב במעלה הזרם (כטב"מ). על ידי שילוב של כתבים כטב"מ עם נהגי Gal4 מתאימים, ביטוי יכול להיות מוגבל-סוגי תאים מסוימים, לעקוף את הצורך לשבט גני כתב מאחורי יזמים שונים בכל פעם דפוס ביטוי מבוקש הוא רצויה. יתר על כן, הביטוי של גני כתב מספר כטב"מ יכול להיותמונע על ידי מפעיל Gal4 יחיד. מערכת Gal4-כטב"מ ובכך מספקת גישה גנטית צדדית וגמישים תיוג subcellular.

שדה רחב ומיקרוסקופים confocal הם סוסי העבודה של ברוב המעבדות. מערכות-שדה רחב משתמשות בדרך כלל מנורת קשת כמקור אור לזהות את האור הנפלט עם מצלמה רגישה כי הוא מוצב בסוף נתיב האור. שיטת הדמיה זו מוגבלת בדרך כלל כדי דגימות רזה כמו out-of אור המוקד מטשטש מידע הפוקוס בדגימות עבות. מיקרוסקופים confocal שונים ממערכות רחב בתחום בכך שהם בנויים להעדיף אותות שמקורן במישור המוקד על פני אלה שמקורן מחוץ לפוקוס (כלומר, "חתך אופטי") ^28. כדי להשיג חתך אופטי חריר מושם בנתיב פליטה בעמדה המצומד אל מקור האור לנקודה. לייזרים משמשים כמקורות אור אותות מזוהים עם צינורות מכפילים (PMTs). מבחינה מעשית, לייזרקרן הוא סחב על המדגם, נקודה אחר נקודה ואת פליטת הקרינה בכל נקודה (פיקסל) הוא זוהה על ידי PMT.

כאן אנו תמונה זהה מאוד מבנים subcellular לחיות עוברי דג הזברה הן באמצעות שדה רחב מיקרוסקופיה confocal לספק השוואה ישירה של שתי שיטות מיקרוסקופיה. המטרה הבסיסית של מתן השוואות כאלה היא להציע הנחיות לבחירת טכניקת מיקרוסקופיה המתאימה ביותר עבור השאלה ספציפית בהישג היד.

באמצעות הגישות המתוארות כאן אנחנו מדגימים תיוג גנטי המבוסס Gal4-כטב"מ של מיטוכונדריה centrosomes. אברונים אלה הם צילמו ב-תאים מסוגים שונים של מערכת העצבים בתאי השריר באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב ו confocal כדי להדגים את התאמתו של כל שיטת הדמיה. השיטות שתוארו כאן ניתן להתאים בקלות על חקירת אברונים אחרים ומבני subcellular בעובר דג הזברה לחיות.

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לתקנות מקומיות של הממשלה בוואריה העליונה (מינכן, גרמניה).

אברונים תיוג 1. מבנים subcellular אחרים

הערה: כתב גנטי כאן בונה כי centrosomes תג פלורסנטי, מיטוכונדריה קרום תא מתואר.

1. השתמשו בשיטות שיבוט קונבנציונאלי ²⁹ כדי לייצר חלבונים היתוך כי fluorescently לתייג centrosomes ואת המיטוכונדריה. לשכפל את רצף הקידוד של centrin4 דג הזברה (cetn4) בתוך מסגרת עם חלבון פלואורסצנטי ² (FP) כגון חלבון פלואורסצנטי צהוב כדי ליצור cetn4-YFP. Clone רצף מיקוד המיטוכונדריה של למקטע השמיני של מונואמין ציטוכרום C בתוך מסגרת עם FP כגון חלבון פלואורסצנטי ציאן ליצור mitoCFP ^9-11.
2. כדי להגביל ביטוי של חלבונים היתוך (cetn4-YFP או mitoCFP) לתאים ספציפיים של zebrafהעובר ish (למשל נוירונים או תאי שריר) להשתמש במערכת ביטוי Gal4-כטב"מ bipartite ^26,27. ראשית ליצור לבנות כתב כטב"מ. השתמש בשיטות מקובלות לשבט חלבון היתוך וקטור ביטוי כטב"מ, במורד הזרם של קלטת כטב"מ Gal4 המחייבת (הגירסות נעות בין 1x כדי 14x כטב"מ, ראה דיון) ^26,27,30 ו אמרגן מינימאלי (אמרגן הבזליים E1b מן קרפיון βactin גן), וליצור כטב"מ: cetn4-YFP ו כטב"מ: mitoCFP.
   הערה: כדי להכין כתב כטב"מ בונה עבור אלמנטים נוספים קו הדור מהונדס יציבה צריכים להיות משובטים (ראה 3 להלן)
3. כדי להמחיש את הקשר הסלולר שבו centrosomes או המיטוכונדריה מסומן, ליצור כתב כטב"מ בונה שבו קרום תא מסומן על ידי fps. Clone עשרים חומצות אמינו הראשון של דג הזברה Gap43 (המכיל אתרים palmitoylation) בתוך מסגרת עם FP למקד אותו FP על קרום התא (memFP) ^31,32.
4. obtain בונה נהג או קווים מהונדסים שבו תאים מסוג אלמנטי אמרגן ספציפיים לנהוג הביטוי של מפעיל תעתיק Gal4-VP16 ^27, Gal4FF ³³ או KalTA4 ^30.
5. מערבב את כתב כטב"מ בונה עם מבנה מנהל התקן מתאים כדי להגביל ביטוי בתא-סוג הריבית הרצוי (למשל, בנוירונים או תאי שריר). לשם כך שיתוף להזריק נהג Gal4 וכתב כטב"מ בונה בשלב אחד התא של ביציות מופרות (לקבלת הוראות מפורטות ראו סעיף 2 להלן) כדי לייצר להביע דגים זמניים. לחלופין, ליצור קו מהונדס כתב כטב"מ יציב (לקבלת הוראות מפורטות לראות 3 להלן) ולעבור נהג Gal4 קו מהונדס יציב לייצר צאצאי נושאים הוא transgenes.
   הערה: אפשר גם להזריק כטב"מ כתב לבנות / s לביצים מופרות ממנהל התקן Gal4 קו מהונדס יציב או נהג Gal4 לבנות לתוך חומר דשןביצי ed משורת מהונדס כתב כטב"מ יציבה.
6. כדי לשתף להביע חלבוני היתוך ברור מרובים באמצעות מערכת Gal4-כטב"מ, השתמש נהג Gal4 ו כטב"מ כתב / s באחד בתצורות הבאות: מרובה א, בונה כתב כטב"מ נפרד (למשל, כטב"מ: mitoCFP ו כטב"מ: שיתוף memYFP -injected עם מבנה הנהג Gal4) ^10, קלטות כטב"מ מרובים B. על עיתונאי אחד (למשל, כטב"מ: cetn4-YFP, כטב"מ: memCerulean) ¹² ג הכתב דו כיווני כטב"מ (למשל כטב"מ: memYFP, mitoCFP) ^2,10,24 (איור 1).

איור 1. אסטרטגיות לשתף מפורשת חלבוני היתוך באמצעות מערכת Gal4-כטב"מ.
שיתוף ביטוי של חלבוני היתוך מספר ניתן להשיג באמצעות קלטות כתב כטב"מ בתצורות שונות: (א) מספר, const כטב"מ מונחה נפרדructs, (B) קלטות מרובות כטב"מ על אחד לבנות או (ג) קלטת כטב"מ דו-כיוונית על מבנה יחיד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

2. צור זמני הבעת דגים

הערה: להלן הוא עיבוד של פרוטוקולים שפורסמו בעבר ^34,35. התקנת הזרקת בסיסיים צריכה לכלול סטראו עם עד טווח גדלת 12x, על micromanipulator עם בעל micropipette ומקור לחץ אוויר. כן 2.1-2.5 מראש:

1. כדי להכין תאי microinjection ביצה, להכין פתרון של 1.5% (w / v) agarose במים. להוסיף אבקת agarose למים במיקרוגל עד agarose הוא נמס לגמרי. למלא צלחת פטרי (100 x 15 מ"מ) עם הפתרון הזה.
   1. אפשר פתרון agarose להתקרר approximately 45 ^מעלות צלסיוס לפני הצבת עובש microinjection פלסטיק (40 מ"מ x 66 מ"מ, עם 6x 50 מ"מ רכסים ארוך כי הם 1.5 מ"מ רוחב, 1 מ"מ עמוק במרווחים 3 מ"מ) על פני השטח של agarose מותכת, נזהרת שלא להכניס בועות על הממשק.
   2. לאחר סטי agarose, ולאחסן ב 4 ^o CO / N. מוציאים בזהירות את התבנית בעזרת מרית. כן תאי microinjection מרובים בכל פעם, ולאחסן ב 4 ^מעלות צלסיוס ולהשתמש שוב ושוב על פני כמה שבועות.
2. השתמש micropipette חולץ ליצור נימי הזרקת זכוכית עם שוק ארוך ^36.
   הערה: ההגדרות הספציפיות המשמשות ליצירת נימי הזרקה צריכה להיקבע באופן אמפירי. נימי הזרקה יכולות להיות משך זמן סבירים מראש מאוחסנות לפני השימוש.
3. למדוד את הריכוז של DNA פלסמיד (נהג Gal4 ובונה כתב כטב"מ) עבור microinjection באמצעות ספקטרופוטומטר פי הוראות היצרן. לִמְדוֹד60; היחס של ספיגה ב 260 ננומטר ו -280 ננומטר (A260 / 280). לדלל את ה- DNA לריכוז סופי של 100 ng / μl במים nuclease חינם.
   הערה: A260 / 280 יחס של ~ 1.8 מסמל DNA טהור. שקול להשתמש ערכה מסחרית (מבוססת על מטריצה ​​מחייבת מבוסס סיליקה) לטהר את ה- DNA פלסמיד לשמש להזרקה. פלסמיד דנ"א צריך להיות באיכות גבוהה כדי למנוע רעילות.
4. כן 10 μl לערבב זריקה על ידי שילוב ה- DNA (0.5 כדי 2.5 μl של מניית 100 ng / μl ריכוז סופי של 5 עד 20 ng / μl), הפתרון של Danieau (0.33 μl של 30x מלאה), פנול אדום (0.25 μl, מים אופציונליים) ו nuclease ללא בהיקף כולל 10 μl.
   הערה: אמפירי לקבוע את הריכוז של ה- DNA כי תשואות ביטוי הולם. Gal4 נהג פלסמידים כתבו כטב"מ צריכים להיות שותף מוזרק. אין ביטוי ייווצר כאשר רק הנהג Gal4 או פלסמיד הכתב כטב"מ מוזרק לתוך ביציות מופרות wild-type. אם לעומת זאת tהוא מופרה ביצים הן משורת נהג Gal4 אז הזרקה של אחד או כמה פלסמידים כתבו כטב"מ די. לעומת זאת, אם microinjecting לקו כתב כטב"מ, רק הפלסמיד נהג Gal4 צריך להיות מוזרק. לבסוף, בעוד פנול אדום יכול מאוד לעזור כדי להמחיש זריקות, זה גם מתחם פלורסנט עצמה. לכן, פנול אדום עשויים להאפיל על FPS חזותי אם הדמיה מתוכננת לפני 24 שעות לאחר ההפריה (hpf) כפי שהוא לא יכול להיות מדולל מספיק בשלב זה.
5. הערב לפני זריקות מתוכננות, להגדיר כמה זוגות (בדרך כלל 5 עד 10) של זכר ונקבה דג הזברה לרבייה. השתמש טנקי רבייה עם אינסרט המכיל תחתית gridded ו מחיצה נשלפת להפריד הזכר ודגים נשיים.
   הערה: זכר דג הזברה הנקבה ניתן להבחין בדרך כלל על ידי צורת הגוף שלהם. זכרים נוטים להיות רזה בעוד נקבות נוטות להציג בטן בולטת ventrally. זכרים גם נוטים להיות בעלי col צהבהב-אדוםאורינג על אזור הבטן הגחון שלהם.
6. בסמוך לפני זריקות DNA, להסיר את המחיצות כדי לאפשר הזכר והנקבה להזדווג. כ 15 עד 30 דקות לאחר הסרת המחיצה, לבדוק ביצים בתחתית המיכל. מעבירים את הדגים הבוגרים באמצעות-מכמורת על אקווריום רבייה חדשה.
7. יוצקים את המים, המכיל את הביצים המופרות החדש הניח, מתוך אקווריום רבייה לתוך מסננת (למשל, מסננת תה פלסטיק). לשטוף את הביצים המסננות באמצעות בקבוק ספריי המכיל הפתרון של Danieau. הפוך את המסננת על צלחת הפטר ולהשתמש בבקבוק תרסיס עם הפתרון של Danieau לשחזר את כל הביצים (בדרך כלל 50 עד 200 ביצים לכל רביית זוג דגים בוגרים).
8. בעזרת פיפטה microloader, גב למלא נימי הזרקת משך עם תערובת הזרקת DNA. הר נימי זריקה לתוך בעל micromanipulator וקוצצים את הטיפ, תחת שליטה ויזואלית של סטראו, באמצעות מלקחיים כדי ליצור micropipette שיכולים penetrate סיסית ו הציטופלסמה התא בעת היותו מסוגל לספק נפח מתאים של ה- DNA.
   הערה: המידה שבה קצה נימי הזרקת חיתוך צריך להיקבע באופן אמפירי ויכול טובים להישפט כאשר הזרקת ביצים.
9. כדי לקבוע את עוצמת הקול של DNA להזרקה, פרוק טיפת פתרון הזריקה לתוך שמן מינרלים. מדוד את רדיוס (r) של ירידה באמצעות מיקרומטר כיול ולחשב נפחו (4/3 π r ^3). לווסת את עוצמת הקול על ידי התאמת לחץ ההזרקה ו / או המשך כל פולס הזרקה.
10. בעזרת פיפטה פלסטיק, להעביר את כל הביצים שנאספו (בדרך כלל 50-200, לעומת 2.7 לעיל) לתוך התעלות של תא microinjection. תחת שליטה ויזואלית של סטראו, להשתמש במלקחיים כדי לכוון את הביצים כך הציטופלסמה תא (שקוף) וחלמון (צפוף, שאינו שקוף) ניתן לזהות בקלות.
11. תחת שליטה ויזואלית של מערכת סטריאומיקרוסקופ, להזריק DNA לתוך הציטופלסמה התא של הביצית המופרית, מקפיד להבטיח כי הנפח המוזרק (1 עד 2 nl) מתאים לכ -10% מנפח התא.
    הערה: פנול אדום עזרי פתרון ה- DNA ב להדמיה של הנפח המוזרק.
12. לאחר הזרקה, לשחרר את הביצים מן התעלות של עובש ההזרקה ידי שטיפה אותם עם בקבוק ספריי המכיל הפתרון של Danieau. בהמשך להעביר ביצים לתוך צלחת פטרי טרי בעזרת פיפטה העברת פלסטיק ולשמור בתוך חממה 28.5 ^מעלות צלסיוס.
13. שמור ביצים מוזרק un כפקדים כדי לקבוע אם זריקות לתרום שיעורי תמותה גבוהים, בין כתוצאה של נזק פיזי שנגרמו במהלך החדירה micropipette או תמהיל DNA.
    הערה: זריקות שיעורי תמותה גבוהים שלהלן יכולות לנבוע מגורמים רבים, כולל כרכים ריכוז או הזרקת DNA גבוה יתר על המידה ו / או פלסמידים עם contaminants. כדי למנוע רעילות מן preps DNA באיכות נמוכה, ערכות מסחריות (מבוססות על מטריצה ​​מחייבת מבוסס סיליקה) יכולות לשמש.
14. במרווחי זמן קבועים מקבל זריקה, השתמש סטראו למסך ביצים מופרות ועובר מתים או פגום וזורקים אלה.
    הערה: רואים את הביצים שנראים בשלב אחד התא כמה שעות לאחר ההפריה, כמו מופרית. לזהות עוברים פגומים בשל פגמים אנטומיים ברוטו כגון צירי גוף קדמיים-אחורי נפגעים. חומר אמורפי בתוך סיסי עולה כי העובר לא להמשיך דרך שלבים התפתחותיים ומת. כדי לברר אם עוברים שהיו microinjected לעבור קורס רגיל של פיתוח להתייעץ אטלסים אנטומיים ^37.
15. מעבירים את העוברים באמצעות פיפטה העברת פלסטיק לפתרון של Danieau המכיל 1x 1-פניל 2-thiourea (1xPTU) בין 10 ל 24 hpf למנוע היווצרות פיגמנט. שמור את עוברי משך הפתרון של Danieauaining PTU עבור תקופת הניסוי.
    הערה: בנוסף melanophores, iridophores על פני השטח של העור יכול להיות בעייתי עבור הדמיה. בעוד PTU לא לעכב היווצרות iridophore, קווים מוטנטים עם מספרים מופחתים של iridophores כגון רוי אורביסון (רועים) קיימים והוא יכול לשמש ^38.
16. לאחר הצוהר עוברי (בדרך כלל ביום השני או השלישי לאחר ההפריה, 2 או 3 DPF), לבטל את chorions ולהחליף הפתרון של Danieau המכיל PTU.
    הערה: צעדים אלה חשובים כדי להבטיח את האיכות של המדיום העובר ואת הכדאיות של העוברים הבריאים.

3. צורו קווים מהונדסים יציבים

הערה: אורוות קווים מהונדסים יכולים להיות שנוצרו תוך שימוש יעיל במערכת transposon Tol2. וקטור transposon Tol2 המכיל את הגן של עניין הוא שיתוף הזריק יחד עם mRNA המקודד את האנזים transposase לתוך להפרותביצי ד בשלב אחד התא. חלבון Transposase נגזר mRNA המוזרק מזרז את הכריתה של קלטת transgene מן הווקטור transposon ושילובו הגנום ^39.

1. Clone קלטת כתב transgene (למשל, כטב"מ: mitoCFP) בין Tol2 הפוך חוזר מסוף באחד וקטורי Tol2 המשמשים כיום קהילת דג הזברה כמתוארת ^40.
   הערה: וקטורי Tol2 המכילים קלטת לבחירה בו אלמנטי אמרגן לנהוג ביטוי FP במערכות איבר קשורים לאזור של עניין (למשל, ⁴¹ לב או ⁴² עדשה) שימושיים לסינון כטב"מ כתב קווים מהונדסים בהעדר transactivation Gal4.
2. באמצעות ערכה מסחרית (מבוססת על מטריצה ​​מחייבת מבוסס סיליקה), לטהר את ה- DNA פלסמיד לשמש להזרקה. ודא כי ה- DNA פלסמיד הוא באיכות גבוהה כדי למנוע רעילות.
3. לתמלל Tol2 mRNA קידוד transposase באמצעותוקטור שעתוק מתאים כגון PCS-TP ^43. בקצרה, ליניארי PCS-TP ולהשתמש ערכה מסחרית להפקת mRNA כתרים אחרי הפרוטוקול של היצרן. תשמור על עצמך כדי למנוע זיהום עם RNases (למשל, השתמש טיפי פיפטה RNAse ללא צינורות). Aliquot את הרנ"א, בריכוז של 100 ng / μl, לשימוש יחיד ולאחסן ב -80 ^מעלות צלסיוס
4. בבוקרו של זריקות, להפשיר aliquot של mRNA transposase על הקרח. מערבבים את וקטור DNA transposon (2 μl של 100 ng / μl) ו transposase mRNA (2 μl של 100 ng / μl) ביחס של 1: 1, ולהוסיף 6 μl של RNase ללא מים להביא את הנפח הכולל עד 10μl.
   הערה: ריכוז של 20 ng / μl מומלץ לכל אך הריכוז האופטימלי צריך להיקבע באופן אמפירי. השתמש במים RNAse ללא דילול. יש להשתמש בכפפות בעת טיפול תמהיל הזרקת DNA-RNA ולשמור אותו על קרח למשך כל תקופת זריקות כדי למנוע השפלה של מ 'RNA.
5. בעזרת ההוראות המפורטות בסעיף 2 לעיל, להזריק תמהיל הזרקת DNA-RNA לביצים מופרות בשלב אחד התא. תחת שליטה ויזואלית של סטראו למקד הציטופלסמה התא בשלב-תא אחד השיעורים הגבוהים ביותר של יעילות transgenesis. שמור את העוברים מוזרק על 28.5 ^מעלות צלסיוס עד מוכן למסך ביטוי transgene.
   הערה: PCR ניתן לעשות כדי לבדוק את היעילות של transposase Tol2 כפי שתואר לעיל ^44.
6. עוברים מסך בצלחת פטרי עבור transgenesis באמצעות oculars של מיקרוסקופ לנתח פלואורסצנטי.
   הערה: השתמש הסינונים המתאימים של המיקרוסקופ לדמיין ביטוי FP של הקלטת לבחירה (כלומר, קרינה בלב או העדשה) בשעה 2 או 3 DPF. לזהות פוטנציאל עוברים מהונדס ידי ביטוי (בלב או עדשה) ולהעלות עוברים אלה לבגרות (F ₀ דור) רגיל באמצעותפרוטוקולים ^45. לחלופין, לזהות עוברים פוטנציאליים מהונדסים ידי PCR כמתואר ^46.
7. לאחר F ₀ דגים הכתב כטב"מ הם 2.5 - 3 חודשים של גיל, לחצות אותם (ראה 2.5 לפרטים נוספים) לבעלי זכויות שאינן מקנות מהונדס דגים wild-type לרכוש ביצים להקים דור F _1. לחלופין, לחצות את הדגים כטב"מ הכתב F ₀ עד קו הנהג Gal4 להקים דור F _1. במקרה האחרון, את הגן מונחה כטב"מ ניתן לנטר ישירות את העוברים שהתקבלו מהצלב.
8. שימוש במיקרוסקופ לנתח קרינה להקרין F ₁ עובר לביטוי של transgene או קלטת לבחירה.
   הערה: כאשר הביטוי הוא אישר אז את הגן ניתן לומר להיות משודר germline. Transgenesis הוא הלא-מנדל בשלב F _0. מספר עוברי המבטא את transgene עשוי להשתנות ממספר קטן על הרוב המכריע ב clutche הפרטים. אינטגרצית transposon בדגים שונים F ₀ עשויה להשתנות במידה רבה, וכתוצאה מכך דפוסי ביטוי שונים. לכן לשמור דגים F ₁ מ המייסדים שונים F ₀ כפי תתי ענפים נפרדים. ואינטגרציות transposon בדגים F ₁ יציבים והם עברו על הדורות הבאים בצורה מנדל.
9. לשמור על כל דג F ₀ במיכלים נפרדים מחדש לזהות נשאי transgene.

4. כן עוברים הדמיה על מיקרוסקופ זקוף

הערה: ההליכים המתוארים כאן ממוטבים עבור הדמיה על מיקרוסקופים זקופים עם מטרות למרחקים ארוכה-עבודה-מי טבילה-קונוס.

1. שימוש במיקרוסקופ לנתח קרינה להקרין עובר לביטוי transgene.
   הערה: ביטוי של transgene כתב כטב"מ יהיה תלוי על קו הנהג הספציפי Gal4 בשימוש. עובר בחר לניסויי הדמיה המבוססת על exp הרצוידפוס ression.
2. מעבירים את העוברים שנבחרו בעזרת פיפטה פלסטיק כדי בצלחת פטרי נפרד המכיל מאגר של Danieau עם 1x PTU ו 1x Tricaine.
   הערה: כאשר התיוג דליל (רק כמה תאים במערכת איבר) לעלות את עוברי agarose (ראה 4.3 - 4.7 להלן) ומסך לביטוי transgene באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב עם מטרות בהגדלה גבוהות (ראה 5.1 להלן). Tricaine מרדים את הדג צריך להיות יעיל בתוך שניות. אם דגים לא משותקים סביר להניח כי Tricaine יש מושפל. סיבות אפשריות שפלה כוללות שמירת עניים של Tricaine, המהווה ⁴⁷ הרגישים לאור.
3. הכן את agarose להטביע את הדג על ידי המסת אבקת agarose התכה נמוכה במאגר של Danieau לריכוז סופי של 0.7%. Aliquot (1 מ"ל) ולשמור בתוך גוש חום 40 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.
   הערה: גבוהים תרכיזיםיונים של agarose (upto 1.5%) יכול לשמש גם כדי להטביע דג.
4. הוסף 50 μl של המניה 20x של Tricaine ו -20 μl של פתרון המניות 50x של PTU אל aliquot 1 מ"ל של נמוכה ההיתוך agarose ומערבבים היטב על ידי הקשה על הצד של הצינור. החזר את הצינור כדי לחסום חום. בעזרת פיפטה העברת פלסטיק, פיפטה בעדינות כמה (1-10) עוברים הרדים לתוך agarose, העברת נוזלי מעט ככל האפשר, כדי למנוע דילול agarose.
5. באמצעות העברת פיפטה פלסטיק כל העוברים עם כמות קטנה של agarose כדי בצלחת פטרי תחתית הכוס.
6. עבודה יחסית מהר, להשתמש במלקחיים כדי למקם את העוברים בכיוון הרצוי, בהתאם למבנה להיות צלם.
   הערה: עוברים אוריינט בצד שלהם אם הרשתית או Rohon-בירד (RB) עצב סנסורי צריך להיות צילמו.
7. אפשר agarose כדי לחזק במשך 15 דקות לפחות. הוסף חוצץ של Danieau המכיל 1xPTU ו 1xTricaine לכסות את העוברים מוטבע agarose. מניח את הצלחת המכילה עובר מוטבע agarose באינקובטור ב 28.5 ^מעלות צלסיוס עד מוכן תמונה.

5. הדמיה סלולר מבנים subcellular באמצעות שדה רחב או מיקרוסקופיה confocal

הערה: רחב בתחום מיקרוסקופיה מיקרוסקופיה confocal נקודת-סריקה הם שיטות בשימוש נרחב ביותר כדי עוברי דג הזברה תמונה שכותרתו fluorescently טבלה 1 מסכמת את היתרונות והחסרונות העיקריים של שתי המערכות.. עבור שתי צורות של מיקרוסקופיה, עוברים הם רכובים agarose כמתואר 4 לעיל, ומתוחזק על 28.5 ^מעלות צלסיוס לאורך הניסוי הדמיה באמצעות תא חימום על הבמה של המיקרוסקופ. חשוב לציין, את המנה עם עוברי-מוטבע agarose מותר לאזן ל -28.5 ^מעלות צלסיוס לפני הדמיה מתחילה כמו תנודות הטמפרטורה לגרום להיסחף-מימד z. כאשר ניסויי הדמיה לטווח ארוך (מעל severaשעות l), למקם כיסוי פרספקס מעל צלחת פטרי כדי להפחית את אידוי של למאגר.

לוח 1. השוואה כללית של שדה רחב מיקרוסקופיה confocal סריקת נקודות

1. מיקרוסקופיה רחב בתחום
   הערה: הנחיות כאן מסופקות הדמיה עוברי דג זברה באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב זקוף עם מטרות למרחקים ארוכה-עבודה-מי טבילה-קונוס. המיקרוסקופ מצויד במצלמת CCD מקוררת, וערכות מסננות המאפשר הדמית fluorophores השונה רכובות על גלגל לסנן אוטומטי לרכישה מהירה של מספר רב של ערוצים.תמונה הרכישה נשלטת על ידי μManager, חבילת תוכנות קוד פתוח מיקרוסקופיה ^48. דוגמה ספציפית עבור הדמיה המיטוכונדריה עצב סנסורי RB מסופק. תאי RB מסומנים גנטיים באמצעות הקרום הממוקד YFP ואת המיטוכונדריה שלהם הן ​​מתויג CFP (ראה סעיף 1.1 לעיל).
   1. עוברים הר בצד שלהם-התכה נמוכה agarose כמתואר 4 לעיל.
   2. אפשר את המנה עם דג רכוב לאזן ל -28.5 ^o צלזיוס בתא חימום על הבמה של המיקרוסקופ לפני תחילת ההדמיה.
   3. השתמש אובייקטיבי מי הטבילה-קונוס בהגדלה נמוכה ולחפש דרך oculars של מיקרוסקופ כדי לבחור אזור על פני השטח של העובר לתמונה.
      הערה: אם קו הכתב המהונדס MitoFish היציב, Tg (כטב"מ-E1b: mYFP, mitoCFP) ^mde6, משמש יחד עם קו נהג כגון איק: Gal4 אז רוב הנוירונים RB מסומנים, ומופיעים בתור mes צפופהh-העבודה של סוכות neurite על פני השטח של העובר. אם microinjection של בונה DNA משמש להשגת תיוג דלילה (למשל, חושי: Gal4-VP16 עם כטב"מ: mitoCFP ו כטב"מ: MA-YFP), עוברים מסך לזהות תאים פעמיים שכותרתו.
   4. פתח את תוכנת מיקרוסקופ (1.4 μManager) ולחץ על "הארה '' תחת" הגדרות תצורה "כדי להגדיר את מערכות הסינון הנכון עבור אורך הגל של עניין (YFP או CFP עבור הדוגמה הנוכחית). בקטע" הגדרות מצלמה "להיכנס זמן החשיפה נדרש לרכוש תמונה מתאימה.
      הערה: "הגדרות התאורה" הוא שנקבע מראש על ידי המשתמש עם התקנה של התוכנה, והוא טעון בעת פתיחת μManager. אם התוכנה אינה מוגדרת לשלוט הגלגל לסנן, באופן ידני להעביר את הגלגל לסנן בצריח למיקום המתאים.
   5. מעבר אל מטרה למרחקים ארוכה-עבודה-מי הטבילה-קונוס החל ההגדלה 40-100x. בחראת המטרה שלשמה יש את הצמצם המספרי הגבוה ביותר (NA), והוא תיקן chromatically (Apochromat).
   6. לחץ על "לחיות" כדי לבחור את שדה הראייה: במקרה של הנוירון RB, תחבורת המיטוכונדריה תמונה בחלק האקסון הגזע, בוקע מגוף התא, או סוכת הפריפריה.
      הערה: הסוכות ההיקפיות של נוירונים RB בקפל סנפיר הזנב של העובר לספק הזדמנות פז תמונת שדה גדול של השקפה כי הוא שטוח, ועל כן ניתן שנתפס על מסגרת אחת עם מיקרוסקופ שדה רחב. לכן חשוב לעגן את העובר כפי ביובש ככל האפשר על צידו, כך לקפל סנפיר הזנב מקביל התחתון של צלחת פטרי.
   7. לאחר בחירת שדה הראייה, לחץ על כפתור "בחירה מלבנית" בתפריט ImageJ, להגדיר אזור של עניין (ROI) ולחץ על "החזר על השקעה" בחלון μManager. לאחר בחירת ההחזר על ההשקעה עבור הדמיה, לחץ על "עצור" ו "שמור" כדי take תמונה של ערוץ YFP להקליט את המורפולוגיה המקומית של neurite / s.
   8. לתחבורת תמונת המיטוכונדריה לחץ על "ACQ Multi-D." לַחְצָן. שים חלון נוסף ( "רכישה רבה ממדים") ובחר את מספר נקודות זמן, כמו גם את המרווח בין נקודות זמן על חלון זה. השתמש מסגרת חליפין של 0.3-1 הרץ. לבצע הקלטות במשך 10 דקות לפחות כדי לאסוף כמה שיותר נתוני נקודות ככל האפשר.
   9. בחלון "רב-ממדי הרכישה", לחץ על "ערוצים", להוסיף ולהגדיר את אורך הגל הדמיה (CFP עבור המיטוכונדריה בדוגמה זו) ואת הזמן של החשיפה. שמור פעמי חשיפה מתחת 400 msec הדמית תחבורת המיטוכונדריה.
   10. לחץ על האפשרות "שמור תמונות" בחלון "רב-ממדי הרכישה", לשמור את הקבצים באופן אוטומטי בתיקייה מסוימת שהותוו 'שורש Directory'. לחץ על "לרכוש" בפינה הימנית העליונה כדי להתחיל timהדמית דואר לשגות.
   11. באופן ידני מחדש את המיקוד בעת ההקלטה זמן לשגות כדי לפצות על כל להיסחף בממד z.
       הערה: שימוש בפרמטרים אלה תחבורה המיטוכונדריה בנוירונים RB ניתן הדמיה עבור כל עוד 4 שעות.
2. מיקרוסקופיה confocal
   הערה: הנחיות כאן מסופקות הדמיה עם מיקרוסקופ confocal אולימפוס FV1000 זקוף ויעדים למרחקים ארוך-עבודה-מי הטבילה-קונוס. המיקרוסקופ מצויד עם קווי ליזר מרובים וכמה גלאים (PMTs הקונבנציונלי גלאי זרח גליום ארסניד רגיש יותר) המאפשרים הדמיה רבה. התייחסות ספציפית נעשית לתוכנת אולימפוס Fluoview. עם זאת, את פרמטרי ההדמיה המתוארים כאן צריכים להיות להעברה בקלות למערכות confocal אחרות.
   1. עובר הר-התכה נמוכה agarose ב אורינטציה מתאימה למבנה האיבר / להיות צלם, כמתואר 4 לעיל.
   2. אפשר את המנה עם דג רכוב לאזן ל -28.5 ^o צלזיוס בתא חימום על הבמה של המיקרוסקופ לפני תחילת ההדמיה.
   3. השתמש מטרות למרחקים ארוכה-עבודה-מי טבילה-חרוטות עבור מיקרוסקופי confocal בתצורת זקוף. בחר יעדים עם הגבוהה ביותר האפשרית NA כדי למקסם את כמות אותות ניאון שניתן לגבות ויש להם את הכוח בפתרון הטוב ביותר. כאשר תמונות איסוף מערוצים מרובים לבחור מטרות תיקן chromatically (Apochromat).
   4. פתח את תוכנת מיקרוסקופ ולחץ על "מנורת טרנס" או "מנורת Epi" להשתמש באחת אור מועבר או קרינת בהתאמה לזהות את האזור של עניין באמצעות oculars של המיקרוסקופ.
   5. השתמש בתוכנה כדי להגדיר את הפרמטרים הבאים סריקה לרכוש ערימות התמונה:
      1. בחלון "גדרות רכישה" לאמת כי המטרה שנבחרה הדמיה תואמת את המטרה המופיעה על הירידה-דאהתפריט n מטרות זמינות.
         הערה: זו היא להבטיח כי כל פרמטרים מראש שחושבים מטרה מסוימת (למשל, לרוחב ורזולוציה צירית, גודל וכו צמצם confocal) להתייחס וניתן להשתמש בו באופן מהימן.
      2. בחר את מסנני dichroic לייזר קו / s ולאחר עירור ופליטה מתאים חלבון פלואורסצנטי ספציפיים לתמונות (ים). עושים זאת על ידי לחיצה על כפתור "רשימת דיי" בחלון "תמונה בקרת הרכישה" ולבחור את fluorophore / s המתאים. לחלופין, לחץ על הכפתור "נתיב אור וצבעים" כדי להגדיר את הפרמטרים הללו באופן ידני.
         הערה: כאשר "רשימת דיי" אפשרות לחצן נבחרה, התוכנה בוחרת באופן אוטומטי את קווי ליזר המתאים, עירור ופליטה מסננת dichroic מתאימה את גודל צמצם confocal כראוי.
      3. בחלון "רכישת הגדרה", להתאים את הגורם "זום" ו "אפעה גודליחס ect "(כלומר, 512x512, 1024x1024 וכו ') של התמונה הסרוקה לקבלת המידה פיקסל הצורך הטוב ביותר לפתור את המבנים להיות הדמיה. הגדרת גודל פיקסל להיות כמחצית ברזולוציה התיאורטית של המטרה, ובכך באים קריטריוני דגימת נייקוויסט . כדי לקבוע את גודל פיקסל של קליק התמונה הנרכשת על הכפתור עם הסמל לקבלת מידע ( "אני") ב "שליטת רכישת תמונה" החלון.
      4. הגדרת מהירות הסריקה אפשרי (2 מיקרו-שניות / פיקסל) המהיר בחלון "הגדרות הרכישה".
      5. בשינה לחץ על "שליטת רכישת תמונה" חלון על מיצוע קו קלמן להפחית גורם noise.A של 2 עד 3 בדרך כלל מספיק.
      6. בחר במצב סריקה סדרתית כאשר הדמית fluorophores עם ספקטרום חופף. לשם כך, לחץ על "סדרתית" ו "קו" בחלון "בקרת רכישת תמונה".
      7. התאם את עוצמת השידור של קו הליזר הרלוונטי / s (בדרך כללמתחת ל -5%). הערכים הספציפיים צריכים להיקבע באופן אמפירי.
      8. לחץ על "XY חזור" או "x2 הפוקוס" או "פוקוס x4" כדי לסרוק את האזור שנבחר באופן רציף תוך התאמת הגדרות גלאים עבור כל ערוץ. התאם "HV", "רווח" ו- "אופסט" לכל ערוץ לרכוש תמונות שיש להם את הטווח הדינמי הגבוה ביותר של ערכים אפורים.
         הערה: ערכים ספציפיים עבור הגדרות אלה צריכים להיקבע באופן אמפירי. "HV" מתאים את המתח על הגלאי כדי לשנות את רגישותה, "קיזוז" מתאים את אות המוצא של הגלאי "רווח" מכפיל את אות המוצא של הגלאי על ידי גורם קבוע.
      9. קש Ctrl + H כדי להמחיש את התמונות רכשו באמצעות שולחן נראה- up (חייל) שמזהה תחת הרווי (נראה כחול) ולמעלה מ-רווי פיקסלים (להופיע אדום), אשר שניהם יש להימנע באופן כללי. להעריך מחדש את עוצמת השידור של הליזר הרלוונטי ליןדואר / s ואת הגדרות גלאי.
         הערה: שימוש כוח ליזר גבוה ורמות גבוהות של "HV" של הגלאי תוביל אות יותר. גבוהה כוח הליזר עם זאת יוביל הלבנה מוגברת רעילות צילום. הגדלת "HV" תוביל רעש מוגבר. לכן, פשרה צריך למצוא בעת הגדרת כוח לייזר "HV" לרכוש תמונות עם רמות מקובלות של רעש תוך מניעת נזק התמונה (ראה גם לוח 1).
      10. איסוף תמונות מתוך נפח מוגדר על ידי התמקדות הגבולות העליונים והתחתונים של שטח של עניין. בשינה לחץ על "גדרות רכישה" חלון על כפתורי סט "Set End" ו "Set התחל" של חלון Z- מחסנית את הגבולות העליונים ותחתונים של הנפח להיות צלם. בחר גודל צעד כי הוא מחצית ברזולוצית z עבור היעד הנתון (למשל., אם ברזולוצית z היא 2 מיקרומטר לבחור 1 מיקרומטר). כדי לקבוע את z ברזולוציה של objectivדואר לחץ על הכפתור עם סמל לקבלת מידע ( "אני") בחלון "Image Acquisition שליטה".
      11. הגדרת סדרה עתית לאסוף ערימות z בתדר זמני שמתאים את הדינמיקה של מבנה subcellular להיות ההדמיה. בתת-החלון "TimeScan" הזנת התדר שבו Z- ערימות צריכות להירכש ( "מרווח" ') ואת מספר פעמי תמונות צריכות להירכש ( "Num").
      12. הקש על "העומק" ו "זמן" כפתורים בחלון "תמונת בקרת רכישה" על מנת לאשר כי Z- מחסנית זמן סדרה תירכש. לבסוף לחץ על הכפתור "XYZT" כדי להתחיל רכישת תמונות זמן לשגות.
      13. לאחר השלמת הרכישה של התמונה, להתבונן "סדרה בוצע" על ממשק התוכנה. לחץ עליו בכדי לשמור את התמונות בפורמט "oib" כדי להקליט את התמונות metadata הקשורים בהם.
          הערה: תמונות מתקבלות עלמיקרוסקופ שדה רחב מיקרוסקופ confocal ניתן דמיינו ונותחו באמצעות תוכנה כגון פיג'י, תוכנית עיבוד תמונה לרשות הציבור ללא תשלום.

כאן השימוש רחב בתחום מיקרוסקופיה confocal למיטוכונדריה תמונה centrosomes לחיות עוברי דג הזברה מושווה באופן ישיר בניגוד. בהתאם למיקום של התאים בהם הדינמיקה אברון ייבחנו ואת תדירות הטבועה של אירועים subcellular ספציפיים, בדרך כלל גם רחב בתחום או confocal הוא בחירה טובה יותר. אנחנו צלמנו אברונים בנוירונים RB ממוקמים על פני השטח של העובר בתאי רשתית הממוקם עמוק. המיקום שטחית של נוירונים RB יחד עם גיאומטריה דו-ממדי שלהם להפוך אותם מועמדים טובים להיות הדמיה ידי שני רחב בתחום מיקרוסקופיה confocal (איור 2). תמונות הרוכשת באמצעות מיקרוסקופ confocal עם זאת איטיות באופן משמעותי ויכולות להוביל הערכה נמוכה מדי של הדינמיקה של אירועי subcellular ספציפיים (כגון תנועת המיטוכונדריה, איור 2C, D ). תמונות של תאים ברשתית נרכשו על ידי מיקרוסקופ שדה רחב סובלות בניגוד עניים כמו אותות קרינה מהיקף גבוה של רקמה מטשטשים פרט במישור המוקד. הנה, את יכולת חתך האופטית של תוצאות מיקרוסקופיה confocal בניגוד משופר באופן ניכר (איור 3).

כדי לאפשר הדמיה בו זמנית של אברונים ממברנות התאים השתמשנו במערכת Gal4-כטב"מ בשלוש תצורות שונות. ראשית, קו הכתב כטב"מ MitoFish Tg (כטב"מ-E1b: mYFP, mitoCFP) ^mde6 היה בשימוש. הנה, כטב"מ דו-כיווני מאפשר ביטוי קשור של CFP mitochondrially וממוקד קרום הממוקד YFP. בשילוב עם קווי הנהג Gal4 המתאים, MitoFish לתייג את ממברנות המיטוכונדריה של התא של עצב סנסורי RB (איור 2 א-ג) או תאים ברשתית (איור 3 א ', ב') עם CFP ו YFP r espectively. שנית, שני כטב"מ הבונה (כטב"מ: mitoCFP ו כטב"מ: MA-YFP) אוחדו עם מבנה נהג Gal4 (חושי: Gal4-VP16, חושיים אלמנטים משפרים ספציפי נוירון מן גן האיון-1) ⁷ זריקות חולפות. הביטוי פסיפס כי התוצאות בדרך כלל זריקות אלה התיר מעקב של תאים בודדים על פני ימים (איור 2E). גישה שלישית מועסקי השימוש בשתי קלטות כטב"מ, כל נהיגת הביטוי של חלבון היתוך שונה, על מבנה רציף יחיד. אסטרטגיה זו שימשה להפקת CentrinFish Tg (כטב"מ: cetn4-YFP, כטב"מ: MA-Cerulean) ^tum1, שבו שילוב centrin4-YFP תוויות centrosomes ו Cerulean מיועד קרום התא. בשילוב עם קווי נהג ספציפי Gal4 centrosomes ו קרום התא של תאים ברשתית (איור 3 ג, ד) או סיבי השריר (איור 4) מסומנים.

איור 3: השוואה בין-שדה רחב מיקרוסקופיה confocal כדי האברונים תמונה in vivo ברשתית דג הזברה העוברית.
Otx2 אלמנטים האמרגן לנהוג הביטוי של CFP במיטוכונדריה ו YFP קרום התא (A ו- B) או YFP ב centrosomes ו Cerulean קרום התא (C ו- D) ברשתית של 2 DPF עוברי דג הזברה. כדי להשיג דפוס תיוג זה, Otx2: דג מהונדס Gal4 או נחצו כדי MitoFish (A ו- B) or CentrinFish (C ו- D). מטרת Apochromat 40x מי הטבילה-קונוס (NA 0.80) שמשה לרכוש תמונות של אותו האזור בכל רשתית באמצעות שדה רחב (A, C) confocal (B, D) מיקרוסקופיה. ריבועי A ו- B פרט הפגנת אזור של שכבת הגרעין הפנימי, ריבועי ב- C ו- D להראות תא M-שלב. סרגל קנה מידה 20 מיקרומטר. Mitochondrially ממוקד CFP (mitoCFP), YFP ממוקד קרום (MA-YFP), centrin4-YFP (cetn4-YFP), קרום ממוקד Cerulean (MA-Cerulean). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: השוואה בין-שדה רחב microsc confocalעתק כדי centrosomes תמונה in vivo.
סיב שריר בודד עם fluorescently מתויג קרום התא centrosomes (Otx2: Gal4; CentrinFish) היה צילמו באמצעות שדה רחב (א) ו confocal מיקרוסקופיה (B). בשני מקרי מטרת Apochromat 40x מי הטבילה-קונוס (NA 0.80) הייתה בשימוש. סרגל קנה מידה 10 מיקרומטר. Centrin4-YFP (cetn4-YFP), קרום ממוקד Cerulean (MA-Cerulean) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הנה, אנחנו מדגימים את הרבגוניות של מערכת ביטוי Gal4-כטב"מ למיטוכונדריה תג פלורסנטי, centrosomes ואת קרום התא של תא-סוגים ספציפיים in vivo עוברי דג הזברה. חלבונים היתוך ניאון רבים כי תווית אברונים אחרים או מבנים subcellular ניתן למצוא בספרות שפורסמו ניתן להשיג מהמעבדה בהתאמה, ממקורות מסחריים או משמורת פלסמיד לא מסחרי (למשל, Addgene). כדי לעצב חלבון היתוך ניאון חדש, מספר פרמטרים צריכים להילקח בחשבון, כולל אשר FP להשתמש והאם למזג את FP בתחנה הסופית אמינו או carboxy של החלבון של עניין. לדיון מעמיק יותר על יצירת חלבונים היתוך ניאון, הקוראים מופנים למאמרים מעמיק על הנושא ^49-51.

אנו מדגישים שלוש אסטרטגיות להשגת שיתוף ביטוי של חלבונים היתוך באמצעות transgenes כטב"מ מונחה. מרובה, בהסרהבונת כתב דואר כטב"מ לאפשר שילוב כתב קיים שונה בונה ללא צורך שיבוט נוסף. רמות הביטוי Reporter יכול גם להיות טיטרציה באופן עצמאי. עם זאת, רמות גבוהות יותר של ביטוי שיתוף מושגות כאשר גם מספר קלטות כטב"מ או קלטת כטב"מ דו-כיוונית על מבנה יחיד משמשות. מאז FPS משמש מתייג אותו הוא יחסית קל לוודא ביטוי שיתוף. יצוין כי שיטות אחרות לביטוי רב cistronic גם קיימות, כוללות השימוש באתרי כניסת ריבוזומלי פנימיים ⁴⁰ ופפטידים 2A ויראלי ^52,53. כחלופה בונה מבוסס DNA, במבחנה עיבד כתרים mRNA ניתן להשתמש בהם כדי להביע חלבונים היתוך ניאון לתייג מבנים subcellular ^1,4,8. האזהרה של גישה זו היא, עם זאת, הביטוי מוגבל בימים הראשונים של פיתוח, והוא לא סלולארי או רקמות ספציפיות. בלי קשר השיטה שנבחרה להביע חלבוני היתוך, זה קריטיכדי להבטיח כי רמות הביטוי אינן מובילות תיוג הלא ספציפית להתפשר את המצב הפיזיולוגי של התאים. בהקשר זה, הגברה של ביטוי גנים הכתב הטמונות במערכת Gal4-כטב"מ ²⁷ יכול להיות בעייתי, מפגין למשל כמו תיוג cytosolic גם כאשר FP מיועד אברון ספציפי. תאריך כניסה, נוגדנים יש להשתמש כדי לוודא כי דפוסי הביטוי מתקבלים על ידי חלבוני היתוך משקפים את המצב אנדוגני. בחלק ממקרים, הזרקה של ריכוזי DNA נמוכים (ER) יכולה להפחית את הבעיה של לוקליזציה mis של חלבון ההיתוך. לחלופין, וקטורים עם מספר נמוך של חזרות כטב"מ יכולים לעזור כדי לכייל את רמות ביטוי transgene ^30. באופן דומה, עבור מפעיל Gal4-VP16, גרסאות מותאמות להתקיים, המדווחים לנהוג ביטוי יחסית חלש ולכן הם פחות רעילים ^30,33. אם אי-לוקליזציה של חלבון ההיתוך נמשכת למרות מאמצים כדי לכייל דאוn רמות ביטוי transgene, ייתכן שיהיה צורך לוותר על מערכת Gal4-כטב"מ ולנסוע ביטוי על ידי גורמים האמרגן ישירות.

הקווים המהונדסים היציבים, MitoFish ¹⁰ ו CentrinFish ^12, אנו מתארים בכתב היד הזה נעשה באמצעות קלטות 14xUAS. אנו שומרים על השורות האלה ברקע של קווי נהג Gal4 כדי לזהות שינויים בביטוי במשך דורות, מאז קווי כתב עם חזרות כטב"מ מרובות דווחו להיות מועדי השתקת ^54. לא ראינו עדות השתקה במהלך 3 דורות לנו הפיצה את CentrinFish. עם זאת ראינו ביטוי ססגוני ב MitoFish ולכן מקפיד לבחור עובר עם "מלאות", רמות חזקות ביטוי להפיץ לדורות הבאים. הספרות הנוכחית מצביעה על כך וקטורי ביטוי עם חזרות 5xUAS יכולים להוות אלטרנטיבה להפקה קווים מהונדסים יציבים - הכתב הואמונע לרמות גבוהות מספיק ³⁰ והמספר הנמוך היחסי של כטב"מ חוזר יכול לעשות את זה נוטה פחות השתקת transgene, למרות חוזר כטב"מ שאינם חוזרים דיווחים אפילו פחות ⁵⁴ רגישים.

פלטת הצבעים של FPS העומדים כיום לרשות אברונים תג או מבנים subcellular אחרים הוא מאוד רחב ^55. בעת בחירת מסוים FP כתווית, התמורה צריכה להינתן הפרמטרים הבאים: ראשית, עירור ופליטה ספקטרה של FP לקבוע קו לייזר ספציפי כמו גם מסננים עירור ופליטה נדרש להדמיה שלה. שנית, את בהירות יציבות תמונה של FP. שלישית, המהירות שבה FP מתבגר התרגום הבא. יש רביעית, אם FP נטייה המצרפי התכה. לגבי הפרמטר האחרון, טיפול צריך להיות למימוש וניסויי בקרה צריכים להיעשות על מנת לבחון את התאמתו של כל FP לניסויים ספציפיים. לדוגמה, בעוד מחדשד FPS mCherry ו DsRed נמצאים בשימוש נרחב, הם הדיווחים ליצור אגרגטים ב בשילובים מסוימים ^56. מצאנו TagRFP-T ^57, וריאנט צילום יציב יותר של TagRFP, להפגין ביצועים טובים כאשר ממוקד מיטוכונדריה ממברנות הסלולר (תצפיות לא פורסמו). כאשר אברונים מרובים צריכים להיות דמיינו בו זמנית, FPS עם ספקטרום שאינו חופף אמורים לשמש. השתמשנו שילובים בהצלחה של ציאן FPS (CFP ו Cerulean) ו YFP (איורים 2-4). באמצעות ניצול בטווח הספקטרום כולו מכחול אדום קרוב, אפשר להרחיב מאוד את מספר מבני subcellular שניתן במקביל דמיינו ^2. בנוסף FPS הקונבנציונלי, FPS-activatable צילום שימושי במיוחד לחקור דינמיקת אברון, למשל, את השימוש של קאאד FP לעקוב אחר גורלו של המיטוכונדריה פרט ^58.

איזו טכניקה מיקרוסקופיה - שדה רחב או confocal - זה הכימתאים הדמיה תלוי במספר גורמים, כולל המיקום של התאים להיות צילמו ואת המהירות שבה אירועים subcellular או תאיים ספציפיים צפויים להתרחש. מיקרוסקופיה רחב בתחום הוא באופנות המועדפת במקומות שטחיים דגימות שכותרתו בדלילות. הוא מציע צילום רעיל והדמיה נמוכות במהירות גבוהה במחיר סביר. עם זאת, אם הדמיה לבצעו בחלקים הלא שטחיים של דג הזברה, בדגימות בצפיפות שכותרתו או לצבור מידע תלת-ממדי, confocal או צורה אחרת של מיקרוסקופיה חתך האופטית הופך את שיטת הבחירה.

בלי קשר אשר המבנה התאי או subcellular נמצא במעקב, על פי רוב קיים trade-off בין רכישת התמונה הטובה ביותר האפשרית ושמירה המדגם בחיים ובמצב פיזיולוגיים טוב הדמיה זמן לשגות חזר. תמונה רעילה יכול להתגשם כמו שינויים בהתנהגות של אברונים, מורפולוגיה סוטה של ​​תאים או אפילו תאמוות. מפתח לצמצום הלבנת תמונה רעיל צילום במיקרוסקופ שדה רחב ו confocal הוא הוא להשתמש רמות המחיר הנמוכות ביותר האפשריות של אור לרכוש תמונות. בהקשר זה, מטרות עם הגבוהה ביותר האפשרי NA הן מפתח למקסם את כמות אות ניאון שניתן לגבות. עבור מיקרוסקופיה confocal, מספר פרמטרים יכול להיות מותאם כדי לפצות על השימוש כוח לייזר נמוך. גלאי עם יעילות קוונטית גבוהה לעומת PMTs קונבנציונאלי, למשל, גלאי זרחת גליום ארסניד, שניתן להשתמש בהם כדי להבטיח כי הפוטונים הנפלטים סיכויים טובים יותר כדי להתגלות. לחלופין או בנוסף, מתח dynode גבוה יכול להיות מיושם ב PMT כדי להגדיל את הרגישות של הגלאי. הצמצם confocal (חריר) ניתן לפתוח כדי לאפשר גביית אות ניאון יותר, אם כי עם הפסד של רזולוציה צירית. כדי לחשוף את הדגימות לאור כמה שפחות, סריקה צריכה להיעשות במהירויות גבוהות כאלה כי להתעכב הזמן שלהלייזר לפיקסל הוא נמוך. סריקה ברזולוציה מרחבית נמוכה יש גם את ההשפעה של הגדלת מהירות הסריקה. יש הדמיה בתדירות נמוכה יותר היתרון הנוסף של חשיפת מדגם פחות אור, אך צריך להיחשב רק אם זה לא להתפשר על דגימה מקיפה של תהליכי חקר.

כחלופה, מיקרוסקופי confocal דיסק מסתובב ומיקרוסקופי confocal מצוידים סורק שנקרא 'תהודה "מציעים את היכולת לסריקה מהירה. יש שני אופנים היתרון כי הם מהירים יותר ופחות מ צילום רעיל 'קלסית', מיקרוסקופי confocal נקודה-סריקה. עם זאת, מיקרוסקופי confocal דיסק מסתובב יותר מצומצמים z ברזולוציה ולא יכולים לחדור עמוק לתוך רקמות כמו מיקרוסקופי confocal נקודה-סריקה. בדומה לכך, היישום של מיקרוסקופי confocal תהודה-סורק יכול להיות מוגבל כפי להתעכב הזמן קצר מאוד פיקסל יוביל איכות תמונה עניה אשר יכולה,בתורו, מונע את איתור אירועי משנה הסלולר (למשל, תמונות בינאריות עם אות ה-רעש מופחת).

לבסוף, תוך הדמיה רחב-שדה confocal מודגשים כאן, וצורות אחרות של מיקרוסקופ האור כגון שני פוטוני ⁵⁹ ו מיקרוסקופ אור גיליון ⁶⁰ עשויות להיות מתאימות יותר עבור שאלות ספציפיות. שני פוטונים מיקרוסקופיה מבוסס על העירור של fluorophore ע"י הקליטה סימולטנית של שני פוטונים בטווח האינפרא האדום של ספקטרום האור. במשותף עם מיקרוסקופיה confocal, היא משתמשת סריקה נקודה לרכוש תמונות מן המדגם ויש לו יכולות חתך אופטיות מכוח אי-ליניאריות של עירור שני פוטונים. השימוש באור באורכי גל ארוכים יותר עבור עירור fluorophore מתיר הדמיה בעומקים כמה מאות מיקרונים מפני השטח. יתר על כן הגבלת העירור לנפח הדמיה קטנה מונעת צילום הלבנת צילום רעיל מחוץ במישור המוקד. עם זאת, לא כל FPיש ים קליטה בחתכים multiphoton גבוהה, בעיה נפוצה במיוחד FPS האדום. יתר על כן, מציאת אורך גל אינפרא אדום יחיד לרגש בו זמנית מספר רב של FPS הברור קשה, מה שהופך הדמית רב ערוצית מסורבלת. במיקרוסקופ אור גיליון משתמשת (עובי הנעים בין 2 ל 10 מיקרומטר בדרך כלל) של אור לייזר כדי להלהיב את המדגם מזהה אותות הקרינה מן המואר הזה מוקדי המטוס 'וכו' דק בזווית אנכית באמצעות מצלמה רגישה. חתך אופטי מושג על-ידי הארת מטוס בודד בכל פעם. הגבלה זו של אור עירור מפחית את המופע של רעילות צילום. מאז אותות קרינה מהמטוס המואר כולו נאספים בו זמנית, רכישת תמונה מהירה יותר באופן משמעותי מאשר confocal סריקת נקודה ומיקרוסקופי multiphoton. כל המאפיינים הללו הופכים מיקרוסקופיה גיליון האור מתאים במיוחד הדמית אירועים הסלולר דינמיים עם רזולוצית spatiotemporal גבוההכמויות גדולות של דגימות חיות. ואכן, גורל התא במיקרוסקופ אור גיליון אלקטרוני בעובר דג הזברה כולו היה במעקב מקיף במהלך הפיתוח 24 שעות של הראשון ^61. עם שיפורי המשך כדי ^62,63 חדירת הדמיה טובה יותר ברזולוציה מרחבית ^64, מתקבל על דעת כי מיקרוסקופ אור הגיליון תועסק לחקור דינמיקה לא רק בסלולרי אלא גם ברמת subcellular עוברי דג זברה כולה.

The authors have nothing to disclose.

P.E. is supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Training Group 1373 and the Graduate School of the Technische Universität München (TUM-GS). G.P. was supported by TUM-GS. L.T. is supported by an EMBO fellowship (EMBO ALTF 108-2013). D.P.'s work on zebrafish was supported by the DFG through the Sonderforschungsbereich "Molecular Mechanisms of Neurodegeneration" (SFB 596); the Center for Integrated Protein Sciences (Munich) and the European Community's Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) under Grant agreement no. 200611 (MEMOSAD). He is currently a New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow and was supported by a fellowship from the German Academy of Sciences Leopoldina. L.G. is supported by funding from the DFG through SFB 870 "Assembly and Function of Neuronal Circuits", Project A11.

We are grateful to Kristina Wullimann for maintaining our fish facility, Yvonne Hufnagel for technical support and Thomas Misgeld for comments on the manuscript. We are grateful to R. Köster (Technische Universität Braunschweig) for providing the M1 Medusa vector (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP) from which we cloned out Centrin-YFP and S.C. Suzuki and T. Yoshimatsu (University of Washington) for providing the 14xUAS:MA-cerulean cassette which we used to generate the reporter construct to make CentrinFish. We further thank S.C. Suzuki and T. Yoshimatsu (University of Washington) for the Otx2:Gal4 transgenic line, A. Sagasti for the Sensory:Gal4-VP16 construct (UCLA) and M. Nonet (Washington University in St. Louis) for the pCold Heart Tol2 vector. We acknowledge Bettina Schmid, Alexander Hruscha and Christian Haass (German Center for Neurodegenerative Diseases Munich - DZNE) for contributing to the development of MitoFish.