Эпителиальные Репопуляции сотовый и подготовка грызунов внеклеточный матрикс строительные леса для почечной ткани развития

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

Этот протокол детали поколение бесклеточной, но Биофункциональные, почечных внеклеточного матрикса (ЕСМ) лесов, которые являются полезными в качестве мелких модельных субстратов для развития органов масштабе ткани. Sprague Dawley почек крыс через канюлю путем вставки катетер в почечную артерию и перфузию серии низкой концентрации детергентов (тритон Х-100 и додецилсульфата натрия (SDS)) в течение 26 ч, чтобы получить нетронутыми, каркасы из цельного почек с интактными perfusable сосудистой, клубочки и почечных канальцев. После decellularization, почечной каркас находится внутри специально разработанный перфузии биореактора и почечной артерии катетер подключен к перфузии цепи, состоящей из: перистальтического насоса; трубки; и дополнительные зонды для рН, растворенного кислорода, и давление. После стерилизации на эшафот с надуксусной кислоты и этанола, и балансирования рН (7,4), подмости почек готовят для посева с помощью перфузии питательной среды в крупэлектронной мощности инкубатор при температуре 37 ° С и 5% СО _2. Сорок миллионов почечных кортикальной трубчатые эпителиальные (РКТО) клетки инъецируют через почечную артерию, и быстро перфузии через помост под высоким потоком (25 мл / мин) и давлении (~ 230 мм рт.ст.) в течение 15 мин до снижения потока физиологического скорости (4 мл / мин). RCTE клетки, прежде всего, заполнить трубчатый ECM нишу в почечной коры, размножаются и образуют трубчатые эпителиальные структуры в течение семи дней перфузии культуры. 44 мкМ раствор ресазурина в культуральной среде перфузии через почки в течение 1 часа при средних обменов, чтобы обеспечить флуорометрического, окислительно-восстановительный основе оценки метаболической жизнеспособности клеток и пролиферации во тубулогенеза. Почек перфузии биореактора позволяет неинвазивным выборку среды для биохимического оценки, и несколько впускные отверстия позволяют альтернативный ретроградной посев через почечную вену или мочеточника. Эти протоколы могут быть использованы для recellularize каркасов в почках сразнообразие типов клеток, в том числе сосудистого эндотелия, трубчатого эпителия и стромальных фибробластов, для быстрой оценки в этой системе.

Как число пациентов, страдающих от терминальной стадии почечной недостаточности продолжает расти, есть тяжелые и нарастающий дефицит в ряде почек донор для трансплантации. Неспособность удовлетворить спрос в постоянно растущего числа кандидатов ждать список для трансплантации почек побудило исследования в почки органов инженерии с конечной целью разработки индивидуальных, имплантируемые трансплантатов почек по требованию ^1,2. Строительство функционирование почек ткани из собственных клеток пациента устранит необходимость пожизненного иммунитета, уменьшения количества времени пациенты тратят на диализе в ожидании пересадки почки, и расширить трансплантации жизненно большему числу пациентов с хронической болезнью почек.

Первый шаг к биоинженерии ткани почек, используя клетки пациента, полученных заключается в разработке эшафот, который служит в качестве субстрата для поддержки почечной паренхимы (например, трубчатые epitheLiaL), стромы фибробластов, и рост клеток сосудов. Биоматериала леса, полученные из природных органов внеклеточного матрикса (ЕСМ) имеют несколько особенностей, которые делают их желательными для использования в тканевой инженерии, в том числе их естественного биологического состава; соответствующий макро- и микроструктура, чтобы наделить физиологическую функцию; и сотовый биосовместимость, содействие клеточную адгезию, миграцию и конструктивный ткани ремоделирования ^3. Перспективным методом для получения каркасов для регенерации тканей почек через decellularization аллогенных или ксеногенных почек, сохраняющих большую часть сложных природных белков состава ECM почек ^4, сохранить присущую архитектурный запутанность органа, и преодолеть трудности, связанные с снизу- до машиностроения толстых тканей cellularized путем предоставления кровоснабжение в развивающихся клеток после лесов recellularization ^5.

Перфузии decellularization это процесс, вкоторые моющие средства, ферменты или другие растворы клеточных разрушающие равномерно подается через сосудистую сеть органа ^6. Эта стратегия была создана в качестве эффективного процесса для получения бесклеточные органов на основе ECM подмости, как трехмерная (3D), биологических шаблонов для целого органа техники ^6-8, о чем свидетельствует развитие бесклеточными почечных шаблонов из выброшенных человеческих почек ⁹ и ксеногенные почки, полученные от большого животного (например свиньи ^10, козьим ¹¹⁾ и источников грызунов ^12. В частности, использование малых животных моделях, таких как грызуны требуется меньше клеток и питательных сред, что особенно полезно для органов recellularization исследований, в которых число клеток, как правило, ограничены, как в случае с клеточными полученных тканей стволовых. Целью описываемого протокола decellularization является создание бесклеточной почечной ЕСМ, который можно использовать в качестве системы 3D лесов для регенерации почек СтруктурES, в том числе нефрона канальцев, которые заполненного в данном примере с человеком почек кортикального трубчатые эпителиальные (РКТО) клеток. Мы ранее описано наше строгую оценку оптимального, моющих средств на основе decellularization почек крыс протокола ^7, который является более быстрым (примерно один день), чем другие методы, ранее сообщалось (Росс и др .- 5 дней ^12, Песня др .- 4,5 дней ^13), и выставляет орган в значительно более низкой концентрации (0,1%) в додецилсульфата денатуранта натрия (ДСН) при decellularization чем предыдущие доклады ^12-15.

Ограниченное число исследований, посвященных использованию грызунов почек для decellularization и последующего использования в качестве 3D эшафот для сотовых заселения (обзор других ^{1) 12-16.} В этом протоколе, мы предоставляем подробное описание нашего установленной ранее, оптимальной стратегии decellularization для производства каркасов бесклеточные почкахот Спрэг Dawley крыс почек ^7. Использование специально разработанных биореакторов, способных перфузии двойного посева и обслуживания перфузии культуры ^17, мы recellularize бесклеточной каркасов в почках с человека RCTE клеток, которые постоянно заселить трубчатый компонент в этих decellularized матриц, размножаются, и выжить в перфузии культуры в течение недели. Кроме того, мы демонстрируем нашу использование ресазурин перфузии анализа - недорогой, не-цитотоксических и неинвазивной оценки метаболической ранее используемой на цитотоксичность изучает ¹⁷ - для индикации жизнеспособности и пролиферации клеток в пределах recellularized почки в течение времени ^7.

ЭТИКА ЗАЯВЛЕНИЕ: Все процедуры с участием животных были проведены в соответствии с руководящими принципами, утвержденными уходу и использованию комитета Институциональная животных Северо-Западного университета в.

1. Почки Decellularization

1. Подготовка decellularization решения. Подготовьте следующие объемы реагентов для каждой почки для decellularized, плюс один дополнительный объем (например, в течение 4 почки, подготовить 5000 мл Triton X-100 для шага 1.1.3.):
   1. Подготовьте 500 мл воды обратного осмоса (ROH ₂ O). Примечание: В качестве альтернативы, деионизированная вода может быть использована в шагах, где ROH ₂ О указанных.
   2. Готовят 1000 мл Тритона Х-100, 1% (об / об) в ROH ₂ O. Медленно добавляют 10 мл Тритона Х-100 в 990 мл воды в большом химическом стакане при быстром перемешивании на мешалке. Разрешить реагент полностью растворить перед использованием (по крайней мере, 10 мин).
   3. Готовят 1000 мл Тритона Х-100, 1% (об / об) в ROH ₂ O (SEPОбъем штрихи,).
   4. Готовят 1000 мл додецилсульфат натрия (SDS), 0,1% (об / об) в ROH ₂ O. Медленно добавить 5 мл SDS (20% акций), чтобы решения 995 мл воды в большом стакане при перемешивании быстро на мешалке. Разрешить реагент смешать равномерно перед использованием (по крайней мере, 10 мин).
   5. Подготовьте 500 мл ROH ₂ O (монография).
2. Подготовьте почки для decellularization.
   1. Восстановление почку от мужчины Спрэг Dawley крыс (250-300 г), как описано ранее ^7.
      1. Обезболить крысу путем внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала (50 мг / кг массы тела). Часто изучить глубины анестезии (каждые 10-15 мин) по мониторингу дыхательную функцию, частоту сердечных сокращений, и ответ пальца щепоткой во время операции. Если животное имеет повышенный частоту дыхания или положительный рефлекс педали, администрирование дополнительные дозы (с 1/3 до 1/4 от первоначальной дозы) фенобарбитала.
      2. Выполните продольный срединный abdominaл разрез подвергать почки, брюшной аорты и нижней полой вены.
      3. Вводите 2000 USP гепарина единиц / кг веса тела в половом члене вены.
      4. Мобилизовать обе почки от нежного вскрытия. Осторожно отделить почки от околопочечной жира, при сохранении почечной капсулы, окружающей почку нетронутой. Заливать почки с холодным солевым раствором (10 мл) через ИК-почечной брюшной аорты.
   2. Вставка 24 калибра катетер в почечную артерию, плотно лигировать катетер в артерии, и (с помощью шприца) аккуратно заливать почку с 10 мл холодного фосфатно-солевой буфер (PBS) полностью очистить орган крови.
   3. Погружают почку в 25 мл PBS в чашке Петри и место в -20 ° C морозильнике, чтобы постепенно заморозить орган (тем самым индуцируя лизис клеток) для хранения до decellularization.
      Примечание: при желании, мочеточник и / или почечной вены может также канюлю ретроградной посева, хотя и не описаны в Thiс протоколом.
   4. Полностью таять замороженные почки (equilibriate при комнатной температуре (RT)), и аккуратно заливать с 10 мл PBS, чтобы проверить лигированного почечной артерии на герметичность. Если наблюдаются утечки или значительное сопротивление, повторно катетер почечной артерии.
3. Подготовка оборудования для decellularization. Соберите систему перфузии decellularization, как показано на рисунке 1В.
   1. Подключите один 8 "длиной перистальтический насос (рис 1D, е) двух достаточных длины (> 36" рекомендованных) 1/16 "Внутренний диаметр (ID) силиконовые резиновой трубки (рис 1D, ч). Используйте два мужчины замок Luer 1/8 "колючей адаптеры соединенных одной самки Луер X женский Luer адаптер, чтобы присоединиться сегментов труб (рис 1D, J). Вставьте дополнительный мужской люэровского 1/8 "колючей адаптер (рис 1D, с) в нижнем конце перфузии линии для прикрепления к почечнойКатетер артерии.
   2. Подключите каждый перистальтический насос сегмент труб для головки насоса 4-ролика, используя большой картридж насоса.
   3. После размещения выше по потоку конец силиконовой резиновой трубки в первом резервуаре раствор (ROH ₂ O), удерживайте кнопку «PRIME» в полной мере премьер друг перфузии цепи раствором. Критическая: Убедитесь, что не было пузырей остаются в ловушке трубки, и что передний конец (слева открыт для извлечения флюида) из силиконовой резины трубы прикреплен ниже границы раздела жидкость-воздух из резервуара реагента, как показано на фиг.1В.
4. Выполните протокол decellularization при комнатной температуре ^7.
   1. Подключение катетера почечной артерии на каждой почке талой до конца трубки цепи перфузии ниже по потоку от насоса, гарантируя, что пузырьки воздуха не захватываются в катетере. Разрешить почек должно быть приостановлено по внутренней стенке пустого 5 л лабораторный стакан (перфузата коллекторного резервуара, см рисЮр 1B) так, чтобы почечной артерии не перекручены и спиральный.
   2. Отрегулируйте привод насоса до 5 мл / мин, а затем нажмите кнопку "Пуск". Убедитесь, что каждый перфузии почек путем наблюдения решений капельно из нижней части органа.
   3. Заливать каждой почки со следующими реагентами, как описано на фиг.1А
      1. Заливать 500 мл ROH ₂ O при 5 мл / мин в течение 1 ч, 40 мин.
      2. Заливать с 1000 мл 1% Тритон Х-100 на 5 мл / мин в течение 3 ч, 20 мин.
      3. Заливать с 1000 мл 1% Тритон Х-100 на 1 мл / мин в течение 16 ч, 40 мин.
      4. Заливать с 1000 мл 0,1% SDS при 5 мл / мин в течение 3 ч, 20 мин.
      5. Заливать 500 мл ROH ₂ O при 5 мл / мин в течение 1 ч, 40 мин.
         Примечание: В каждом decellularized почек могут быть сохранены в PBS (без добавок) в 50 мл коническую пробирку при 4 ° С в течение максимум двух недель перед использованием.

2. ЗаFusion Биореактор Ассамблеи, почек Стерилизация и подготовка к Recellularization

1. Подготовка биореактора судов.
   1. Вымойте стекло биореактор резервуары (компонент тела) и биореактор головы теплой, развести средство для мытья посуды решения (например,. 1% раствор средства для мытья посуды в водопроводной воде) и тщательно сполоснуть водой и затем ROH ₂ О. Разрешить компоненты полностью высохнуть.
   2. Применение небольшого объема (~ 5 мл) силицирования реагента к нижней части каждого резервуара. Убедитесь, что реагент смачивает всю поверхность нижней в течение нескольких секунд, затем слейте лишнюю жидкость.
   3. Разрешить резервуары для просушки в вытяжку на RT O / N. Кроме того, резервуары могут быть высушены в печи при 100 ° С в течение 30 мин, чтобы ускорить сушку и улучшить долговечность покрытия, которое предназначено, чтобы предотвратить прикрепление клеток к нижней части резервуара биореактора стекла.
2. Подготовьте компоненты перфузии цепи для стерилизации (Рисунок1D).
   1. Вырезать на следующие длины трубы (для каждого биореактора):
      1. Вырежьте два 25 "длин 1/16" ID силиконовой резиновой трубки (рис 1D, ч).
      2. Отрежьте один 8 "длиной перистальтический насос (рис 1D, е).
      3. Отрежьте один 4,25 "Длина 1/16" ID силиконовой резиновой трубки.
      4. Вырежьте два 1 "длины толстостенных 1/16" ID силиконовой резиновой трубки (рис 1D, г).
      5. Отрежьте один 2 "длиной 1/4" ID х 0,5 "Диаметр (OD) силиконовая резина трубки наружная (рис 1D, е).
   2. Подготовьте следующие Lüer адаптеры (для каждого биореактора):
      1. Подготовьте 10 мужчин люэровского 1/8 "колючей адаптеры (рис 1D, в)
      2. Подготовьте 2 мужчины Луер разъемы (рис 1D,)
      3. Подготовьте 2 женщин шапки Lüer (рис 1D, б)
      4. Подготовьте 5 женщин Луерх женщин Луер адаптеры (x5; Рисунок 1D, г)
   3. Вымойте все трубы и Luer адаптеры теплой, развести средство для мытья посуды решения, тщательно промыть в проточной воде, а затем ROH ₂ O, и дайте им высохнуть.
3. Соберите перфузии схем.
   1. Купон 1 "длина толстостенных 1/16" ID силиконовой резиновой трубки на входе Luer акцептора, прикрепленной к голове биореактора. Поместите мужской Луер замок на 1/8 "ID колючей адаптер в открытом конце трубки. Повторите для другой впускной Luer акцептора и подключите женского Луер колпачок для герметизации порта (предназначенный для мочеточника или венозных методов посева, не описанных в данном протоколе).
   2. Подключите каждый 25 "сегмент 1/16" ID силиконовой резиновой трубки к 8 »сегменте труб перистальтического насоса, используя мужской замок Luer для 1/8" ID бородки и женщин Luer х женщин Luer адаптеров (рис 1D, J).
   3. Подключите один открытый конец силиконовой резины тубинскимг в СМИ перфузата на внешней стороне головы биореактора. Подключение "длину 1/16" ID трубки к противоположной (внутренней) стороне носителя выходе перфузата 4,25 на внутренней стороне головки биореактора.
   4. Подключение мужской замок Люэра с 1/8 'ID колючей адаптер с оставшимся открытом конце трубки перфузии цепи. Подключите женщина Луер х женского Луер адаптер к мужскому замка Luer. Подключите женщина Луер х женского Луер адаптер к открытой мужской люэровского ведущим во впускной Luer акцептора на биореакторе. Это будет служить в качестве средств массовой информации входе перфузата ведущим непосредственно в катетеризации почечной артерии.
   5. Убедитесь, что никакие порты на крышке биореактора не остаются открытыми или подвергается. Плотно закрыть вакуумный клапан на биореактора тела.
   6. Установите биореактора головой над телом водохранилища, с уплотнительным кольцом, зажатой между идентичными пазами, выстилающих каждого компонента. Поместите металлический зажим через интерфейс, чтобы держать две компоненты вместе.
   7. Установите вентиляционную порт биореактора головой вентиляционным фильтром 0,2 мкм, соединяющий две компоненты с помощью "длину 2 1/4" ID х 0,5 "ОД силиконовой резины трубы (рис 1D, е). Откройте выпускной клапан.
   8. Слегка ослабьте красной крышкой на биореактора головой.
   9. Поместите оставшиеся Lüer адаптеры и 6 "зубчатые щипцы образцами в автоклавируемый мешок и печатью.
4. Автоклав собранные биореакторов и мужчин пробки Luer.
5. Подготовьте следующие реагенты для лесов стерилизации и среднего перфузии перед посевом (объемы указаны в decellularized почки):
   1. В вытяжном шкафу, подготовить 50 мл 0,1% надуксусной кислоты, 4% раствор этанола, добавив 2,56 мл раствора надуксусной кислоты (39% акций) и концентрации 40 мл этанола пробы 200. к ~ 957 мл ROH ₂ O в 1 л бутылки. Тщательно перемешать, несколько раз перевернув бутыль, и поместите в кабинете биологической безопасности.
   2. Подготовить150 мл раствора PBS 1x, предварительно стерилизуют в автоклаве.
   3. Подготовка 50 мл DMEM / F12, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина (Pen-Strep).
6. Соберите оставшиеся детали для перфузии биореактора сборки. Поместите все предметы в кабинете биологической безопасности. ВАЖНЫЙ: Убедитесь, что бокс биологической безопасности оборудован работы электрических розеток для питания цифровой диск насоса. Кроме того, используйте удлинитель для подключения привода насоса к внешним электрических розеток вне шкафа.
   1. Соберите decellularized почки.
   2. Соберите автоклавного биореакторов с прикрепленными перфузии схем.
   3. Соберите автоклавного мешочек Lüer адаптеры и щипцы.
   4. Соберите цифровой привод насоса с прикрепленной 4-ролика головы, и большие патроны насос (1 за перфузии цепи).
7. Заполните схему перфузии, как описано на рисунке 1С в стерильных Сonditions пределах кабинете биологической безопасности.
   1. Подключите 3-ходовой кран (рис 1D, я) между мужской Luer замок, чтобы 1/8 "ID колючей адаптер вблизи входа СМИ перфузата и женщина Luer х женского Луер адаптером. Оставьте все три порта на открытом кран.
   2. Удалить красный колпачок на голове биореактора и пипеткой 50 мл 0,1% надуксусной кислоты, 4% этанола раствор в средней резервуара через отверстие.
   3. Подключите перистальтического сегмент трубки насоса к головке насоса, используя большой картридж насоса. Отрегулируйте расход до 5 мл / мин, нажмите "Пуск", и позволяют замыкание на расцвете сил.
      1. Когда жидкость заполняет перфузии линии и достигает оставшуюся открытой порт трехходового крана, подключите порт с помощью мужчины Луер подключить (рис 1D, а).
      2. Разрешить схема полностью простое до тех пор, воздух не наблюдалось в трубке перфузии цепи или на внутренней стороне впускного Luer акцептора. Если necessaры, увеличивают расход временно изгнать пузырьки из перфузионной линии. Когда полностью заполнен, остановить привод насоса.
   4. Осторожно вставьте женский Luer конец катетера почечной артерии в мужской входе Luer акцептора на внутренней поверхности биореактора головку с помощью стерилизованных 6 "щипцов. Убедитесь, что соединение является жесткой, и что воздух не остается в катетер. Разрешить почек мягко свисают с катетером почечной артерии, так что почечная артерия не крутить или излом.
   5. Затянуть хомут металлический держит вместе биореактора голову и тело, так что биореактор резервуар плотно закрытыми. Закройте красный колпачок на голове биореактора.
8. Стерилизацию при комнатной температуре почки путем перфузии с 0,1% надуксусной, 4% -ным раствором этанола в 5 мл / мин в течение 1 ч, а затем три последовательных 1-HR перфузии при комнатной температуре с 50 мл PBS на 5 мл / мин.
   1. Изменение решения:
      1. После 1 часа, остановить насос и открыть красный колпачок. Использование Steраздражать (в автоклаве) пипетки Пастера, тщательно аспирации весь раствор из биореактора резервуара. Оставьте контур перфузии полностью заполнен.
      2. Внесите 50 мл свежего раствора в биореакторе резервуара, закройте колпачок, и запустить насос.
9. После окончательного полоскания PBS, PBS аспирата из резервуара и пипеткой в ​​50 мл DMEM / F12, дополненной 10% FBS и 1% Pen-Strep. Закройте колпачок, и передачи биореактор с присоединенным перфузии цепи к большой емкости инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
10. При необходимости передачи привода насоса в инкубатор. Подключение цепи проточном биореакторе с насосом, и заливать почки в 4 мл / мин в течение не менее 1 ч перед посевом.

3. Почки Recellularization с почечной Кортикальная эпителиальных клеток канальцев

1. Теплые достаточные объемы DMEM / F12 (с добавлением 10% FBS и 1% Pen-Strep) и Слокоть диссоциации фермент для клеток подъема до 37 ° С. Предлагаемые объемы приведены ниже:
   1. Подготовьте 10 мл клеток диссоциирующего фермента и 10 мл DMEM / F12 за 175 см ² культуральной колбе для подъема.
   2. Подготовка 5-10 мл DMEM / F12 за почки быть посеяны.
2. Соберите достаточное количество культурных колб для посева желаемой концентрации (4 х 10 ⁷ увековечены RCTE клетки человека ^{18 процентов} результатов в почках в максимальной приживления RCTE клеток, использующих эту стратегию посева).
3. Лифт клетки из колб с использованием клеток разлетным фермент. Аспирируйте среду из колбы, а затем пипеткой 10 мл клеток диссоциации фермент в колбу. Место колбу в 37 ° C инкубатора, чтобы ускорить диссоциации.
4. Проверьте колбу на фазово-контрастного микроскопа каждые 2 мин до тех пор, пока наблюдается полная диссоциация клеток из колбы поверхности. Примечание: Время инкубации будет варьироваться в зависимости от уровня слияния клеток, но РКТО клетки гэквайеру примерно 15 мин, чтобы полностью отделить.
5. Возьмите образец диссоциированного клеточной суспензии для подсчета до гранулирования. Развести клеточной суспензии с равным объемом предварительно нагретой DMEM / F12 среды, и центрифугируют при 232 х г в относительной центробежной силы (RCF) в течение 5 мин.
6. Граф клеток во время центрифугирования. Развести полученный образец с равным объемом трипанового синего, и пипеткой 10 мкл в каждом конце гематоцитометре для подсчета. Рассчитать необходимый объем разбавления осадок, чтобы получить нужную концентрацию посевного (2 х 10 ⁷ клеток / мл).
7. После центрифугирования осадок разбавить с соответствующим объемом культуральной среды, чтобы получить конечную концентрацию 2 х 10 ⁷ клеток / мл. Составьте 2 мл посевной суспензии в стерильный шприц 5 мл.
8. Передача перфузии биореактора в кабинете биологической безопасности. Поверните кран клапан, чтобы закрыть поток для посевного порт. Удалить мужской Луер скольжения вилку изкран, и подключение шприц, в который загружена посева суспензии.
9. Быстро перенести схему перфузии обратно инкубатора и использовать большой картридж насоса, чтобы обеспечить перистальтический сегмент трубки насоса к головке насоса.
10. Сотовый посева: Закройте кран клапана порт указывая к насосу. Медленно вводят суспензии клеток в почках, гарантируя, что все суспензию переносят из шприца в кран и перфузии линии. Включите кран, чтобы закрыть клапан потока из шприца, и запустить насос на 25 мл / мин в течение 15 мин.
11. Через 15 мин, снизить расход насоса до 4 мл / мин. Обмен среднего (объем 100 мл для последующих изменений) следующий день, а после этого каждые два дня.

4. Оценка Жизнеспособность и размножение с помощью резазурин перфузии Пробирной

1. Подготовка резазурин реагента. Растворите 110,5 мг соли ресазурина натрия в 100 мл PBS при перемешивании, и разбавить 1:10 добавлением 5 млПолученный раствор до 45 мл свежей PBS, чтобы создать 440 мкМ исходного раствора ресазурина. Фильтр-стерилизовать (с использованием 0,2 мкм шприцевой фильтр), и хранить маточного раствора в защищенном от света 50 мл коническую пробирку при 4 ° С.
2. Подготовка резазурин-дополняется медиа управления. Приготовьте 10% -ный раствор резазурин реагента в культуральной среде (например. 5 мл исходного раствора резазурин + 45 мл культуральной среды) для создания ресазурина рабочего раствора. Автоклав объемом 10 мл рабочего раствора резазурин в защищенном от света контейнере. Примечание: Это будет полностью уменьшить резазурин соединение с ресоруфина, и будет служить в качестве положительного контроля для снижения расчете резазурин процентов.
3. Алиготе 1 мл каждого рабочего раствора резазурин (окисляется), в автоклаве ресазурин рабочего раствора (снижение), и культуральной среды в одиночку (пустой) в отдельных 1,5 мл сбора труб. Поместите открытые трубы в том же инкубаторе как перфузии биореакторах.
4. Передача перфузии почекСхема из инкубатора в кабинете биологической безопасности. Снимите колпачок из биореактора головой, и аспирации культуральной среды из биореактора резервуара с использованием пипетки Пастера.
5. Внесите 10 мл рабочего раствора резазурин в водохранилище, недалеко крышкой, и передать схему почек перфузии обратно в инкубатор.
6. Для включения насоса при 4 мл / мин и позволяют реагента заливать через почки в течение ровно 1 час.
7. После 1 часа, остановить насос и передачи цепи почек перфузии в кабинете биологической безопасности.
8. Соберите кондиционером (частично уменьшается) резазурин решение, и добавить 100 мл культуральной среды в биореакторе водохранилища. Передача перфузии цепи в инкубатор, и возобновить поток (4 мл / мин).
9. Внесите 100 мкл (х 3 повторения) кондиционером ресазурин решение, ресазурин рабочего раствора, в автоклаве рабочего раствора, и культура СМИ заготовки в черный (непрозрачный) 96-а планшету. Читайте интенсивность флуоресценции (excitatионный: 540/35; выбросов: 590/20) с помощью спектрофотометра.
10. Рассчитать процентное снижение как отношение интенсивностей флуоресценции, нормированные по интенсивности флуоресценции (FI), порожденных окисляется резазурин среды (ORM или резазурин рабочий раствор не подвергается клеток) или уменьшается ресазурин среднего (RRM или в автоклаве рабочего раствора):% сокращения = 100 х {[FI (кондиционером решение ресазурин) - FI (ОРМ)] / [FI (РРМ) - FI (ОРМ)]}. Для нормализации результатов, умножьте% снижение объема циркулирующей по (10 мл) и разделить по времени инкубации (1 час).

Почки последовательно перфузии водой и разбавленным моющих растворов (1% Тритон Х-100, 0,1% SDS) в соответствии с ранее установленным, оптимального протокола decellularization (см фиг.1А, Б) ^7, постепенно становятся все более прозрачными в течение 26 ч, а показано на фиг.2А. Полученную бесклеточной каркас почек лишена клеток и сохраняет сплоченную почечной ECM поддерживаемый интактной почечной капсуле, которая не была повреждена в соответствии с протоколом перфузии. По итогам моющего перфузии (SDS), сосудистая сеть почки, и, в частности, междолевых сосуды, видном в decellularized помост, из-за большей толщины этих кровеносных сосудов по отношению к сравнительно тонкой базальной мембраны нефрона канальцев ( рис 2А, Б). Весь орган очищается от родных клеток, оставляя нетронутыми за базальной мембраны клубочков сети, трубочек и седловинесборном протоки, и ECM в decellularized кровеносных сосудов, в том числе внутренней и внешней эластичной пластинки коры междольковых артерий (рис 2B, C). В дополнение к более крупные суда, микроваскулярного базальные мембраны клубочков в пределах и сохранить структурную целостность (рис 2B, C).

Decellularized почки хранятся в PBS при 4 ° С, чтобы ограничить естественное гидролитической ухудшение почечной ECM, и должен быть использован в течение 2 недель decellularization. Ранее мы уже подробно описал конструкцию биореактора заказ перфузии основе почек, который используется как для посева decellularized лесов грызунов почек и долгосрочной культуры recellularized органов в потоке ^17. Для recellularization, перфузии цепи состоит из малого диаметра силиконового каучука и усталостной устойчивостью трубки Фармед насоса используется для маршрутизации культуральной среды из биореактора резервуара, чтобы перистальтического насоса иобратно к впускному Luer акцептора, к которой катетер почечной артерии соединена с внутренней поверхностью головки биореактора (рис 1c). После стерилизации decellularized почку путем перфузии с надуксусной кислоты / этанол, система перфузии нацелен для посева путем циркуляции стандартную культуральную среду (содержащую 10% FBS, чтобы улучшить клеточной адгезии ECM) через строительные леса в инкубаторе.

В decellularized почки могут теперь служат бесклеточные шаблоны для ECM recellularization, которые мы уже проводили с использованием индуцированных клеток, полученных эндотелиальные клетки плюрипотентных стволовых реваскуляризации ^7. Здесь мы демонстрируем полезность этого эшафот и перфузии биореактора системы тубулогенеза используя почечные кортикальные трубчатые эпителиальные (РКТО) клеток человека, полученных. РКТО клетки высевают в каркасах почек через почечную артерию под протоколом перфузии под высоким давлением, который был описан ранее ⁷17 .RCTE клетки переплетаются в этой манере дома в первую очередь для корковых областей почки, где они преимущественно заселить periglomerular канальцев (рис 3а). Мало клетки вставлять в клубочков в день 1 после посева, а на 7 день, клубочки практически лишена клеток. Во время перфузии культуры, среда меняется каждые 2 дня, после чего ресазурин перфузии Анализ одновременно выполняемые для обеспечения сравнительных оценок жизнеспособности клеток с течением времени (рис 3B). Как подтверждается результатами сокращения ресазурин, RCTE клетки размножаются в 3D ECM, образуя плотно организованы, патент трубчатые структуры по 7 день В то время как большинство из этих клеток занимают корковых областей почечной ECM, после 7 дней антеградная перфузии культуры многих RCTE картонных трубочек присутствуют в наружной мозгового и папиллярных канальцев и собирательных трубочек (рисунок 4). После заселения с RCTE клеток и одной недели заСлияние культуры, прозрачность наблюдается после decellularization теряется, и recellularized почки появляется непрозрачный и ближе по внешности своей родной государства (см рисунок 4).

Рисунок 1:. Почки Decellularization системы и протокол и Recellularization перфузии цепи () перфузии график реагентов для decellularization грызунов почек. Реагенты, используемые для decellularization, объемном расходе и продолжительности каждого этапа приведены. (B), перфузии decellularization настройки. Решения закачивается в одном направлении из резервуара реагента в перфузата контейнер для сбора через отдельных линий потока для каждой почки претерпевает decellularization. До четырех почки могут быть decellularized за перистальтического насоса. (С) перфузии цепи FOг посев и культура recellularized лесов в почках. Клетки загружаются через шприц, подключенный непосредственно перед впускным акцептора Luer. Дополнительные в линию датчики для контроля давления, растворенного кислорода (DO ₂₎ и рН может быть помещен перед биореакторе. Цифровой перистальтический насос может управляться с помощью компьютера, и отрицательное давление (разрежение) может быть применена, чтобы помочь мочеточника посева. (D) компоненты, используемые для создания перфузии линии для decellularization (B) и (C recellularization). () Штекер Луер, (б) женщина Луер колпачок (C) мужской замок Luer для 1/8 "колючей адаптер, (г) женщина Луер женской Луер адаптером, (е) ¼" ID силиконовые трубки (F) перистальтический насос, г: толстостенные 1/16 "ID силиконовой резины трубы, (ч) 1/16" ID силиконовой резины трубы, (я) трехходовой кран (J) соединитель используется для подключения сегментов труб путем объединения два 1/8 "колючка мужского пола Luer адаптеров (с) с использованиемженщина Луер женской Луер переходник (г). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2:. Представитель Результаты почек Decellularization представитель брутто и микроскопические изображения показаны почек до и после decellularization. () Временной интервал серии почки проходит decellularization. Изображения показали сразу после перфузии с каждого реагента указан. После перфузии 0,1% SDS (додецилсульфата натрия), сохраняется сосудистой сети видна. (Б) Типичные изображения носителями или decellularized почек срезы и окрашивали гематоксилином и эозином (H & E). ЕСМ архитектура микроструктурных особенностей, в том числе клубочков, канальцев, И кровеносные сосуды, хорошо сохранившийся следующие decellularization. (С) Сканирование электронной микрофотографии сравнения клубочки и канальцы в родном (верхний ряд) и decellularized (нижний ряд) почки. После удаления клеток, открытые канальцы распространены по всей почки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: Представитель Результаты. Человеческих почек трубчатых эпителиальных корковых Recellularization из Decellularized почек крыс Почки recellularized через антеградная артериальной перфузии высокого давления, что приводит к адгезии клеток RCTE в первую очередь для почечных канальцев коры. () Типичные высоким увеличением изображения (20X) на гематоксилином и эозином окрашенных histoloческие секции recellularized каркасов 1, 3, или 7 дней после посева. Верхний ряд показывает, что клетки занимают periglomerular трубчатый пространство, несмотря на впрыскивается через артериальную сосудистую, указывая свои предпочтения по бывшей почечной ECM нише. Желтые Arrowhead указывает на афферентной артериолы с просветом, который не содержит клеток. Нижняя строка показывает корковых канальцев, где RCTE клетки пролиферируют, с увеличением плотности клеток в течение одной недели, и образуют плотно упакованные трубчатые эпителиальные структуры. (Б) мал (10 мл) Объем резазурин-дополнена питательной среды рециркулирует через почки в момент смены носителя. Во 60 мин перфузии, клетки уменьшить окисленного резазурин соединение (синий), чтобы ресоруфина (красный), который производит чрезвычайно флуоресцентный сигнал пропорционально числу клеток в почках. В соответствии с наблюдаемого увеличения плотности клеток видели в гистологических изображений, увеличивается сокращения ресазурин процентов над культурой тиме с ростом клеток, обеспечивая неинвазивные указание как жизнеспособности и пролиферации клеток во время технического обслуживания культуры. Результаты представлены в виде среднего ± стандартное отклонение (п = 4 recellularized почки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рис. 4: Представитель Результаты: Сравнение родной, Decellularized и Recellularized почек низкой кратности гистологические изображения показывают почечной коры, переходная зона между корой и внешней мозга, и мозгового регионов сосочков в родных почек (верхний ряд), decellularized (Decell; средний ряд), и 7-дневные РКТО-recellularized (7 день Recell; нижний ряд) леса. Пунктирная линия показывает приблизительное границу между почечной коры (C) и внешней мозга (M). Валовые изображения показывают почку в ее родном штате после закупки, следующий decellularization, и 7 дней после посева клеток RCTE через почечной артерии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Описанный протокол decellularization последовательно производит полностью бесклеточной ECM почек, который служит в качестве шаблона для 3D культуры человеческих почечных корковых трубчатых эпителиальных клеток (как проксимальных и дистальных канальцев происхождения), в дополнение к эндотелиальных клеток сосудов ^7,17. Канюлируют почечная сосудистая служит ключевой особенностью для равномерного поставки реагентов и клеток на протяжении эшафот в биореакторе в настройке, что позволяет перфузии decellularization, посева клеток, долговременные перфузии культуры и резазурин протоколы перфузии. Таким образом, надлежащее катетеризации почечной артерии до перфузии органов имеет решающее значение, и особое внимание должно быть приняты для того, чтобы почечной артерии не перекрывается или поврежден, и что катетер закреплен. В Sprague Dawley крыс, из которого почки должны быть восстановлены системно гепаринизированной чтобы избежать свертывания внутри сосудистой сети в течение закупок органов, а внутрисосудистые сгустки не может бе удалены, и может ингибировать полный decellularization почки.

Перфузии биореактора для посева и перфузии культуры recellularized почек разработана, чтобы позволить несколько методов посева в месте ^17. В дополнение к технике артериальной инъекции, описанной здесь, клетки могут быть введены ретроградной катетеризации через мочеточника или почечной вены. Кроме того, корпус биореактора снабжена клапаном, который позволяет приложение отрицательного давления (разрежение; рисунок 1c), для посева мочеточника. Независимо от стратегии используемой посева, перфузии культуральной среды антеградном через почечную артерию является критическим для адекватной питательных веществ (например, кислорода, глюкозы) доставки посеянных клеток.

Описанный протокол recellularization демонстрирует наше использование decellularized почечных матриц в качестве шаблонов специально для эпителиальных тубулогенеза. Тем не менее, у нас есть ранее шсобственного что матрица почек также поддерживает повторное эндотелиализацию нераспределенной сосудистой сети и может быть облицованы клеток, полученных эндотелиальных клеток человека плюрипотентных стволовых индуцированных, который является важным для последующего наблюдения долгосрочного трансплантации почек recellularized в животных моделях профилактики тромботических окклюзия почечной сосудистой ^7. Ток препятствием к возможному расширению масштабов протоколов почек recellularization к лесов в почках крупных животных является существенно большее количество клеток, необходимых для заселить человеческие размера каркасов в почках. Эффективные стратегии посева, такие как артериальная техники впрыска высокого давления, описанной выше, крайне необходимо, чтобы максимально увеличить количество клеток, которые привить в decellularized ЕСМ. Учитывая гетерогенную клеточный состав родной почки, несколько методов посева, в конечном счете, может потребоваться, чтобы эффективно повторно заполнить различные внеклеточные почечных ниши с различными типами клеток, которые COLLECственно выполнять многочисленные функции почек, в том числе фильтрации, реабсорбции, концентрации мочи и синтеза гормонов.

Наконец, ресазурин перфузии Анализ показал, в этой статье предусматривает неинвазивный, не токсичный оценку жизнеспособности и пролиферации клеток при длительном культуры ^7,17,18. Анализ обеспечивает мгновенный отклик на метаболического состояния клеток, растущих в каркасах почек, и при регулярном выполнены в периодических обменов между средними, может быть использован для характеристики пролиферацию клеток в течение долгого времени. Ресазурина реагент является недорогим, анализ требует мало времени для выполнения (1 час), и это более консервативный аналитический метод для характеристики клеточной пролиферации или метаболических тенденции по сравнению с гистологической оценки, который требует терминала жертву recellularized помост. Ресазурина перфузии анализ также может быть приспособлен для оценки клеточных популяций в процессе роста в другой Recellularized органов или тканей.

The authors have nothing to disclose.

The authors thank the support of the Zell Family Foundation. We recognize support from the Northwestern Memorial Foundation Dixon Translational Research Grants Initiative, the American Society of Transplant Surgeon’s Faculty Development Grant, and a Research Grant for the Young Investigator from the National Kidney Foundation of Illinois. We acknowledge support from the Robert R. McCormick Foundation. This work was also supported by NIDDK K08 DK10175 to J.A.W. Imaging and histology cores used for this research is supported by the Mouse Histology and Phenotyping Laboratory, Electron Probe Instrumentation Center (EPIC), and Simpson Querrey Institute Equipment Core at Northwestern University, and a Cancer Center Support Grant (NCI CA060553). The authors would like to acknowledge the Northwestern University Microsurgery Core for rodent kidney procurements. Evaluation of renal tubular epithelia morphology following recellularization conducted in the Fluorescence Microscopy Shared Resource supported by P30 CA118100.

An erratum was issued for Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development.

The human RCTEC/RCTE cell stocks used here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 were originally provided by Dr. Loghman-Adham (then at St. Louis University) to co-author Dr. Wandinger-Ness (University of New Mexico) through an MTA in 2001. The SV40 immortalized human RCTEC/RCTE cells were characterized as being of distal tubule cell line as detailed in Loghman-Adham et al., 2003. On the basis of recent short tandem repeat (STR) DNA sequencing (Performed by IDEXX BioResearch) of the earliest passages of the RCTEC/RCTE cell stocks it became evident the cells were of mixed lineage. Further analyses of PCR products using QIAxcel capillary electrophoresis demonstrated the presence of a canine product. The product was sequenced and established to be of canine origin. A set of canine specific STR markers were compared to the sample and showed that the sample had a genetic profile with 92% identity to the MDCK cell line.  Later cell stocks that were used in the present publication were STR profiled and showed drift to 100% MDCK lineage. Despite being of canine origin, rather than human as was previously thought, MDCK is similarly a distal tubule epithelial cell line. For this reason, previous interpretation and conclusions drawn using these cells here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 remain sound, but for purposes of rigor, reproducibility and experimental validation by others we report on this misidentification. This information will also be reported for listing on the International Cell Line Authentication Committee (ICLAC) database (http://iclac.org).