Method Article
This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.
Este protocolo detalha a geração de acelular, ainda, renais matriz extracelular (ECM) andaimes biofuncionais que são úteis como pequenos substratos modelo para o desenvolvimento do tecido do órgão escala. Sprague Dawley rins de ratazana são canulados através da inserção de um cateter na artéria renal e perfundido com uma série de detergentes de baixa concentração (Triton X-100 e dodecil sulfato de sódio (SDS)) ao longo de 26 h para derivar intactas, andaimes todo-renais com intacta vasculatura perfusable, glomérulos e túbulos renais. Após a descelularização, o andaime renal é colocado dentro de um vaso de bioreactor de perfusão personalizados, e a artéria renal cateterizada está ligado a um circuito de perfusão que consiste em: uma bomba peristáltica; tubulação; e sondas de opcionais para pH, oxigênio dissolvido, e pressão. Após a esterilização do andaime com ácido peracético e etanol, e o equilíbrio do pH (7,4), o andaime de rim é preparado para propagação através de perfusão de meio de cultura dentro de um largincubadora e capacidade mantida a 37 ° C e 5% de CO 2. Quarenta milhões de células epiteliais tubulares corticais renais (RCTE) são injectados através da artéria renal, e rapidamente perfundido através do andaime sob alto fluxo (25 ml / min) e de pressão (~ 230 mmHg) durante 15 min antes de reduzir o fluxo a uma taxa fisiológica (4 ml / min). Células RCTE preencher primeiramente o nicho ECM tubular dentro do córtex renal, proliferam e formam estruturas epiteliais tubulares ao longo de sete dias de cultura de perfusão. Uma solução resazurina 44 uM em meio de cultura é perfundido através do rim durante 1 h durante as trocas de média para proporcionar uma avaliação fluorométrico, à base de redox metabólica de viabilidade e proliferação celular durante tubulogenesis. O bioreactor de perfusão do rim permite a amostragem não invasiva de meio de avaliação bioquímica, e várias portas de entrada de ar permite a semeadura alternativa retrógrado através da veia renal ou ureter. Estes protocolos podem ser usadas para recellularize andaimes nos rins com umvariedade de tipos de células, incluindo as células endoteliais vasculares, do epitélio tubular, e fibroblastos do estroma, para avaliação rápida dentro deste sistema.
À medida que o número de pacientes que sofrem de fase final de insuficiência renal continua a aumentar, há uma escassez grave e crescente do número de rins de doadores disponíveis para transplante. A incapacidade de atender a demanda de um número crescente de candidatos continuamente espera-listados para o transplante renal levou a investigação em engenharia órgão rim com o objetivo final de desenvolvimento personalizado, enxertos renais implantáveis sob demanda 1,2. , Que funcionará tecido renal a partir de células do próprio paciente eliminaria a necessidade de imunossupressão ao longo da vida, diminuir a quantidade de tempo que os pacientes gastam em diálise à espera de um transplante de rim, e estender o transplante salva-vidas a mais pacientes com doença renal crônica.
O primeiro passo para a bioengenharia um tecido renal usando células derivadas de pacientes é o de desenvolver uma estrutura de suporte que serve como um substrato de suporte para o parênquima renal (por exemplo Epítetos tubularLiAl), fibroblastos do estroma, e o crescimento celular vascular. Andaimes biomaterial derivadas de matrizes extracelulares de órgãos naturais (ECM) têm várias características que os tornam desejáveis para utilização em engenharia de tecidos, incluindo a sua composição biológica natural; macro e microestrutura adequada para dotar funções fisiológicas; e biocompatibilidade celular, promovendo a adesão celular, migração e tecido construtiva remodelação 3. Um método promissor para produzir scaffolds para regeneração de tecidos renal é através decellularization de alogênicos ou xenog�icas rins que preservar muito da composição proteína natural complexo do ECM rim 4, manter a complexidade arquitetônica inerente do órgão, e superar a dificuldade associada com bottom up engenharia de tecidos celularizados grossas, fornecendo um suprimento vascular para as células em desenvolvimento após andaime recelularização 5.
Perfusão descelularização é um processo emque detergentes, enzimas ou outras soluções de desregulação celulares são uniformemente distribuído através da rede vascular do órgão 6. Esta estratégia tem sido definida como um processo eficiente para derivar acelulares andaimes ECM baseada em órgãos como tridimensional (3D), modelos biológicos para engenharia de órgão inteiro de 6-8, como evidenciado pelo desenvolvimento de modelos renais acelulares de rins humanos descartados 9 e os rins xenog�icas obtidos a partir de grandes animais (por exemplo, 10 porco, cabra 11) e fontes de roedores 12. Em particular, a utilização de modelos animais, tais como roedores pequenos requer menos células e meios de cultura, o que é especialmente útil para estudos Recellularization órgão no qual os números de células são normalmente limitados, como é o caso com os tecidos derivadas de células estaminais. O objectivo do protocolo de descelularização é descrito para a produção de um ECM renal acelular que pode ser usado como um sistema de andaimes 3D para a regeneração do rim structures, incluindo os túbulos são repovoados nefrónios que no presente exemplo com epiteliais tubulares cortical renal humano (células RCTE). Nós anteriormente descrito a uma avaliação rigorosa de um protocolo óptimo detergente à base de rim de rato descelularização 7, que é mais rápida (aproximadamente um dia) do que os outros métodos relatados anteriormente (Ross et al .- 5 dias 12, Song et al .- 4,5 dias 13), e expõe o órgão a uma concentração consideravelmente mais baixa (0,1%) do sulfato de dodecilo de sódio desnaturante (SDS) durante a descelularização que relatórios anteriores 12-15.
Um número limitado de estudos têm descrito o uso de rins de roedores para decellularization e posterior utilização como um arcabouço 3D para repovoamento celular (revisto em outra parte 1) 12-16. Neste protocolo, nós fornecemos uma descrição detalhada de nosso previamente estabelecido, a estratégia decellularization ideal para a produção de andaimes renais acelulara partir de rins de ratos Sprague Dawley 7. Usando bioreactores de perfusão de design personalizado capazes de dupla semeadura e manutenção de perfusão cultura 17, nós recellularize os andaimes renais acelular com células RCTE humanos, que consistentemente repovoar o componente tubular nessas matrizes descelularizados, proliferam e sobrevivem na cultura de perfusão para mais de uma semana. Demonstramos ainda mais a utilização do ensaio de resazurina perfusão - um barato, não-citotóxico, e avaliação metabólica não-invasiva anteriormente utilizado para citotoxicidade estuda 17 - para fornecer uma indicação da viabilidade das células e proliferação nos rins repovoados 7 ao longo do tempo.
DECLARAÇÃO DE ÉTICA: Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com as directrizes aprovadas pelo cuidado e uso Comitê da Universidade Northwestern animal Institucional.
1. rim Decelularização
2. PorAssembléia fusão biorreator, rim Esterilização e Preparação para Recellularization
3. rim Recellularization com Renal Cortical Tubular células epiteliais
4. avaliação da viabilidade e proliferação celular usando Resazurina Perfusão Assay
Rins sequencialmente com água e dilui-se soluções de detergente (1% de Triton X-100, 0,1% de SDS) de acordo com um protocolo de descelularização óptimo previamente estabelecido (ver Figura 1A, B) 7, tornam-se progressivamente mais transparente ao longo de um período de 26 horas, conforme mostrado na Figura 2A. O andaime rim acelular resultante é desprovida de células e retém uma ECM renal coesa suportado por uma cápsula renal intacta, que não está danificado seguindo o protocolo de perfusão. Pelo perfusão detergente final (SDS), a rede vascular do rim, e em particular os vasos interlobares, são afixados no andaime descelularizado, devido à maior espessura destes vasos sanguíneos em relação à membrana basal comparativamente fina dos túbulos de nefrónios ( ver figura 2A, B). O órgão inteiro é limpo de células nativas, deixando para trás a rede membrana basal intacta de glomérulos, túbulos e collecting condutas, e a ECM de vasos sanguíneos descelularizados, incluindo lâmina elástica interna e externa das artérias interlobulares corticais (ver figura 2B, C). Além dos vasos maiores, as membranas basais dentro microvascular glomérulos também manter a integridade estrutural (ver figura 2B, C).
Rins descelularizados são armazenadas em PBS a 4 ° C para limitar a degradação hidrolítica natural da ECM renal, e deve ser usada dentro de 2 semanas de descelularização. Temos anteriormente descrito em pormenor a concepção de um bioreactor de perfusão personalizado baseado no rim, que é usado tanto para semeadura descelularizados andaimes nos rins de roedores, e a cultura a longo prazo dos órgãos repovoados sob fluxo 17. Para recelularização, um circuito de perfusão composto de borracha de silicone de pequeno diâmetro e uma bomba de tubo Pharmed resistentes à fadiga é utilizado meio de cultura de rota a partir do reservatório biorreactor, de uma bomba peristáltica, ede volta para a entrada do Luer aceitador ao qual a artéria renal cateterizada está ligado na face interior da cabeça do biorreactor (ver Figura 1C). Após a esterilização do rim descelularizado por perfusão com uma mistura de ácido / etanol peracético, o sistema de perfusão é preparada para semeadura por meio de cultura padrão (contendo FBS a 10% para melhorar a adesão célula-ECM), através do andaime no interior da incubadora circulante.
Os rins decelularizados podem agora servir como modelos ECM acelular para recelularização, que já anteriormente realizados usando células induzidas derivadas de células-tronco pluripotentes endoteliais para revascularização 7. Aqui, nós demonstrar a utilidade deste sistema biorreator andaime e perfusão para tubulogenesis usando epiteliais tubular células (RCTE) corticais renais de origem humana. RCTE células são semeadas em andaimes nos rins, através da artéria renal sob um protocolo de perfusão de alta pressão que tem sido descrito anteriormente 7, 17 .RCTE células infundidas neste casa forma principalmente para as regiões corticais do rim, onde preferencialmente repovoar os túbulos periglomerulares (ver Figura 3A). Poucas células incorporar dentro de glomérulos no dia 1 pós-semeadura, e de dia 7, glomérulos são praticamente desprovidos de células. Durante a cultura de perfusão, o meio é trocado a cada 2 dias, altura em que o ensaio de perfusão resazurina é simultaneamente realizados para fornecer avaliações comparativas de viabilidade das células ao longo do tempo (ver Figura 3B). Como apoiada pelos resultados de redução da resazurina, as células proliferam RCTE dentro do ECM 3D, formando muito bem organizados, estruturas tubulares de patentes por dia 7. Enquanto a maioria dessas células ocupar as regiões corticais do ECM renal, após 7 dias de cultura antegrade perfusão muitos túbulos forrado de RCTE estão presentes na medula exterior e túbulos papilares e dutos coletores (ver Figura 4). Depois de repovoamento com células RCTE e uma semana de percultura de fusão, a transparência observados após a descelularização é perdida, e o rim parece repovoados opaco e mais perto em aparência ao seu estado nativo (ver Figura 4).
Figura 1:. Kidney Decelularização Sistema e Protocolo e Recellularization Perfusão Circuit (A) Perfusão cronograma de reagentes para a descelularização de rins de roedores. Os reagentes utilizados para a descelularização, a taxa de fluxo volumétrico, e duração de cada passo são mostrados. (B) Perfusão decellularization set-up. As soluções são bombeados de modo unidireccional a partir de um reservatório de reagente a um recipiente de recolha de perfusado através de linhas de fluxo individuais para cada rim submetidos a descelularização. Até quatro rins podem ser descelularizados por bomba peristáltica. Circuito (C) Perfusão for semeadura e cultura de andaimes renais repovoados. As células são carregadas através de uma seringa ligada directamente a montante da entrada aceitador de Luer. Opcional sensores em linha para monitorização da pressão, o oxigénio dissolvido (DO 2), e o pH pode ser colocado a montante do biorreactor. A bomba peristáltica digital pode ser controlado por computador, e a pressão negativa (vácuo parcial) pode ser aplicada para auxiliar ureteral semeadura. (D) Os componentes usados para criar linhas de perfusão durante descelularização (B) e recelularização (C). (A) encaixe Luer macho, (b) tampão de Luer fêmea, (c) fecho Luer macho para 1/8 "adaptador farpado, (d) Luer fêmea ao adaptador Luer fêmea, (e) de ¼" tubulação de ID de silicone, (f) tubo de bomba peristáltica, g: de espessura de parede de 1/16 "ID do tubo de borracha de silicone, (h) 1/16" ID do tubo de borracha de silicone, (i) a torneira de três vias, (J) de acoplamento utilizado para ligar segmentos de tubos através da combinação dois 1/8 "farpa para adaptadores Luer macho (c) utilizando umLuer fêmea para fêmea acoplador Luer (d). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Os resultados representativos de rim Decelularização bruta Representante e imagens microscópicas são mostrados de rins antes e seguintes descelularização. (A) Tempo série lapso de um decellularization renal submetidos. As imagens são mostradas imediatamente após a perfusão com cada reagente especificado. Após a perfusão de 0,1% de SDS (dodecilsulfato de sódio), rede vascular preservada é visível. (B) Imagens representativas de rins nativos ou descelularizados seccionado e corado com hematoxilina e eosina (H & E). A arquitetura ECM dos aspectos microestruturais, incluindo glomérulos, coleta dutos, E vasos sanguíneos, é bem preservado seguinte descelularização. Micrografias (C) Eletrônica de Varredura comparando glomérulos e túbulos em nativa (linha superior) e descelularizados (linha inferior) rins. Após a remoção de células, túbulos abertos são prevalentes em todo o rim. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Os resultados representativos de corticais renais humanas epiteliais tubulares Recellularization descelularizado de rato Os rins rins são repovoados através de uma técnica de perfusão anterógrada arterial de alta pressão que resulta em RCTE adesão celular primariamente para os túbulos renais do córtex. (A) representativos imagens de alta ampliação (20x) de hematoxilina e histolo manchado-eosinagicos seções de andaimes repovoados 1, 3 ou 7 dias após a semeadura. Top de linha mostra que as células ocupam o espaço tubular periglomerular apesar de ser injetado através da vasculatura arterial, indicando a sua preferência pelo primeiro nicho ECM renal. Arrowhead pontos amarelos para uma arteríola aferente com um lúmen que é desprovido de células. Lower linha mostra túbulos corticais onde as células proliferam RCTE, com o aumento da densidade celular ao longo de uma semana, e formam estruturas epiteliais tubulares hermeticamente embalados. (B) Um pequeno (10 ml) volume do meio de cultura suplementado com resazurina é recirculada através dos rins, no momento de mudanças de meio. Durante 60 min de perfusão, as células reduzir o composto oxidado resazurina (azul) a resorufina (vermelho), que produz um sinal altamente fluorescente em proporção ao número de células no rim. Consistente com o aumento observado na densidade celular observada nas imagens histológicas, aumenta por cento de redução de mais de resazurina cultura time com o crescimento da célula, proporcionando uma indicação não-invasivo de ambos viabilidade e a proliferação das células durante a cultura de manutenção. Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão (n = 4 rins repovoados). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
. Figura 4: Resultados representativos: Comparação da Native, descelularizado, e repovoados Rins baixa ampliação imagens histológicas mostram o córtex renal, zona de transição entre as regiões da papila medulares córtex e medula externa, e em rins nativos (topo de linha), descelularizados (Decell; linha do meio), e 7 dias repovoados-RCTE (7 Day ReCell; linha inferior) andaimes. A linha a tracejado indica a fronteira aproximada entre o córtex renal (C) e da medula externa (H). Imagens brutas mostrar um rim em seu estado nativo após a recolha, seguindo descelularização, e 7 dias seguintes semeadura de células RCTE através da artéria renal. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O protocolo descrito descelularização produz consistentemente um ECM rim completamente acelular que serve como um modelo 3D para a cultura de células humanas epiteliais renais corticais tubulares (tanto proximais e distais derivada de túbulo), em adição a células endoteliais vasculares 7,17. A vasculatura renal canulada serve como o elemento-chave para a administração uniforme de reagentes e células de todo o andaime num biorreactor definir-se, permitindo assim que as perfusão decelularização, sementeira de células, cultura de perfusão a longo prazo, e a resazurina protocolos de perfusão. Como tal canulação, adequada da artéria renal, antes de perfusão de órgãos é crítica, e deve ser tomado um cuidado especial para assegurar que a artéria renal não é obstruído ou danificado, e que o cateter é fixado. Os ratos Sprague Dawley de que os rins são recuperados devem ser sistemicamente heparinizado para evitar a coagulação na vasculatura durante colheita de órgãos, como coágulos intravasculares não pode be removido, e podem inibir a descelularização completa do rim.
O biorreator de perfusão usada para propagação e perfusão cultura de rins repovoados é projetado para permitir que vários métodos de semeadura in situ 17. Em adição à técnica de injecção arterial descrito aqui, as células podem ser injectadas retrógrada através do ureter ou da veia renal cateterizada. Além disso, o corpo é biorreactor equipado com uma válvula que permite a aplicação de pressão negativa (vácuo parcial; ver Figura 1C), para semeadura ureteral. Independentemente da estratégia utilizada semeadura, a perfusão de meio de cultura anterógrada através da artéria renal é crítica para nutriente adequado (por exemplo, oxigénio, a glicose) entrega a células semeadas.
O protocolo recelularização descrito demonstra a nossa utilização de matrizes renais descelularizados para servir como modelos especificamente para tubulogenesis epitelial. No entanto, temos anteriormente shprópria renais que a matriz também suporta a re-endotelização da rede vascular retida e pode ser revestida com células endoteliais estaminais pluripotentes derivadas de células humanas induzida, o que é uma observação importante para a eventual transplante a longo prazo dos rins repovoados em modelos animais, impedindo trombótica oclusão da vasculatura renal 7. Um obstáculo atual para o eventual aumento de escala de protocolos Recellularization renais para andaimes renais grande de animais é a substancialmente maior número de células necessárias para repovoar andaimes de rim humano porte. Estratégias eficientes de sementeira, tais como a técnica de injecção de alta pressão arterial, descritos acima, são extremamente necessárias para maximizar o número de células que enxertar dentro do ECM descelularizado. Dada a composição celular heterogênea do rim nativo, vários métodos de semeadura pode vir a ser obrigado a preencher novamente de forma eficaz os vários nichos renais extracelulares com diversos tipos de células que COLLECtivamente realizar as várias funções do rim, incluindo filtração, reabsorção, a concentração de urina, e síntese da hormona.
Finalmente, o ensaio de resazurina perfusão demonstrado neste artigo fornece uma avaliação não-invasiva, não-tóxica de viabilidade e a proliferação das células durante a cultura a longo prazo 7,17,18. O ensaio fornece feedback instantâneo sobre o estado metabólico de células em crescimento dentro de andaimes nos rins, e quando realizados regularmente em intercâmbios entre médias periódicos, pode ser utilizado para caracterizar a proliferação de células ao longo do tempo. O reagente de resazurina é barato, o ensaio requer pouco tempo para executar (1 hr), e é um método analítico mais conservadora para caracterizar a proliferação celular ou tendências metabólicos, em comparação com a avaliação histológica, o que requer o sacrifício terminal do andaime repovoados. O ensaio de resazurina perfusão também pode ser adaptado para a avaliação das populações de células durante o crescimento dentro de outro receórgãos ou tecidos llularized.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank the support of the Zell Family Foundation. We recognize support from the Northwestern Memorial Foundation Dixon Translational Research Grants Initiative, the American Society of Transplant Surgeon’s Faculty Development Grant, and a Research Grant for the Young Investigator from the National Kidney Foundation of Illinois. We acknowledge support from the Robert R. McCormick Foundation. This work was also supported by NIDDK K08 DK10175 to J.A.W. Imaging and histology cores used for this research is supported by the Mouse Histology and Phenotyping Laboratory, Electron Probe Instrumentation Center (EPIC), and Simpson Querrey Institute Equipment Core at Northwestern University, and a Cancer Center Support Grant (NCI CA060553). The authors would like to acknowledge the Northwestern University Microsurgery Core for rodent kidney procurements. Evaluation of renal tubular epithelia morphology following recellularization conducted in the Fluorescence Microscopy Shared Resource supported by P30 CA118100.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCO | VWR | M143-4L | |
Sodium dodecyl sulfate solution, BioUltra, for molecular biology, 20% in H2O | Sigma-Aldrich | 05030 | |
Peracetic acid solution, purum, ~ 39% in acetic acid (RT) | Sigma-Aldrich | 77240 | Peracetic is flammable and corrosive. Prepare within a fume hood using appropriate personal protective equipment (e.g. gloves, goggles). |
200 proof ethanol | VWR | V1001TP | |
Sigmacote, siliconizing reagent for glass and other surfaces | Sigma-Aldrich | SL2 | For treatment of bioreactor reservoirs. Referred to in text as siliconizing reagent. |
DMEM/F12 media | Life Technologies | 11320-033 | |
Corning cellgro Fetal Bovine Serum Premium, Mediatech | Corning | 35-010-CV | |
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X 10,000 I.U. Penicillin 10,000 µg/mL Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
TrypLE Express (1X), Phenol Red | Life Technologies | 12605-028 | Referred to in text as cell dissociating enzyme. |
Trypan Blue Stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
Resazurin sodium salt | Sigma-Aldrich | R7017 | |
Equipment: | |||
Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VAC | Cole-Parmer | EW-07522-20 | |
Masterflex L/S large cartridges for 07519-05 and -06 pump heads. | Cole-Parmer | EW-07519-70 | Referred to in text as large pump cartridge. |
Masterflex L/S 8-channel, 4-roller cartridge pump head. | Cole-Parmer | EW-07519-06 | |
Straight 6" specimen forceps, serrated | VWR | 82027-438 | |
*Kidney perfusion bioreactor | WilMad Labglass | *Custom designs | Bioreactors are produced as described by WilMad Labglass. The designs have been described in depth in a previous publication. |
Perfusion Circuit Components | |||
24 G x 0.75 in. BD Insyte Autoguard shielded IV catheter (0.7 mm x 19 mm) made of BD Vialon biomaterial. Has notched needle. (50/sp, 200/ca) | BD Biosciences | 381412 | Referred to in text as 24 gauge catheter. |
Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25' | Cole-Parmer | HV-06508-14 | Referred to in text as peristaltic pump tubing. |
Peroxide-Cured Silicone Tubing, 1/16" ID X 1/8" OD, 25 ft/pack | Cole-Parmer | HV-06411-62 | Referred to in text as 1/16" ID silicone rubber tubing. |
Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 14, 25 ft. | Cole-Parmer | HV-96410-14 | Referred to in text as thick-walled 1/16" ID silicone rubber tubing. |
VWR Silicone Tubing, 1/4" ID x 0.5" OD | VWR | 89068-484 | |
Acro 50 Vent Filters, Pall Life Sciences | VWR | 28143-558 | Referred to in text as 0.2 micron vent filter. |
Cole-Parmer Luer Adapters, Male Luer Lock to 1/8" ID, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | T-45505-11 | Referred to in text as male Luer lock to 1/8" barbed adapter. |
Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Plug, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45505-58 | |
Female luer x female luer adapter, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-22 | Referred to in text as female Luer x female Luer adapter. |
Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-28 | |
Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L - 3-Way Hi-Flo Stopcock with Extended Male Luer Lock, Non-DEHP Formulation, Latex Free (LF), Lipid Resistant, Non-PVD, 50/cs | Careforde Healthcare | 10254821 | Smiths Medical (vendor) catalogue number is #MX4311L. |
Other Components | |||
5 ml BD Luer-Lok disposable syringe with BD Luer-Lok™ tip. | BD Biosciences | 309646 | |
35 mm x 10 mm Easy Grip Culture Dish | BD Biosciences | 353001 | Used to draw cell suspension into syringe for cell seeding. |
An erratum was issued for Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development.
The human RCTEC/RCTE cell stocks used here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 were originally provided by Dr. Loghman-Adham (then at St. Louis University) to co-author Dr. Wandinger-Ness (University of New Mexico) through an MTA in 2001. The SV40 immortalized human RCTEC/RCTE cells were characterized as being of distal tubule cell line as detailed in Loghman-Adham et al., 2003. On the basis of recent short tandem repeat (STR) DNA sequencing (Performed by IDEXX BioResearch) of the earliest passages of the RCTEC/RCTE cell stocks it became evident the cells were of mixed lineage. Further analyses of PCR products using QIAxcel capillary electrophoresis demonstrated the presence of a canine product. The product was sequenced and established to be of canine origin. A set of canine specific STR markers were compared to the sample and showed that the sample had a genetic profile with 92% identity to the MDCK cell line. Later cell stocks that were used in the present publication were STR profiled and showed drift to 100% MDCK lineage. Despite being of canine origin, rather than human as was previously thought, MDCK is similarly a distal tubule epithelial cell line. For this reason, previous interpretation and conclusions drawn using these cells here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 remain sound, but for purposes of rigor, reproducibility and experimental validation by others we report on this misidentification. This information will also be reported for listing on the International Cell Line Authentication Committee (ICLAC) database (http://iclac.org).
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