상피 세포 다시 채우기 및 신장 조직 개발을위한 설치류 세포 외 기질 비계의 준비

This protocol describes decellularization of Sprague Dawley rat kidneys by antegrade perfusion of detergents through the vasculature, producing acellular renal extracellular matrices that serve as templates for repopulation with human renal epithelial cells. Recellularization and use of the resazurin perfusion assay to monitor growth is performed within specially-designed perfusion bioreactors.

이 프로토콜은 무 세포, 장기 스케일 조직 개발 소규모 모델 기판으로서 유용하다 아직 biofunctional, 신장 세포 외 기질 (ECM) 비계의 발생 사항​​. 스프 라그 돌리 래트 신장이 손상으로 그대로, 전체 신장 골격을 유도하기 26 시간에 걸쳐 신장 동맥에 도관을 삽입하여 캐 뉼러와 저농도의 세제 (트리톤 X-100 및 소듐 도데 실 설페이트 (SDS))의 일련의 관류 관류 혈관, 사구체, 신장 세뇨관. 탈세 포화 후, 신장 지지체는 주문 설계된 관류 생물 반응기 용기 내부에 배치되고, 신장 동맥 카테터 이루어진 관류 회로에 연결되어 연동 펌프; 튜브; pH를, 용존 산소, 압력에 대한 옵션 프로브를. 아세트산 및 에탄올의 pH (7.4)를 분산과 발판 살균 후 신장 지지체는 내 larg의 배지로 관류 시드 제조전자 용량 CO _{2 인큐베이터를} 37 ℃로 유지하고 5 %. 천만 신피질 관상 상피 (RCTE) 세포 생리 레이트 흐름을 감소하기 전에 15 분 동안 고 유량 하에서 지지체 (25 ㎖ / 분) 압력 (~ 230 mmHg로)를 통해 신장 동맥을 통하여 주입, 급속 관류 (4 ㎖ / 분). RCTE 세포는 주로 신장 피질 내에서 관 ECM 틈새를 채우는 확산 및 관류 문화 7 일 동안 관 상피 구조를 형성한다. 배지에서 44 μM의 레사 주린 용액 중에 세뇨관 세포 생존 및 증식 형광, 레 독스 계 대사 평가를 제공하기 위해 교환 매질 중에 1 시간 동안 신장을 관류한다. 신장 관류 생물 반응기는 생화학 적 평가를 위해 매체의 비 침습적 샘플링을 허용하고, 여러 입구 포트는 신장 정맥 또는 요관을 통해 대안 역행 파종 할 수 있습니다. 이러한 프로토콜은 신장과 골격을 recellularize하는데 사용될 수있다이 시스템 내에서 신속한 평가를위한 혈관 내피, 관 상피와 기질 섬유 아 세포를 포함한 세포 유형의 다양한.

말기 신부전을 앓고있는 환자의 수는 계속 증가 같이, 이식 가능한 도너 신장의 수가 증가하고 심각한 부족이있다. 후보자의 지속적 증가 수의 수요를 충족 할 수없는이 신장 이식을 위해 상장 기다립니다 수요 ^{1, 2에} 이식 신장 이식을 사용자 정의 개발하는 궁극적 인 목표와 신장 장기 공학 연구를 묻는 메시지가있다. 환자 자신의 세포에서 작동 신장 조직을 구축하면, 평생 면역 억제에 대한 필요성을 제거 환자 신장 이식을 기다리고 투석에 소요되는 시간을 감소시키고, 만성 신장 질환을 가진 더 많은 환자에 구명 이식을 연장한다.

환자 유래의 세포를 사용하여 신장 조직 생명 공학 첫 걸음 신장 실질위한지지 기판으로서 기능하는 지지체를 개발하는 것이다 (예를 들어 관형 epithelial), 기질 섬유 아세포, 혈관 세포 성장. 자연 장기 세포 외 기질 (ECM들)에서 유래 생체 재료 지지체는 천연 생체 조성를 포함한 조직 공학에 사용하기에 바람직 수있는 여러 가지 특성을 가지고; 적절한 거시 및 미세 생리 학적 기능을 부여하는 단계; 휴대 생체 적합성, 세포 부착, 이동, ^{3 개조} 건설적인 조직을 홍보. 신장 조직 재생 용 지지체를 제조하는 유망한 방법은 신장 ECM ^(4)의 복합 천연 단백질 조성물의 대부분을 보존 기관의 고유의 구조적 복잡함을 유지하고, 상향식과 관련된 어려움을 극복 동종 또는 이종 신장의 탈세 포화를 통해 비계 recellularization ⁵ 후 개발 세포에 혈관 공급을 제공함으로써 두께 cellularized 조직 공학입니다.

관류 탈세 포화는 과정에있다이는 세제, 효소, 또는 다른 세포 방해 솔루션은 균일 기관 ^(6)의 혈관 네트워크를 통해 전달됩니다. 이 전략은 폐기 인간의 신장 ^(9)에서 무 세포 신장 템플릿의 개발에 의해 입증, 전체 기관 공학 ^6-8 생물학적 템플릿 (3D) 입체로 무 세포 기관 기반의 ECM 발판을 유도 할 수있는 효율적인 프로세스로 설립되었습니다 대형 동물 (예 : 돼지 ^10, 염소 ^11)과 설치류 소스 ^{(12)로부터} 얻은 이종 신장. 특히, 설치류 등의 작은 동물 모델의 사용은 더 적은 세포 및 줄기 세포 유래의 조직의 경우와 같이, 세포 수는 일반적으로 제한되는 장기 recellularization 연구에 특히 유용 배지를 필요로한다. 탈세 포화 기재된 프로토콜의 목적은 신장 structur의 재생을 위해 3D 발판 시스템으로 사용할 수 무 세포 신장 ECM을 생성한다인간의 신장 피질 관 상피 (RCTE) 세포와 본 실시 예에 다시 채워되는 네프론의 세관을 포함, ES. 우리는 이전보다 빠르다 최적의 세제 기반 쥐의 신장 탈세 포화 프로토콜 ^(7), 이전에보고 된 다른 방법보다 (약 일)의 엄격한 평가를 설명 (로스 등 .- 오일 ^(12), 노래 등 .- 4.5 일 ^13), 및 앞서보고 ^12-15보다 탈세 포화 중에 변성제 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)의 상당히 낮은 농도 (0.1 %)로 장기를 공개한다.

연구의 제한된 수의 세포 다시 채우기위한 3D 발판으로 탈세 포화 이후 사용 쥐 신장의 사용을 설명했다 ^12-16 (다른 ¹ 검토). 이 프로토콜에서는, 우리는 무 세포 신장 지지체를 제조하는 우리의 이전에 설립 된 최적의 탈세 포화 전략에 대한 자세한 설명을 제공스프 라그 돌리 쥐의 신장 ^7. 이중 파종 및 유지 보수 관류 문화 ⁽¹⁷⁾ 할 수있는 맞춤 디자인 관류 생물 반응기를 사용하여, 우리는 지속적으로 이러한 탈세 포화 행렬에 관 구성 요소를 다시 채울 증식하고, 주일 이상 관류 문화에서 살아 남기 인간 RCTE 세포와 무 세포 신장 발판을 recellularize. ⁽¹⁷⁾ 연구 이전에 세포 독성에 사용되는 비용이 들지 않는, 세포 독성, 비 침습적 대사 평가 - - 시간 ⁷ 위에 recellularized 신장 내 세포 생존 및 증식의 표시를 제공하기 위해 우리는 더 레사 주린 관류 분석의 우리의 사용을 보여줍니다.

윤리 선언문 : 동물과 관련된 모든 절차는 노스 웨스턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 지침에 따라 수행 하였다.

1. 신장 탈세 포화

1. 탈세 포화 솔루션을 준비합니다. 각각의 신장을위한 시약의 다음 볼륨을 준비는 탈세 포화, 더하기 하나는 추가 볼륨합니다 (예를 들어, 4 신장을위한 단계 1.1.3 5,000 ml의 트리톤 X-100을 준비합니다.)
   1. (500)는 삼투 물 (ROH ₂ O)를 역 ㎖로 준비합니다. 주 : 대안 적으로, 탈 이온수 ROH ₂ O가 표시된 단계에서 사용될 수있다.
   2. ROH ₂ O. 1000 mL의 트리톤 X-100, 1 % (V / V)를 준비 천천히 추가 10 ml의 트리톤 X-100 볶음 접시에 신속하게 교반하면서 큰 비커에 물 ml의 990. 시약이 완전히 용해 사용하기 전에 (적어도 10 분)을 허용합니다.
   3. 1,000 ml의 트리톤 X-100을, 1 % 준비 (v / v)의 ROH ₂ O (9월arate 볼륨).
   4. 1000 mL의 도데 실 황산나트륨 (SDS), 0.1 % (v / v)의 ROH ₂ O. 준비 천천히 저어 접시에 고속 교반 큰 비커에 995 ml의 물에 5 ml의 SDS (20 % 원액)를 추가합니다. 시약 사용 (최소 10 분) 전에 균일하게 혼합 할 수 있습니다.
   5. 500 ml의 ROH ₂ O (별책)를 준비합니다.
2. 탈세 포화를 위해 신장을 준비합니다.
   1. 이전에 ⁷ 설명한 바와 같이 남성 스프 라그 돌리 쥐 (250-300g)에서 신장을 복구 할 수 있습니다.
      1. 펜토 바르 비탈의 복강 내 주사 (50 mg / kg 체중)로 쥐를 마취. 자주하는 수술 중 호흡 기능, 심장 박동, 발가락 핀치 반응을 모니터링하여 마취의 깊이 (매 10 ~ 15 분)을 검사합니다. 동물이 상승 호흡률 또는 포지티브 페달 반사가 있으면, 펜 토바 비탈 (초기 투여 량의 1/4와 1/3) 보조 용량을 관리.
      2. 길이 방향의 중간 선 abdomina를 수행L 절개는 신장, 복부 대동맥 및 하대 정맥을 노출.
      3. USP 헤파린 2000 단위 / 음경 정맥에 체중 kg을 주입한다.
      4. 부드러운 절개하여 양쪽 신장을 동원. 그대로 신장 주변의 신장 캡슐을 유지하면서 조심스럽게, perirenal 지방에서 신장을 분리합니다. 적외선 신장 복부 대동맥을 통해 차가운​​ 식염수 (10 ㎖)과 신장 관류.
   2. 단단히 동맥에 카테터를 결찰, 부드럽게 10 ml의 차가운 인산 완충 식염수 (PBS) 혈액의 완전히 명확 기관에와 신장 관류 (주사기를 사용하여), 신장 동맥에 24 게이지 카테터를 삽입합니다.
   3. 점차적으로 탈세 포화 될 때까지 저장 (하여 세포 용해를 유도) 기관을 동결 -20 ℃ 냉동고에 페트리 접시와 장소에서 25 ml의 PBS에서 신장을 빠져.
      참고 : 원하는 경우 생에 설명되지 않지만, 요관 및 / 또는 신장 정맥도, 역행 시드 유관 될 수있다의 프로토콜입니다.
   4. 완전히 (실온 (RT)에서 평형화) 냉동 신장을 해동, 부드럽게 누출 결찰 신장 동맥을 확인하기 위해 PBS의 10 ㎖로 관류. 누수 또는 상당한 저항이 관찰되는 경우, 신장 동맥 재 카테 테르를 꽂다.
3. 탈세 포화를 위해 장비를 준비합니다. 도 1b에 도시 된 바와 같이 탈세 포화 관류 시스템을 조립합니다.
   1. 1/16 "내경 (ID) 실리콘 고무 튜브 (그림 1D, H)의"(권장> 36)이 충분한 길이로 연동 펌프 튜브의 길이 (그림 1D, F) "한 팔을 연결합니다. 루어는 튜브의 세그먼트 (그림 1D, J)에 가입하는 여성 루어 어댑터를 X 한 여성에 의해 결합 1/8 "가시 어댑터에 두 남성 루어 잠금 장치를 사용합니다. "철 어댑터 1/8 추가적인 남성 루어 로크를 삽입 (도 1D, c) 신장에의 부착을위한 관류 라인의 하류 단부에동맥 카테터.
   2. 큰 펌프 카트리지를 사용하여 4 롤러 펌프 헤드에 각각 연동 펌프 튜브 세그먼트를 연결합니다.
   3. 최초의 솔루션 저수지에서 (ROH ₂ O)를 실리콘 고무 튜브의 상류 끝을 배치 한 후, 용액을 완전히 프라임 각각의 관류 회로 "프라임"버튼을 누르고 있습니다. CRITICAL : 기포가 튜브에 포획되지 남아 있는지 확인하고 상류 단부도 1b에 도시 된 바와 같이, 시약 저장조의 액체 - 공기 계면 아래에 고정되는 실리콘 고무 튜브 (왼쪽 열려 유체를 그릴) 있음.
4. RT ^7에서 탈세 포화 프로토콜을 수행합니다.
   1. 기포는 카테터에 포획되지 않도록 보장 펌프로부터 하류의 관류 회로 튜브의 단부에 각각 해동 신장 신장 동맥 카테터를 연결한다. 신장 빈 5 L 비이커 (관류 수집 용기의 내부 벽을 따라 정지 할 수 있도록, 볼도URE의 1B)가되도록 신장 동맥 꼬임 또는 코일이 아니다.
   2. 5 ml / 분에 펌프 구동을 조정하고 "시작"버튼을 누릅니다. 각각의 신장은 기관의 바닥에서 솔루션 물방울을 관찰하여 관류되어 있는지 확인합니다.
   3. 도 1a에 기술 된 바와 같이 다음과 같은 시약으로 각각 신장을 관류
      1. 1 시간, 40 분 / 5 ml를 500 ml의 ROH ₂ O와 분을 관류.
      2. 3 시간, 20 분 / 5 ml의 1,000 ml의 1 % 트리톤 X-100 분 관류.
      3. 16 시간, 40 분 / 1 ml의 1,000 ml의 1 % 트리톤 X-100 분 관류.
      4. 3 시간, 20 분 / 5 ml의 1,000 ml의 0.1 % SDS와 분을 관류.
      5. 1 시간, 40 분 / 5 ml를 500 ml의 ROH ₂ O와 분을 관류.
         주 : 각 탈세 포화 된 신장은 사용 전에 2 주 최대 4 ℃에서 50 ㎖ 원뿔형 튜브 (무첨가) PBS에 저장 될 수있다.

2. 당Recellularization에 대한 융합 생물 반응기 조립, 신장 살균 및 준비

1. 생물 반응기 용기를 준비합니다.
   1. 접시 세제 솔루션 (예. 수돗물을 1 % 접시 세제) 희석, 따뜻한와 유리 생물 반응기 저수지 (신체 구성 요소) 및 생물 반응기 헤드를 세척 한 후 수돗물과 ROH ₂ O 깨끗이 씻어 구성 요소가 완전히 건조하도록 허용합니다.
   2. 각 저장조의 바닥에 시약을 siliconizing의 작은 부피 (~ 5 ㎖)을 적용한다. 과량의 유체를 배출, 몇 초 정도의 바닥 전체 표면을 적시 지 확인하는 시약.
   3. 저수지는 RT O / N에서 흄 후드에 건조하도록 허용합니다. 대안 적으로, 저수지 건조를 신속하고 유리 생물 반응기 저장조의 바닥에 세포의 부착을 방지하기위한 것이다 코팅의 내구성을 향상시키기 위해 30 분 동안 100 ° C의 오븐에서 건조 될 수있다.
2. 멸균 관류 회로 부품을 준비 (도1D).
   1. (각 생물 반응기에 대한) 튜브의 다음과 같은 길이를 잘라 :
      1. ID 실리콘 고무 튜브 (그림 1D, H)이 25 "1/16의 길이를"잘라.
      2. 연동 펌프 튜브 중 하나 8 "길이 절단 (그림 1D를, F).
      3. ID 실리콘 고무 튜브 하나 4.25 "1/16의 길이"를 잘라.
      4. ID 실리콘 고무 튜브 (도 1D, g)는 두 개의 1 "두꺼운 벽의 길이를 1/16"잘라.
      5. 1/4 '(내경) x 0.5'외경 (OD) 실리콘 고무 튜브 (그림 1D, E) 중 하나 2 "길이를 잘라.
   2. (각 생물 반응기의 경우) 다음 루어 어댑터를 준비합니다
      1. 1/8 '가시 어댑터 (10) 남성 루어 잠금을 준비합니다 (그림 1D, C)
      2. 이 남성 루어는 플러그 준비 (그림 1D,)
      3. 이 암형 루어 캡 준비 (도 1D를, b)
      4. (5) 여성 루어 준비X 여성 루어 어댑터 (X5도 1D, D)
   3. 따뜻한 모든 튜브와 루어 어댑터를 씻어 접시 세제 솔루션을 희석, 수돗물에 깨끗이 씻어 다음 ROH ₂ O,하고 건조 할 수 있습니다.
3. 관류 회로를 조립합니다.
   1. 슬립 1 "생물 반응기의 머리에 부착 된 입구 루어 수용체 이상 두꺼운 벽 1/16 'ID 실리콘 고무 튜브의 길이. 튜브의 오픈 엔드에 1/8 "ID 바브 어댑터 남성 루어 잠금 장치를 놓습니다. 다른 입구 루어 수용체에 대한 반복 한 포트 (이 프로토콜에 설명되지 않은 요관 또는 정맥 파종 기술을위한)를 봉쇄하기 위해 여성 루어 캡을 연결합니다.
   2. 1/8 '의 ID 미늘과 여성의 루어 X 여성 루어 어댑터 (그림 1D, J)에 남성 루어 잠금 장치를 사용하여 연동 펌프 호스의 8 "세그먼트 ID 실리콘 고무 튜브 각 25"1/16의 세그먼트를 "연결합니다.
   3. 실리콘 고무 tubin 중 하나 열린 끝을 연결합니다생물 반응기 헤드의 외부에 미디어 관류 콘센트에 들어. 생물 반응기 헤드의 내부에 미디어 관류 배출구 반대측 (내측) 측으로 ID 튜브 4.25 "길이의 1/16"를 연결한다.
   4. 관류 회로 튜브의 나머지 열린 끝에 1/8 'ID 가시 어댑터에 남성 루어 잠금 장치를 연결합니다. 여성 루어가 남성 루어 잠금 여성 루어 어댑터를 X 연결합니다. 여성 루어는 생물 반응기에 유입 루어 수용체로 이어지는 오픈 남성 루어 잠금 여성 루어 어댑터를 X 연결합니다. 이 카테터 신장 동맥에 직접 최고의 미디어 관류 입구 역할을합니다.
   5. 생물 반응기 뚜껑에 어떤 포트가 열려하거나 노출되어 있는지 확인합니다. 단단히 생물 반응기 본체의 진공 밸브를 닫습니다.
   6. 각 구성 요소를 안감 동일한 홈 사이에 끼워 O 링과, 저수지 몸 생물 반응기 헤드를 장착한다. 함께 두 가지 구성 요소를 개최 인터페이스를 통해 금속 클램프를 놓습니다.
   7. 1/4 'ID 0.5 X'OD 실리콘 고무 튜브 (도 1D, E)의 2 "의 길이를 사용하여 두 구성 요소를 연결하는 통기 0.2 미크론 필터로 생물 반응기 헤드에 통기구를 장착한다. 배기 밸브를 엽니 다.
   8. 약간 생물 반응기의 머리에 빨간색 스크류 캡을 풉니 다.
   9. 오토 클레이브 파우치와 실의 나머지 루어 어댑터 및 6 "톱니 모양의 표본 집게를 놓습니다.
4. 조립 된 생물 반응기 및 남성 루어 플러그를 압력솥.
5. (볼륨이 탈세 포화 신장별로 나열되어 있습니다) 파종하기 전에 발판 살균 및 매체 관류에 대한 다음과 같은 시약을 준비합니다 :
   1. 흄 후드 내에서, 1 L 병 ~ 957 ml의 ROH ₂ O에 2.56 mL의 아세트산 용액 (39 % 스톡 농도) 40 mL를 200 증명 에탄올을 첨가하여 50 ml의 0.1 % 아세트산, 4 % 에탄올 용액을 제조 하였다. 반복적으로 반전 병에 의해 철저하게 믹스, 생물 안전 캐비닛에 넣습니다.
   2. 준비1X PBS 용액 150ml를, 오토 클레이브에 의해 미리 멸균.
   3. 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 된 50 ml의 DMEM / F12 배지와 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 (PEN-연쇄상 구균)을 준비한다.
6. 관류 생물 반응기 조립 나머지 항목을 수집합니다. 생물 안전 캐비닛에있는 모든 항목을 놓습니다. 긴급 : 생물 안전 캐비닛이 디지털 펌프 구동 전력을 전기 소켓 작업 장착되어 있는지 확인합니다. 또한, 캐비닛 외부에 외부 전기 소켓에 펌프 드라이브를 연결하는 연장 코드를 사용합니다.
   1. 탈세 포화 된 신장을 수집합니다.
   2. 첨부 관류 회로와 멸균 된 생물 반응기를 수집합니다.
   3. 루어 어댑터와 집게를 포함하는 멸균 된 파우치를 수집합니다.
   4. 첨부 4 롤러 머리 디지털 펌프 드라이브, 대형 펌프 카트리지 (관류 회로 당 1)를 수집합니다.
7. 멸균 C 하에서도 1C에 기술 된 바와 같이 관류 회로를 완성생물 안전 캐비닛 내의 onditions.
   1. 1/8 '미디어 관류 입구 근처 ID 바브 어댑터와 암형 루어 X 암형 루어 어댑터에 수형 루어 로크간에 3- 방향 정지 콕 (도 1D, i)를 연결한다. 스톱 콕 열려있는 모든 세 개의 포트를 남겨주세요.
   2. 생물 반응기의 머리와 피펫 0.1 % 초산 50 ㎖, 구멍을 통해 중간 저장소에 4 % 에탄올 용액에 빨간색 스크류 캡을 제거합니다.
   3. 큰 펌프 카트리지를 사용하여 펌프 헤드에 연동 펌프 튜브 세그먼트를 연결합니다. 5 ml / 분, 프레스 "시작"에 유량을 조정하고 총리에 회로를 할 수 있습니다.
      1. 액체 관류 라인을 채우고 삼방 스톱 콕의 나머지 열린 포트에 도달하면, 수형 루어가 (도 1D,)를 이용하여 플러그 포트 플러그.
      2. 공기가 관류 회로 튜브 또는 입구 루어 수용체의 내측에 관찰되지 않을 때까지 회로가 완전히 허용 프라임. 만약 necessaRY, 관류 라인으로부터 기포를 배출하기 위해 일시​​적으로 유량을 증가시킨다. 완벽하게 준비하는 경우, 펌프 구동을 중지합니다.
   4. 조심 멸균 6 "집게를 사용하여 바이오 리액터 헤드의 내면에 수형 루어 입구 수용체로 신장 동맥 카테터의 암형 루어 단부 플러그. 확인 연결이 꽉과 공기가 카테터에 남아 있지 않은지 확인합니다. 신장 동맥이 비틀거나 꼬임하지 않도록 신장 부드럽게, 신장 동맥 카테터에서 정지 할 수 있습니다.
   5. 생물 반응기 탱크가 밀봉되도록 생물 반응기의 머리와 몸을 함께 들고 금속 클램프를 조입니다. 생물 반응기의 머리에 빨간색 스크류 캡을 닫습니다.
8. 5 ㎖ / 분에서 50 mL의 PBS로 실온에서 1 시간 동안 / 5 ㎖에 0.1 % 아세트산, 4 %의 에탄올 용액으로 관류하여 다음 세 개의 연속 한 인사를 관류 분 RT에서 신장 멸균.
   1. 솔루션을 변경 :
      1. 1 시간 후, 펌프를 중지하고 빨간색 스크류 캡을 엽니 다. 인트를 사용하여화나게 (멸균) 파스퇴르 피펫 신중 생물 반응기 저장소로부터 용액 모두 대기음. 완벽하게 준비하는 관류 회로를 남겨주세요.
      2. 피펫 생물 반응기 저수지에 신선한 용액 50 ㎖를, 나사 캡을 닫고 펌프를 시작합니다.
9. 10 % FBS, 1 % 스트렙토 펜이 보충 된 50 mL의 DMEM / F12 배지에서 저장조와 피펫 PBS 최종 헹굼, 흡 후 PBS. 스크류 캡을 닫고 37 ℃, 5 % CO _2로 유지 대용량 배양기에 부착 된 관류 회로 생물 반응기를 전송합니다.
10. 필요한 경우, 인큐베이터에 펌프 구동을 전송합니다. 펌프에 생물 반응기 관류 회로를 연결하고 이전에 파종 적어도 1 시간 / 분 4 ml의에서 신장 관류.

신장 피질 관 상피 세포 3. 신장 Recellularization

1. DMEM / F12의 따뜻한 충분한 볼륨과 C (10 % FBS, 1 % 펜 연쇄상 구균 보충)ELL 37 ° C의 셀 리프팅을위한 효소를 해리. 제안 된 볼륨은 다음과 같습니다 :
   1. 10 ml의 세포 해리 효소 및 리프팅 175cm ² 문화 플라스크 당 10 ml의 DMEM이 / F12를 준비합니다.
   2. 신장 당 5 ~ 10 mL를하는 DMEM / F12를 준비하는 씨앗을 품고있다.
2. 원하는 농도 시딩 배양 플라스크의 충분한 수를 수집 (4 × 10 ^7은 본 시딩 전략을 사용 RCTE 세포의 생착 최대 신장 결과 당 ¹⁸ RCTE 인간 세포 불멸화).
3. 세포 해리 효소를 사용하여 플라스크로부터 세포 리프트. 플라스크에서 대기음 매체는, 다음 플라스크에 10 ml의 세포 해리 효소를 피펫. 37 ° C의 인큐베이터에 넣어 플라스크 해리를 촉진합니다.
4. 플라스크 표면으로부터 세포의 완전 분해가 관찰 될 때까지 위상차 현미경에 매 2 분 플라스크를 확인한다. 주의 : 항온 처리 시간은 세포의 합류의 수준에 따라 다양하지만 RCTE 세포 R은 것equire 약 15 분 완전히 해리합니다.
5. 펠렛 전에 카운트 해리 세포 현탁액의 샘플을 가져 가라. 5 분 동안 232 XG 상대 원심력 (RCF)에 동등한 미리 예열 DMEM / F12 배지의 부피, 원심 분리로 세포 현탁액을 희석.
6. 원심 분리하는 동안 세포를 계산합니다. 카운트하는 hemacytometer의 각 끝으로 동일한 트리 판 블루의 볼륨 및 피펫 10 μL로 얻어진 샘플을 희석. 원하는 시드 농도 (2 × 10 ⁷ 세포 / ㎖)를 수득하는 데 필요한 펠릿 희석 부피를 계산한다.
7. 원심 분리 후, 2 × ¹⁰⁷ 세포 / ㎖의 최종 농도를 얻기 위해 배양액의 적당한 부피를 희석 펠릿. 멸균 5 ML의 주사기로 접종 현탁액 2 ㎖를 그립니다.
8. 생물 안전 캐비닛에 관류 생물 반응기를 전송합니다. 시드 포트에 흐름을 닫습니다 꼭지 밸브를 돌립니다. 에서 남성 루어 슬립 플러그를 분리꼭지, 그리고 시드 서스펜션로드 주사기를 연결합니다.
9. 빨리 다시 인큐베이터에 관류 회로를 전송하고, 펌프 헤드에 연동 펌프 튜브 세그먼트를 고정 큰 펌프 카트리지를 사용한다.
10. 셀 시드 : 펌프 향하고 스톱 콕 밸브 포트를 닫습니다. 천천히 전체 현탁액 콕 및 관류 라인에 주사기로부터 전송되는 것을 보장하는, 신장에 세포 현탁액을 주사. 주사기에서 흐름을 닫고 15 분 동안 25 ml / 분에 펌프를 시작 꼭지 밸브를 돌립니다.
11. 15 분 후, / 분에 4 mL의 펌프 유량을 저하. 교환 매체 (100 ㎖의 후속 변경의 볼륨) 다음 날 및 그 이후 매 2 일입니다.

레사 주린 관류 분석을 사용하여 4. 세포 생존 능력의 평가 및 확산

1. 레사 주린 시약을 준비합니다. 교반하면서 100 ml의 PBS에 110.5 mg을 레사 주린 나트륨 염을 녹여 5 mL를 추가하여 희석 1:10신선한 PBS 45 ml의 솔루션을 생성하는 것은 440 μm의 레사 주린 주식 솔루션을 만들 수 있습니다. (0.2 μm의 주사기 필터를 사용하여) 필터 - 멸균하고 4 ℃에서 광의로 보호 된 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 원액을 저장한다.
2. 레사 주린 - 보충 미디어 컨트롤을 준비합니다. 배지에서 레사 주린 시약의 10 % 용액을 제조 (예. 원액 + 45 ml의 배지를 레사 주린 5 ㎖) 용액을 만드는 작업 레사 주린. 광 보호 용기 레사 주린 작업 용액의 10 mL의 부피를 압력솥. 참고 :이 완전히 레조 루핀 (resorufin)에 레사 주린 화합물을 감소하고, 퍼센트 레사 주린 감소를 계산하기위한 긍정적 인 제어 역할을합니다.
3. 나누어지는 1 ml를 레사 주린 작업 용액 (산화)의 각각 별도의 1.5 ml의 수집 튜브에 혼자 (공백) 솔루션 (감소), 문화 매체를 작업 레사 주린 멸균. 관류 생물 반응기와 같은 인큐베이터에서 열린 튜브를 놓습니다.
4. 신장 관류 이동생물 안전 캐비닛에 인큐베이터에서 회로. 파스퇴르 피펫을 사용하여 생물 반응기 저수지에서 생물 반응기의 머리에서 스크류 캡 및 흡인 배양 배지를 제거합니다.
5. 피펫 (10) 저수지, 가까운 스크류 캡으로 솔루션을 작업 레사 주린 ml의, 다시 인큐베이터에 신장 관류 회로를 전송합니다.
6. 4 ml / 분에 펌프를 시작하고 시약은 정확히 1 시간 동안 신장을 통해 관류 할 수 있습니다.
7. 1 시간 후, 펌프를 중지하고 생물학적 안전 캐비닛 신장 재관류 전송 회로.
8. 조절 된 (부분적으로 감소) 레사 주린 용액을 수집하고, 생물 반응기 저장조에 100 ml의 배양 배지를 추가한다. 전송 관류 회로는 인큐베이터, (4 ㎖ / 분)의 흐름을 다시 시작합니다.
9. 피펫 100 μL (× 3 회 반복) 솔루션을 작업 레사 주린, 솔루션을 레사 주린 조절 솔루션을 작업 멸균, 문화 미디어 (불투명 한) 블랙에 빈 96 웰 분석 플레이트. (excitat 형광 강도 읽기이온 : 35분의 540; 방출 : 20분의 590) 분광 광도계를 사용하여.
10. 산화 레사 주린 매체에 의해 생성 된 형광 강도 (FI)에 의해 정규화 된 형광 강도의 비율 퍼센트 감소를 계산한다 (ORM을, 또는 해결책을 세포에 노출되지 않는 작업 레사 주린) 또는 매체 레사 주린 감소 (RRM, 또는 용액 작동 멸균) %를 감소 = 100 × {[FI (조절 레사 주린 용액) - FI (ORM)] / [FI (RRM) - FI (ORM)]}. 결과를 정규화 배양 시간 (1 시간)에 의해 체적 (10 mL) 및 분할을 순환시킴으로써 % 감소를 곱.

신장 순차적 세제 용액을 물로 관류 희석 이전에 설정된 최적의 탈세 포화 프로토콜에 따라 (도 1a를 참조 B) ^(7)로, 26 시간에 걸쳐 점진적으로 더욱 투명하게 (트리톤 X-100, 0.1 % SDS 1 %) 도 2a에 도시. 그 결과 무 세포 신장 지지체는 세포의 결여이며, 관류 프로토콜 다음 손상되지 않은 그대로 신장 캡슐에 의해 지원 응집력 신장 ECM을 유지합니다. 최종 세제 관류 (SDS)에 의해, 신장의 혈관 네트워크는, 특히 interlobar 혈관이 눈에 띄게 네프론 세뇨관의 비교적 얇은 기저막 (상대 이러한 혈관의 큰 두께로 인하여, 탈세 포화 된 지지체에 표시되는 그림 2A, B)를 참조하십시오. 전체 기관은 사구체, 세관 및 COL의 손상 기저막 네트워크 뒤에 남겨두고, 기본 세포의 해제덕트 및 피질 interlobular 동맥의 내부와 외부 탄성 박판을 포함하여 탈세 포화 된 혈관의 ECM을 lecting (도 2B, C 참조). 큰 혈관 이외에, 사구체 내의 미세 혈관 기저막도 (도 2B, C 참조) 구조적 일체 성을 유지한다.

탈세 포화 된 신장 신장 ECM의 천연 가수 분해 열화를 제한하는 4 ℃에서 PBS에 저장되고, 탈세 포화 2 주 이내에 사용하여야한다. 우리는 이전에 흐름 ^(17)에서 자세히 recellularized 기관의 사용자 지정 관류 기반 모두 시드 탈세 포화 된 쥐의 신장 비계에 사용되는 신장 생물 반응기, 장기 문화의 디자인을 설명했다. recellularization 들어 관류 회로 소경 실리콘 고무 및 피로 저항성 PharMed 펌프 튜브 이루어지는는 연동 펌프에, 생물 반응기 저장소로부터 행 배지로 사용되며다시 신장 동맥 카테터 생물 반응기 헤드의 내면에 연결되는 입구 루어 수용체에 (도 1C 참조). 아세트산 / 에탄올 혼합물로 관류에 의해 탈세 포화 된 신장 살균 후 관류 시스템은 표준 배지 배양기 내의 지지체를 통해 (셀룰라 ECM의 밀착성을 향상시키기 위해 10 % FBS를 함유)를 순환시킴으로써 시드 수험 공부된다.

탈세 포화 된 신장은 지금 우리가 이전에 재관류 ⁷ 유도 만능 줄기 세포 유래 혈관 내피 세포를 사용하여 수행 한 recellularization에 관해서는 무 세포 ECM 템플릿을 제공 할 수 있습니다. 여기서 우리는 인간 유래 신장 피질 관 상피 (RCTE) 세포를 이용하여 세뇨관이 골격과 관류 생물 반응기 시스템의 유틸리티를 보여줍니다. RCTE 세포는 이전에 ^7을 설명 하였지만, 고압 관류 의정서 신동맥 통해 신장 골격으로 시딩주로 그들이 우선적으로 periglomerular 세관을 다시 채 웁니다 신장의 피질 영역이 방식으로 가정에서 주입 17 .RCTE 세포 (그림 3A 참조). 몇몇 세포는 1 일 후 파종에서 사구체 내 포함, 하루 7, 사구체 세포의 거의없는 상태이다. 관류 문화 동안, 매체는 레사 주린 관류 분석이 동시에 시간 (그림 3B 참조)을 통해 세포 생존 능력의 비교 평가를 제공하기 위해 수행되는 시점에서 매 2 일, 변경됩니다. 레사 주린 환원 결과가 지원, RCTE 세포는 3D ECM 내에 증식 단단히 조직 형성 날 (7)에 의한 특허 관형 구조체 이들 세포의 대부분은 전향 관류 배양 많은에게 7 일 후 신장 ECM의 피질 영역을 차지하고 있지만 RCTE 늘어선 세관은 외부 수질과 유두 세관 및 수집 덕트 (그림 4 참조)에 존재한다. RCTE 세포를 다시 채우기 및 당 일주일 후융합 문화, 투명성을 탈세 포화가 손실 다음 관찰하고 recellularized 신장이 불투명하고 기본 상태와 모양이 가까이 나타납니다 (그림 4 참조).

그림 1 :. 쥐 신장의 탈세 포화 시약 신장 탈세 포화 시스템 및 프로토콜 및 Recellularization 관류 회로 (A) 관류 일정. 탈세 포화, 체적 유량, 각 단계의 지속 기간 동안 사용될 시약 나타낸다. (B) 관류의 탈세 포화 설정. 탈세 포화 용액을받은 신장의 각 개별 흐름 라인을 통해 관류 수집 용기에 시약 저장소로부터 일방향으로 펌핑된다. 최대 네 개의 신장은 연동 펌프 당 탈세 포화 될 수 있습니다. (C) 관류 회로 FOR 파종 및 recellularized 신장 비계의 문화. 세포 루어 입구 수용체의 상류에 직접 연결된 주사기를 통해로드됩니다. 모니터링 압력, 용존 산소 ₍₂ DO), pH를위한 옵션 인라인 센서는 생물 반응기의 상류에 배치 될 수있다. 연동 펌프는 디지털 컴퓨터에 의해 제어 될 수 있고, 부압 (부압)이 요관 시드를 돕기 위해 적용될 수있다. (D)는 탈세 포화 구성 요소 (B) 및 recellularization (C)에 대한 관류 라인을 생성하는데 사용. 1/8 (a) 남성 루어 플러그, (b) 암형 루어 캡, (c) 남성 루어 로크 "철 어댑터, (d) 암형 루어 암형 루어 어댑터 (E) ¼"ID 실리콘 튜브 (F) 연동 펌프 튜브, g : 두꺼운 1/16 "ID 실리콘 고무 튜브, (H) 1/16"ID 실리콘 고무 튜브, (I) 삼방 코크, 조합함으로써 튜브 세그먼트를 연결하는 데 사용되는 (J) 커플러 을 사용하는 남성 루어 어댑터 (C) 두 개의 1/8 "미늘여성 루어 커플러 (D)에 여성 루어. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 :. 신장 탈세 포화의 대표 결과 대표 총 현미경 이미지는 신장 이전과 탈세 포화를 다음과 같다. 신장 받고 탈세 포화의 () 시간 경과 시리즈. 이미지는 지정된 각 시약과 관류하는 즉시 표시됩니다. 0.1 % SDS (도데 실 황산나트륨)의 관류 후, 보존 혈관 네트워크를 볼 수있다. (B)를 절단하고 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 염색을 기본 또는 탈세 포화 된 신장의 대표 이미지. 미세 기능을 포함 사구체 수집 덕트의 ECM 아키텍처, 혈관, 탈세 포화 다음 잘 보존되어있다. (C) 주사 전자 현미경은 사구체와 세뇨관 네이티브 (맨 윗줄)과 탈세 포화 (아랫 줄) 신장을 비교. 세포 제거 후, 열린 세관은 신장을 통해 널리 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 :. 탈세 포화 된 쥐 신장 인간의 신장 피질 관 상피 Recellularization의 대표 결과 신장은 주로 피질의 신장 세관에 RCTE 세포 유착을 초래 고압 전향 동맥 관류 기술을 통해 recellularized된다. 헤 마톡 실린 및 에오신 염색 histolo의 (A) 대표 고배율 이미지 (20X)recellularized 비계 1, 3, 또는 파종 후 7 일 학적 섹션. 최고 행은 세포가 전 신장 ECM 틈새 시장에 대한 선호를 나타내는, 동맥 혈관을 통해 주입되는에도 불구하고 periglomerular 관 공간을 차지 보여줍니다. 세포의 결여이다 루멘과 구 심성 세동맥에 노란색 화살표 점. 아래쪽 열은 RCTE 셀 1 주일 동안 세포 밀도가 증가함에 따라, 급증하고 단단히 포장 관상 상피 구조를 형성 피질 세관을 나타낸다. (B) 레사 주린 보충 된 배양 배지의 작은 (10 ㎖) 볼륨 미디어 변경시의 신장을 통해 재순환된다. 관류 60 분 동안 세포를 신장 내의 셀의 수에 비례하여 고도로 형광 신호를 생성 산화 레사 주린 화합물 (청색) 레조 루핀 (resorufin) 내지 (적색), 감소시킨다. 조직 학적 이미지 내에서 볼 세포 밀도에서 관찰 된 증가, 문화 팀 % 이상의 레사 주린 감소 증가와 일치세포 성장과 E, 정비 배양시 모두 세포 생존 및 증식의 비 침습적 표시를 제공한다. 결과는 평균 ± 표준 편차 (N = 4 recellularized 신장).로 표시되는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

. 그림 4 : 대표 결과 : 기본, 탈세 포화 및 Recellularized 신장의 비교 낮은 배율 조직 학적 이미지가 신장 피질을 보여, 탈세 포화 된 네이티브 신장 피질과 외부 수질과 수질 유두 지역 (맨 윗줄), (Decell 사이의 전이 영역; 중간 행), 7 일 RCTE-recellularized (7 일 Recell, 아랫 줄) 비계. 점선 (M을 신장 피질 (C) 및 외부 수질 사이의 대략적인 경계를 표시). 총 이미지 탈세 포화 다음 구매 후 네이티브 상태에서 신장, 및 신장 동맥을 통해 RCTE 세포의 파종을 다음 7 일 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

탈세 포화 기재된 프로토콜 일관 혈관 내피 세포 ^7,17 이외에 (근위 및 원위 세관 모두 유래) 인간 신피질 관상 상피 세포의 배양을위한 3 차원 템플릿 역할 완전히 무 세포 신장 ECM을 생성한다. 삽관 신장 맥관 따라서 관류 탈세 포화, 세포 시딩 장기 관류 배양하고, 레사 주린 관류 프로토콜을 가능하게 바이오 리액터 셋업 내의 지지체 걸쳐 시약 및 세포의 균일 한 전달을위한 주요 기능으로 기능한다. 이전에 장기 관류에 신장 동맥의 등, 적절한 삽관이 중요하고 특별한주의가 신장 동맥이 차단되거나 손상 및 카테터가 확보되어 있는지되지 않도록주의해야합니다으로. 혈관 내 혈전이 ㄱ 할 수 없기 때문에 신장이 회수되는 스프 라그 돌리 쥐 체계적으로, 장기 구매시 혈관 내 응고를 방지하기 위해 헤파린해야E는 제거하고, 신장의 전체 탈세 포화를 억제 할 수있다.

recellularized 신장의 관류 및 배양 접종에 사용 관류 생물 반응기는 ¹⁷ 동일계에서 여러 파종 방법을 허용하도록 설계된다. 여기에 설명 동맥 주입 기법 이외에, 세포는 카테터 요관 또는 신장 정맥 역행 통해 주입 될 수있다. (; 그림 1C를 참조 부분 진공), 요관 시딩에 대한 또한, 생물 반응기 본체는 부정적인 압력의 응용 프로그램을 허용하는 밸브가 장착되어 있습니다. 에 관계없이 사용되는 시드 전략, 신장 동맥을 통해 문화 매체 전향의 관류 적절한 영양 시드 세포 (예 : 산소, 포도당) 전달을 위해 중요하다.

설명 recellularization 프로토콜은 상피 세뇨관을 위해 특별히 템플릿 역할을 탈세 포화 신장 행렬의 우리의 사용을 보여줍니다. 그러나, 우리는 이전에이 쉬신장 매트릭스는 혈전을 방지하여 동물 모델에서 recellularized 신장 최종 장기 이식에 중요한 관찰되는, 유지 혈관 망의 재 내피 세포 형성지지 인간 유도 된 다 능성 줄기 세포 - 유래 내피 세포 늘어서 수 있다는 것을 자신 신장 혈관 ^(7)의 폐쇄. 대형 동물 신장 비계에 신장 recellularization 프로토콜의 최종 스케일 업에 대한 현재의 장애는 인간 크기의 신장 발판을 다시 채울 필요 세포의 실질적으로 더 많은 수입니다. 상술 한 바와 같은 고압 동맥 주입 기법 효율적 시딩 전략은, 결정적 탈세 포화 된 ECM 내에 생착 세포의 수를 최대화하기 위해 요구된다. 네이티브 신장의 이종 세포의 구성을 감안할 때, 여러 파종 방법은 궁극적으로 효과적으로 폐기물 수집 다양한 세포 유형으로 다양한 세포 외 신장 틈새 시장을 다시 채울 요구 될 수있다상대적으로 여과, 재 흡수, 소변의 농도, 호르몬 합성을 포함한 다수의 신장 기능을 수행한다.

마지막으로,이 문서에서 설명 레사 주린 관류 분석은 장기적인 문화 ^7,17,18시 세포 생존과 확산의 비 침습, 비 독성 평가를 제공합니다. 분석은 신장 골격 내에 성장 세포의 대사 상태 순시 피드백을 제공하고, 정기적으로 정기 교환 매체 사이에서 수행 될 때, 시간이 지남에 따라 세포 증식을 특징 짓는 데에 이용 될 수있다. 레사 주린 시약은 분석 수행 조금 시간 (1 시간)이 필요 염가이며, 세포 증식 또는 recellularized 골격의 말단 희생을 요구 조직 학적 평가에 비하여 대사 추이의 특성을 더 보수적 인 분석 방법이다. 레사 주린 관류 분석은 다른 RECE 내에서 성장하는 동안 세포 집단의 평가를 위해 적용 할 수 있습니다llularized 기관 또는 조직.

The authors have nothing to disclose.

The authors thank the support of the Zell Family Foundation. We recognize support from the Northwestern Memorial Foundation Dixon Translational Research Grants Initiative, the American Society of Transplant Surgeon’s Faculty Development Grant, and a Research Grant for the Young Investigator from the National Kidney Foundation of Illinois. We acknowledge support from the Robert R. McCormick Foundation. This work was also supported by NIDDK K08 DK10175 to J.A.W. Imaging and histology cores used for this research is supported by the Mouse Histology and Phenotyping Laboratory, Electron Probe Instrumentation Center (EPIC), and Simpson Querrey Institute Equipment Core at Northwestern University, and a Cancer Center Support Grant (NCI CA060553). The authors would like to acknowledge the Northwestern University Microsurgery Core for rodent kidney procurements. Evaluation of renal tubular epithelia morphology following recellularization conducted in the Fluorescence Microscopy Shared Resource supported by P30 CA118100.

An erratum was issued for Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development.

The human RCTEC/RCTE cell stocks used here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 were originally provided by Dr. Loghman-Adham (then at St. Louis University) to co-author Dr. Wandinger-Ness (University of New Mexico) through an MTA in 2001. The SV40 immortalized human RCTEC/RCTE cells were characterized as being of distal tubule cell line as detailed in Loghman-Adham et al., 2003. On the basis of recent short tandem repeat (STR) DNA sequencing (Performed by IDEXX BioResearch) of the earliest passages of the RCTEC/RCTE cell stocks it became evident the cells were of mixed lineage. Further analyses of PCR products using QIAxcel capillary electrophoresis demonstrated the presence of a canine product. The product was sequenced and established to be of canine origin. A set of canine specific STR markers were compared to the sample and showed that the sample had a genetic profile with 92% identity to the MDCK cell line.  Later cell stocks that were used in the present publication were STR profiled and showed drift to 100% MDCK lineage. Despite being of canine origin, rather than human as was previously thought, MDCK is similarly a distal tubule epithelial cell line. For this reason, previous interpretation and conclusions drawn using these cells here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 remain sound, but for purposes of rigor, reproducibility and experimental validation by others we report on this misidentification. This information will also be reported for listing on the International Cell Line Authentication Committee (ICLAC) database (http://iclac.org).