Method Article
Scaffolds capable of fitting within cranio-maxillofacial (CMF) bone defects while exhibiting osteoconductivity and bioactivity are of interest. This protocol describes the preparation of a shape memory scaffold based on polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method employing a fused salt template and application of a bioactive polydopamine coating.
Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to the success of this approach is a scaffold that is able to conformally fit within an irregular defect while also having the requisite biodegradability, pore interconnectivity and bioactivity. By nature of their shape recovery and fixity properties, shape memory polymer (SMP) scaffolds could achieve defect “self-fitting.” In this way, following exposure to warm saline (~60 ºC), the SMP scaffold would become malleable, permitting it to be hand-pressed into an irregular defect. Subsequent cooling (~37 ºC) would return the scaffold to its relatively rigid state within the defect. To meet these requirements, this protocol describes the preparation of SMP scaffolds prepared via the photochemical cure of biodegradable polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method. A fused salt template is utilized to achieve pore interconnectivity. To realize bioactivity, a polydopamine coating is applied to the surface of the scaffold pore walls. Characterization of self-fitting and shape memory behaviors, pore interconnectivity and in vitro bioactivity are also described.
В настоящее время считается золотым стандартом черепно-челюстно-лицевой (CMF) костный дефект лечения, трансплантация аутологичных добываемых трансплантатов затруднено сложными процедурами прививки, донор сайте заболеваемости и ограниченная доступность 1. Особая сложность формирует и фиксации жесткого аутотрансплантата плотно в дефект, чтобы получить остеоинтеграции и предотвратить резорбцию трансплантата. Тканевая инженерия была исследована в качестве альтернативной стратегии, чтобы аутотрансплантации и синтетических заменителей кости (например, кости цемент) 2,3. Решающее значение для успеха тканевой инженерии подхода является каркас с определенным набором свойств. Во-первых, для достижения остеоинтеграции, подмости должны образовывать тесные контакты с рядом костной ткани 4. Леса должны быть остеокондуктивный, позволяя миграцию клеток, питательную диффузии и neotissue 4,5 осаждения. Такое поведение, как правило, достигается с биоразлагаемой SCAffolds демонстрируя высокую взаимосвязанную морфологию пор. Наконец, каркас должен быть биологически активным, с тем чтобы содействовать интеграции и связей с окружающей костной ткани 5.
Здесь мы приводим протокол для подготовки тканевой инженерии эшафот с этими свойствами. Важно отметить, что это эшафот проявляет способность к "само-подходят" в нерегулярных CMF дефекты, связанные с его поведением с памятью формы 6. Thermoresponsive полимеры с памятью формы (SMPS), как известно, проходят под воздействием изменения формы, чтобы нагреть 7,8. У SMP состоят из "netpoints» (то есть химических или физических сшивок), которые определяют постоянную форму и "переключение" сегменты, которые поддерживают временную форму и восстановить постоянную форму. Сегменты переключения проявляют тепловой температуру перехода (Т транс), соответствующую либо стеклования (T G) или переход (Т м) в расплав полимера. В видерезультат, бухгалтерские фирмы может быть последовательно деформированы во временную форму при Т> Т транс, фиксированной в форме временного при Т <Т транс, и восстановились до постоянной форме при Т> Т транс. Таким образом, СМП леса может достичь "само-фитинг" в дефекта CMF следующим 6. После экспозиции, чтобы нагреть раствор (Т> Т транс), многопроцессорной леса станет податливым, разрешая общем подготовленные цилиндрические эшафот, чтобы быть ручной нажата в неправильной дефекта, с восстановление формы поощрения расширения эшафот с дефектом границы. После охлаждения (T транс), подмости бы вернуться к своей относительно более жесткой состоянии, с форма устойчивость поддержания своего нового временную форму в дефекта. В этом протоколе, многопроцессорной каркас изготовлен из поликапролактон (PCL), биоразлагаемый полимер изучена для регенерации тканей и других биомедицинских приложений 9-11. Для памятью формы, тысе Т м PCL служит Т транс и колеблется в пределах 43 ° С и 60, в зависимости от молекулярной массы PCL 12. В этом протоколе, Т транс (т.е. Т м) от помост 56,6 ± 0,3 ° С 6.
Для достижения Остеокондуктивность, был разработан протокол, чтобы SMP каркасов PCL на основе с высоко взаимопроникающих пор, основанный на методе 6,13,14 растворителем литья частиц выщелачивания (SCPL). Поликапролактон диакрилат (PCL-DA), (М п = ~ 10000 г / моль) был использован для обеспечения быстрого, фотохимической сшивки и растворяли в дихлорметане (ДХМ), чтобы позволить растворителей литье по шаблону соли. После фотохимического отверждения и испарения растворителя, шаблон соль удал выщелачивания в воду. Средний размер соль регулирует размер эшафот пор. Важно отметить, что шаблон соли сливают с водой перед растворитель под давлением, чтобы достичь пор interconnectiviТай.
Биологическая был придана SMP эшафот К в формировании месте в в polydopamine покрытия на стенки пор 6. Биологическая часто вводят в каркасах включением стеклянных или стеклокерамических наполнителей 15. Тем не менее, это может привести к нежелательным хрупких механических свойств. Допамин, как было показано, чтобы сформировать клейкий тонкий слой на polydopamine различных субстратов 16-19. В этом протоколе, СМП каркас был подвергнут слабощелочной раствор (рН = 8,5) дофамина с образованием nanothick покрытие polydopamine на всех поверхностях стенки поры 6. В дополнение к повышению гидрофильности поверхности для улучшения адгезии клеток и распространение, polydopamine было показано, что биологически активный в отношении образования гидроксиапатита (ГАП) при воздействии имитаторе жидкости тела (SBF) 18,20,21. На последнем этапе, подмости покрытием подвергается термообработке при 85 ºC (Т> Т транс) WHIch приводит к уплотнению эшафот. Термообработка ранее отметил, что важное значение для поведения форма эшафот памяти, возможно, из-за PCL кристаллические домены реорганизации в большей близости 14.
Мы дополнительно описать методы, чтобы охарактеризовать собственного облегающие поведение в неправильной модели дефекта, форма поведения памяти в терминах деформации управлением циклического тепловых испытаний механического сжатия (т.е. восстановление формы и формы неподвижность), морфологию пор, а в пробирке биологической. Стратегии Портной свойства эшафот также представлены.
1. синтезирующий PCL-DA Макромер
2. Подготовка SMP строительные леса (рис 1)
3. Применение Polydopamine покрытие для SMP строительные леса (рис 1)
4. Оценка "Self-установки" Поведение
5. Тестирование Поведение памятью формы
6. Визуализация Размер пор и пор Взаимосвязанность
7. Тестирование биологической активности в пробирке
В результате PCL на основе СМП леса способен себя облегающие модели в CMF дефекта (рис 2). После кратковременной нагреваться физиологический раствор (~ 60 ° C), цилиндрический каркас смягчает позволяя каркас быть вручную нажата в течение и расширить модели дефекта. После охлаждения до комнатной температуры, подмости фиксируется в новую форму, которая временно сохраняется при удалении от дефекта.
Поведение форма память о SMP помост количественно деформации управлением циклических-термической механических испытаний на сжатие по форме жесткости (R F) и восстановления формы (R R) (рис 3). Для этого PCL основе SMP эшафот, значения (%) для циклов N = 1 и 2: R F (1) = 102,5 0,7, R F (2) = 101,8 0,3, R R (1) 95,3 0,9 и R R (2) = 99,8 0,2 6.
СМП эшафот отображает весьма взаимосвязанной морфологию пор, как наблюдаетсяот изображений SEM (4А). Это было достигнуто путем использования слитого шаблона соли, образованной добавлением небольшого количества воды в просеянной соль (рисунок 1).
После воздействия на имитаторе жидкости тела (SBF; 1X) в течение 14 дней, изображений СЭМ подтверждает образование ГАП (рис 4В), таким образом, с указанием эшафот биологическую.
Рисунок 1. Схема для подготовки SMP эшафот, покрытой polydopamine. ASMP эшафот изготовлен с помощью описанного протокола, основанного на фотохимической лечения поликапролактонового диакрилата (PCL-DA), используя растворитель литья частиц выщелачивания (SCPL) способ, использующий шаблон слиты соль и применение биоактивного polydopamine покрытием. Окончательный термообработки при 85 ° C (T> T транс) индуцирует эшафот денсификация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Наблюдение самостоятельной установки поведения. Цилиндрическая СМП леса (~ 6 мм диаметр х ~ 5 мм) оснащен внутри "неправильной модели дефекта" (А) следующим образом. При нагревании в воде при 60 ° С ~ (Т> Т транс), подмости смягчает и становится пластичным (В) и, следовательно, могут быть механически нажата ("установлены") в рамках модели дефекта (С). После охлаждения до комнатной температуры, СМП каркас удаляется и сохраняет свою новую, фиксированный временную форму (D). При последующем нагревании при ~ 60 ° C, подмости подвергается восстановлению формы к исходному, общего цилиндрической формы. Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Измерение поведения памятью формы. Поведение с памятью формы из SMP эшафот количественно через циклической-тепломеханического испытания на сжатие штамм управлением на эшафот, чтобы определить форму неподвижность (R F) и восстановление формы (R R), основываясь на Измерения е м, ε и, ε и р. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Наблюдение ПОРе взаимосвязанность и формирование гидроксиапатита (ГАП). Представитель СЭМ изображения без покрытия, термически обработанной SMP помост (масштаб бар = 200 мкм) (а) и с покрытием, подвергают термообработке каркас после воздействия SBF (1x) в течение 14 дней (Шкалы = 50 мкм) (Б). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Этот протокол описывает подготовку polydopamine покрытием, PCL основе эшафот, чьи самостоятельно установки поведения, а также остеоиндуктивность и биологическую активность, делает его интерес в лечении нерегулярных CMF костных дефектов. Аспекты протокола может быть изменен, чтобы изменить различные особенности эшафот.
Протокол начинается с acrylation из в PCL-диола, чтобы позволить УФ отверждения. В отчетный например, PCL-диол М п ~ 10000 г / моль. Тем не менее, путем соответствующей регулировки количества акрилоилхлорида и Et 3 N, используемого в процессе синтеза PCL-DA, в PCL диола с более высокой или низкой М Н может быть использован для уменьшения или увеличения, соответственно, плотность сшивания.
Расплавленный Шаблон соль является важным компонентом в протокол (рис 1). Средний размер соль определяет конечный размер эшафот пор. В описанном примере, средний размер соль была ~ 460 ± 70 &# 181; м. В то время как меньший размер соли могут быть использованы, следует иметь в виду, что каркас подвергается усадке во время конечной стадии термообработки, который уменьшает размер пор. Просеивание соли используется, чтобы уменьшить распределение размера соль и, следовательно, распределение пор по размерам. Для получения каркас с высокой сообщающихся пор, соль слитый индуцировали добавлением небольшого количества воды (7,5% вес в расчете на массу соли). Это, как известно, частично растворяется изолированных частиц NaCl в непрерывный шаблон poragen 25,26. В зависимости от среднего размера соли, количество добавленной воды должен быть отрегулирован 14. Кроме того, во время плавления соли, вода должна быть постепенно добавляют, механическое смешанный и, наконец, центрифугировали, чтобы обеспечить его равномерное распределение, а также упаковки частиц соли.
Сформировав слитый шаблон соль, то PCL-DA растворяют в DCM для растворителя под давлением. В описанном протоколе, А concentratioп 0,15 г PCL-DA на 1 мл ДХМ был использован. Эта концентрация может быть увеличена или уменьшена. Тем не менее, в то время как увеличение концентрации, как ожидается, увеличится эшафот модуль, он может также произвести подмости с нижней пор взаимосвязанности 14.
После того, как раствор предшественника был добавлен на соли плесени, центрифугирование полезно помощник в его диффузии в шаблоне. После быстрого отверждения УФ, сушка на воздухе дает испарение растворителя ДХМ. После извлечения из формы, подмости замачивают в воде / этаноле (1: 1 по объему: объем) в течение 4 дней, чтобы удалить шаблон соли. СЭМ изображения подтверждает образование высокой степени взаимосвязанной пор морфологии (фиг.4А).
Polydopamine покрытие наносится на стенках пор каркасом для придания биоактивности. Из полученного лесов усадки, лучше наносить покрытие перед стадией обработки окончательной термической 6. Кроме того, дегазациилеска во время погружения в водный раствор дофамина способствует проникновению. Дегазированные подмости остатки погружены в раствор, чтобы облегчить равномерное покрытие polydopamine. После того, как с покрытием и тщательно промыть, ранее белый эшафот проявляет коричневого цвета характеристику polydopamine 21. Таким образом, покрытие по всей помост может быть оценена путем визуального осмотра с помощью вдвое леску, чтобы подтвердить polydopamine диффузии.
После нанесения покрытия polydopamine, окончательную термообработку проводят (85 ºC, 1 час). Как уже отмечалось, этот процесс приводит к каркасной усадки. Тем не менее, термообработка важное значение для достижения поведение 14 памяти формы, может быть, из-за реорганизации PCL кристаллических доменов (т.е. переключение сегментов) в большей близости.
Как показано на рисунке 2, СМП эшафот достигается себя облегающие модели в дефекта из-за его формы thermoresponsive меняМори природа. Воздействие нагреть физиологический раствор (~ 60 ° С), индуцированное плавления кристаллических доменов PCL, так что умягченной каркас может быть вдавлен в модели дефекта. Когда руководство давление освобождены, восстановление формы способствовало расширению эшафот, чтобы заполнить нерегулярные границы. После охлаждения до комнатной температуры кристаллические домены PCL реформировать, фиксируя каркас в новое временное форму, которая был оставлен при удалении от дефекта. Ранее мы убедились, что поры по краям удаленной помост оставалась достаточно открытой, несмотря контакте с формой 6.
При измерении с помощью деформации управлением циклического тепловых механических испытаний на сжатие (рис 3), идеальное поведение памятью формы характеризуется R F и R R значений 100%. Для описанного SMP помост, R F значения для циклов 1 и 2 были немного> 100% 6. R F Ранее было отмечено, чтобы быть немного грлюдоед, чем 100% 14,27 из-за незначительного увеличения деформации при сжатии во время фиксации формы от перекристаллизации PCL сегментов в более компактных структур 27 или от сжатия, вызванного перекристаллизации PCL. Кроме того, R R увеличилась с цикла к циклу 1 2 6. Увеличение значений г R уже отмечалось ранее для твердых 28,29,22 и пористой SMPS 13,14,23. Считается, что во время первого цикла, остаточная деформация, происходящих из обработки удаляется таким образом, что повышает восстановление формы в следующем цикле 7.
Описанный тканевой инженерии леса достигает определенного набора свойств, критических для успешного лечения костных дефектов CMF. Леса, как ожидается, облегчить остеоинтеграции благодаря своей способности "самостоятельно подходят" в неправильной CMF костного дефекта. Остеокондуктивность прогнозируется на основании достигнутого пор взаимосвязанности, а такжеэшафот биологическому разложению. Наконец, из-за polydopamine покрытия, леска биоактивно как указано формирования HA в ходе испытаний в пробирке (фиг.4В). Это биологическая, по прогнозам, способствовать интеграции и связей с окружающей костной ткани. Таким образом, этот каркас представляет собой альтернативу аутотрансплантации и обычные заменители костей для CMF костного дефекта ремонта.
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят Texas A & M University Engineering и опытной станции (тройники) за финансовую поддержку данного исследования. Линдсей ногтей с благодарностью признает поддержку со стороны Техас & M Университет Луи Стокса Альянса для участия меньшинств (LSAMP) и Национального научного фонда (NSF) Высшей Программы исследований стипендий (GRFP). Давэй Чжан благодарит Техас & M University Диссертация стипендий.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Polycaprolactone-diol (Mn ~ 10,000 g/mol) | Sigma-Aldrich | 440752 | |
Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | D65100 | Dried over 4A molecular sieves |
4-dimethylaminopyridine (DMAP) | Sigma-Aldrich | D5640 | |
Triethylamine (Et3N) | Sigma-Aldrich | T0886 | |
Acryloyl chloride | Sigma-Aldrich | A24109 | |
Ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
Potassium carbonate (K2CO3) | Sigma-Aldrich | 209619 | |
Anhydrous magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher | M65 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone (DMP) | Sigma-Aldrich | 196118 | |
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
Dopamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | H8502 | |
Tris buffer (2mol/L) | Fisher | BP1759 | Used at 10 mM concentration, pH = 8.5 |
Sieve | VWR | 47729-972 | |
UV-Transilluminator (365 nm, 25 W) | UVP | 95-0426-02 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) | TA Instruments | Q800 | |
High Resolution Sputter Coater | Cressington | 208HR | |
Scanning Electron Microscope (SEM) | FEI | Quanta 600 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены