Method Article
Scaffolds capable of fitting within cranio-maxillofacial (CMF) bone defects while exhibiting osteoconductivity and bioactivity are of interest. This protocol describes the preparation of a shape memory scaffold based on polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method employing a fused salt template and application of a bioactive polydopamine coating.
Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to the success of this approach is a scaffold that is able to conformally fit within an irregular defect while also having the requisite biodegradability, pore interconnectivity and bioactivity. By nature of their shape recovery and fixity properties, shape memory polymer (SMP) scaffolds could achieve defect “self-fitting.” In this way, following exposure to warm saline (~60 ºC), the SMP scaffold would become malleable, permitting it to be hand-pressed into an irregular defect. Subsequent cooling (~37 ºC) would return the scaffold to its relatively rigid state within the defect. To meet these requirements, this protocol describes the preparation of SMP scaffolds prepared via the photochemical cure of biodegradable polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method. A fused salt template is utilized to achieve pore interconnectivity. To realize bioactivity, a polydopamine coating is applied to the surface of the scaffold pore walls. Characterization of self-fitting and shape memory behaviors, pore interconnectivity and in vitro bioactivity are also described.
目前考虑的颅颌面(CMF)骨缺损治疗的金标准,收获的自体移植的移植是由复杂的移植手术,供体部位发病率和有限1阻碍。一个特别困难被整形并紧紧固定在刚性移植到缺陷,以获得骨整合和预防移植物吸收。组织工程已被调查作为一种替代战略,以自体移植和人工合成骨替代品( 如骨水泥)2,3。关键的组织工程方法的成功是一组特定属性的支架。第一,为了实现骨整合,支架必须形成与相邻的骨组织4紧密接触。该支架也应该是骨传导,允许细胞迁移,营养扩散和neotissue沉积4,5。这种行为通常是实现了与可生物降解的SCAffolds表现出高度互联的孔结构。最后,该支架应的生物活性,以促进融合和粘接与周围骨组织5。
在这里,我们提出了一个协议,准备组织工程支架具有这些属性。重要的是,这种支架显示能力的"自我适应"到,由于其形状记忆行为6不规则的CMF缺陷。温敏形状记忆聚合物(SMP系统)是已知的在暴露于经受形状改变以加热7,8。中小事务所是由"netpoints"(即化学或物理交联),这决定了永久的形状和"转换段",它保持暂时形状,并恢复永久的形状。开关段表现出相应于任一所述的玻璃化转变(T 克 )热转变温度(T 反式)或熔融聚合物的转变(Tm值)。由于其结果,污水收集可以顺序变形为暂时形状在T> T 反式,在T 反式固定在暂时形状,并恢复到在T> T 反式的永久形状。因此,SMP支架可以实现"自我装配"中的CMF缺陷如下6。曝光后,以温盐水(T> T 转 ),一个SMP支架将成为延展性,允许一个一般制造的圆筒状的支架是用手压成不规则的缺陷,具有形状恢复促进扩大脚手架的缺陷边界。在冷却(T 反式),脚手架将回到其相对更为刚性的状态,具有形状固定性保持缺陷在其新的临时形状。在这个协议中,将SMP支架选自聚己内酯(PCL)中制备,可生物降解的聚合物广泛研究的组织再生和其它生物医学应用9-11。对于形状记忆,日PCL电子Tm值用作经t 反式和43之后60°C之间变化,取决于在PCL 12的分子量。在这个协议中,支架的Ť 反式 (即Tm值)是56.6±0.3ºC6。
为了达到骨传导性,协议的开发,使PCL基的SMP支架与基于溶剂的铸造颗粒淋(SCPL)方法6,13,14高度互连的孔。聚己内酯丙烯酸酯(PCL-DA)(Mn为=〜10,000g / mol的)得到使用,以允许快速,光化学交联和溶解于二氯甲烷(DCM),以允许溶剂浇铸在盐模板。以下光化学固化和溶剂蒸发,盐模板除去浸出到水中。平均盐大小调节支架孔径。重要的是,该盐模板融合用水之前溶剂浇铸实现孔隙interconnectiviTY。
生物活性传授给了SMP的支架原位形成聚多巴胺涂到孔壁6。生物活性通常通过包含玻璃或玻璃-陶瓷填料15引入到支架。但是,这些可能引起不必要的易碎的机械性能。多巴胺已经显示,以形成对各种基材16-19中粘附,薄聚多巴胺层。在这个协议中,将SMP支架进行多巴胺的弱碱性溶液(pH = 8.5),以形成聚多巴胺的所有孔壁表面6 nanothick涂层。除了 增强表面的亲水性以改进细胞粘附和传播,聚多巴胺已被证明是生物活性在形成的羟基磷灰石(HAP)在暴露于模拟体液(SBF)18,20,21的条款。在最后的步骤,将涂覆的支架被暴露在85℃(T>Ť 反式)的wh热处理ICH导致脚手架致密化。热处理是前面提到的是为支架的形状记忆行为所必需的,或许是由于PCL结晶 区域重组,以更接近14。
我们另外描述的方法中的不规则缺陷模型的自装配行为表征,形状记忆行为而言 应变控制环状热机械压缩试验(即形状恢复和形状固定性),孔的形态,并在体外生物活性 。策略定制支架性能也提出了。
1.合成PCL-DA大分子单体
2.准备SMP脚手架(图1)
3.应用聚多巴胺涂层以SMP脚手架(图1)
4.评估"自我装配"行为
5.测试形状记忆行为
6,可视化孔径和孔互连性
7.测试其体外生物活性的
将所得的PCL基SMP支架是能够自我装配到一个模型CMF缺陷(图2)的。短暂暴露后温热盐水(〜60℃),圆柱形支架软化允许支架进行手动压入并展开模型缺损内。冷却至RT后,支架被固定到被从缺陷保留在除去其新的临时形状。
一个SMP支架材料的形状记忆行为由应变控制环状热机械压缩试验在形状固定性(R f)和形状恢复(R R)(图3)来表示定量。对于这个PCL基SMP支架,值(%)为周期N = 1和2是,R F(1)= 102.5 0.7,R F(2)= 101.8 0.3,R R(1)95.3 0.9,和R R (2)= 99.8 0.2 6。
在SMP支架显示高度互连的孔结构的观察通过SEM成像( 图4A)。这是通过使用熔融盐的模板,通过加入少量的水向筛分的盐(图1)形成的实现。
在暴露于模拟体液(SBF; 1X)14天,SEM成像证实了形成羟基磷灰石(图4B)的,从而表明支架的生物活性。
图1.示意图制备的SMP支架涂覆有聚多巴胺。ASMP支架经由基于使用溶剂浇铸微粒淋(SCPL)方法聚己内酯丙烯酸酯(PCL-DA)的光化学治疗所描述的协议制作用人熔盐模板应用生物活性聚多巴胺涂层。在85°C(T> T 反式)的最终热处理引起脚手架书房评定类别。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.观察自我装配的行为。圆柱形SMP支架(〜6毫米直径×约5毫米的高度)安装在一个"不规则的缺损模型"(A),如下所示 。在加热时在水中〜60ºC(T> T 反式),该支架软化并变得延展性(B)中 ,从而可以机械地按压("嵌合")的模型缺陷(C)的范围内。以下冷却至RT,将SMP支架被移除,并保留其新的,固定的临时形状(D)中 。在随后的加热在约60℃,支架经历形状恢复到原始的,通用的圆柱形状。 点击此处查看该图的放大版本。
图3.测量的形状记忆行为。一个SMP支架材料的形状记忆特性是通过应变控制环状热机械压缩试验定量上的支架,以确定形状固定性(R f)和基于形状恢复(R r)的的ε 米的测量,εu和 ε 页。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.观察上电复位Ë互联互通和形成羟基磷灰石(HAP)的,无任何涂层,热处理SMP支架的代表性SEM图像(比例尺= 200微米)(A)和涂层,接触到SBF(1X)14天后热处理支架(比例尺= 50微米)(B)。 请点击此处查看该图的放大版本。
这个协议描述了一种聚多巴胺涂覆的,PCL-基于支架,其自入行为的制备,以及骨诱导性和生物活性,使得在不规则CMF骨缺损的治疗兴趣它。该协议的各方面可以被改变,以改变各种支架功能。
该协议开始于PCL二醇,允许UV固化的丙烯酸酯化。在所报告的实例中,PCL二醇Mn为是〜10,000g / mol的。然而,通过适当地调整丙烯酰氯量和的Et 3 N的PCL-DA了PCL二醇可以被用于减少或增加,分别交联密度较高或较低的Mn为合成期间使用。
熔盐模板是给协议(图1)的重要组成部分。平均盐大小决定了所得脚手架孔径。在所描述的例子中,平均盐大小为〜460±70&#181,M。而较小的盐大小可被利用,但是应当记住的是,所述支架在最后热处理步骤,这将降低孔径发生收缩。盐的筛分被利用来减小盐大小分布,因此,孔径分布。以产生具有高度互连的孔的支架,盐融合诱导通过加入少量的水(基于盐重量7.5重量%)。这是已知的孤立的NaCl粒子部分地溶解到连续poragen模板25,26。根据不同的平均尺寸的盐,加入水的量必须被调整14。另外,盐的融合过程中,水必须逐渐加入,机械混合,最后离心以确保其均匀分布,以及所述盐颗粒的填充。
具有形成的熔融盐模板,在PCL-DA溶于DCM为溶剂浇铸。在所描述的协议中,一个concentratioñ为0.15g每1ml DCM的PCL-DA被利用。该浓度可以增加或减少。然而,虽然增加浓度预期增加脚手架模量,它也可以产生支架具有较低的孔隙互连14。
一旦前体溶液被添加到盐模具,离心有助于助手在其扩散到模板。以下快速UV固化,空气干燥允许DCM蒸发溶剂。从模具中取出后,该支架浸泡在水/乙醇(1:1体积:体积)4天以除去盐模板。扫描电镜成像证实高度互连的孔结构(图4A)的形成。
甲聚多巴胺涂层施加到支架的孔壁上,以赋予生物活性。由于所得到的支架的收缩,最好是在最终热处理步骤6之前施加涂层。另外,脱气而在含水多巴胺溶液浸没所述支架有助于渗透。将脱气脚手架遗体浸没在溶液,以促进均匀的聚多巴胺覆盖。一旦涂布并彻底清洗,先前白支架显示聚多巴胺21的棕色颜色特性。因此,在整个支架覆盖范围可以通过视觉检查来评估通过二等分的支架来确认聚多巴胺扩散。
应用的聚多巴胺涂层后,进行最终热处理被执行(85ºC,1小时)。如所指出,这一过程会导致支架的收缩。然而,热处理是必不可少的,以更接近实现的形状记忆行为14,可能是由于在PCL结晶 区域(即切换链段)的重组。
如图2所示,SMP支架实现自我拟合模型中的缺陷,由于它的温敏塑造我MORY性质。暴露于温暖的盐水(〜60℃)在PCL的结晶域,使得软化的支架可被压入模型缺陷诱导熔化。当手动释放压力,形复苏推动扩张支架,填补不规则边界。当冷却至室温,在PCL结晶域重整,固定所述支架在其中被保留在除去来自缺陷的新的临时形状。以前,我们证实,沿着移除支架的边缘的孔仍尽管与模具6接触相当开放。
当由应变控制环状热机械压缩试验(图3),测量值理想形状记忆行为的特征在于为100%R f和R R的值。对于所描述的SMP支架,为周期1和2 的 R F值稍微> 100%6。 的 R F先前已观察到略微克食超过100%14,27由于在压缩应变时形状固定从PCL段的再结晶成更紧凑的结构27或从PCL的压缩引起的再结晶略有增加。此外,R R从周期1上升到周期2 6。在研发的R值的增加已经被前面提到的固体28,29,22和多孔的SMP 13,14,23。据认为,在第一循环期间,残余应变从处理始发除去在下一周期 7中,使得形状恢复增加。
所描述的组织工程支架达到特定的一组为成功治疗CMF骨缺损的关键特性。该支架有望通过其能力范围内的不规则CMF骨缺损"自我适应",以促进骨结合。骨传导性是基于实现孔互连性预测以及脚手架生物降解性。最后,由于聚多巴胺涂层,支架是生物活性经由HA的形成期间在体外试验 (图4B)所指示的。这种生物活性被预测为便于集成和结合与周围骨组织。因此,该支架是替代自体移植和传统的骨替代CMF骨缺损修复。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢得克萨斯州A与M大学工程试验站(TEES)对这项研究的财政支持。林赛指甲非常感谢来自得克萨斯州A与M大学路易斯·斯托克斯联盟少数人参与(LSAMP)和美国国家科学基金会(NSF)研究生研究奖学金计划(GRFP)的支持。张大伟感谢得克萨斯州A与M大学论文奖学金。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Polycaprolactone-diol (Mn ~ 10,000 g/mol) | Sigma-Aldrich | 440752 | |
Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | D65100 | Dried over 4A molecular sieves |
4-dimethylaminopyridine (DMAP) | Sigma-Aldrich | D5640 | |
Triethylamine (Et3N) | Sigma-Aldrich | T0886 | |
Acryloyl chloride | Sigma-Aldrich | A24109 | |
Ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
Potassium carbonate (K2CO3) | Sigma-Aldrich | 209619 | |
Anhydrous magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher | M65 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone (DMP) | Sigma-Aldrich | 196118 | |
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
Dopamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | H8502 | |
Tris buffer (2mol/L) | Fisher | BP1759 | Used at 10 mM concentration, pH = 8.5 |
Sieve | VWR | 47729-972 | |
UV-Transilluminator (365 nm, 25 W) | UVP | 95-0426-02 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) | TA Instruments | Q800 | |
High Resolution Sputter Coater | Cressington | 208HR | |
Scanning Electron Microscope (SEM) | FEI | Quanta 600 |
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