Method Article
Scaffolds capable of fitting within cranio-maxillofacial (CMF) bone defects while exhibiting osteoconductivity and bioactivity are of interest. This protocol describes the preparation of a shape memory scaffold based on polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method employing a fused salt template and application of a bioactive polydopamine coating.
Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to the success of this approach is a scaffold that is able to conformally fit within an irregular defect while also having the requisite biodegradability, pore interconnectivity and bioactivity. By nature of their shape recovery and fixity properties, shape memory polymer (SMP) scaffolds could achieve defect “self-fitting.” In this way, following exposure to warm saline (~60 ºC), the SMP scaffold would become malleable, permitting it to be hand-pressed into an irregular defect. Subsequent cooling (~37 ºC) would return the scaffold to its relatively rigid state within the defect. To meet these requirements, this protocol describes the preparation of SMP scaffolds prepared via the photochemical cure of biodegradable polycaprolactone diacrylate (PCL-DA) using a solvent-casting particulate-leaching (SCPL) method. A fused salt template is utilized to achieve pore interconnectivity. To realize bioactivity, a polydopamine coating is applied to the surface of the scaffold pore walls. Characterization of self-fitting and shape memory behaviors, pore interconnectivity and in vitro bioactivity are also described.
現在、頭蓋顎顔面(CMF)骨欠損治療のゴールドスタンダードと考えられ、収穫自家移植片の移植は複雑な移植手順、ドナー部位の罹患率と限られた可用性1によって妨げられています。特定の困難は、オッセオインテグレーションを得るために、グラフトの再吸収を防止するために、欠陥にしっかり剛性自家移植片を成形し、固定されています。組織工学は、自家移植の代替戦略と合成骨代替物( 例えば、骨セメント)-2,3-として研究されてきました。組織工学的アプローチの成功に重要なプロパティの特定のセットとの足場です。まず、オッセオインテグレーションを得るために、足場は、隣接する骨組織4との密接な接触を形成しなければなりません。足場はまた、細胞移動、栄養拡散とneotissue堆積4,5を可能にして、骨伝導性でなければなりません。この動作は、一般的に、生分解性、SCAで達成されます高度に相互接続孔の形態を呈するffolds。骨組織5を周囲との統合との結合を促進するために、最後に、足場は、生物活性であるべきです。
ここでは、これらの特性を持つ組織工学の足場を準備するためのプロトコルを提示します。重要なことには、この足場は、形状記憶挙動6による不規則なCMF欠陥に「自己適合」する能力を示します。温度応答性形状記憶ポリマー(SMPS)は、7,8の熱への暴露時に形状変化を起こすことが知られています。 SMPSが永続的形状および一時的形状を維持し、永続的形状を回復する「スイッチングセグメントを「決定」netpoints」( すなわち 、化学的または物理的架橋)から構成されています。スイッチングセグメントはガラス転移(T g)のいずれかに相当する熱転移温度(T トランス)を示すか、ポリマーの転移(T mを)溶かします。として結果は、SMPSが順次T トランスで一時的な形状に固定し、T> T トランスでの一時的な形状に変形し、T> T トランスで永続的形状に回復することができます。 6を次のようにこのように、SMP足場は、CMFの欠損内に「自己フィッティング」を達成できました。生理食塩水(T> T トランス)を温めるに暴露した後、SMP足場は、形状回復が不良境界に足場の拡大を推進して、凹凸欠陥に手で押したように一般的に準備された円筒状の足場を許可する、可鍛性になります。 (T トランス)を冷却すると、足場は形状固定性が欠損内に、新しい一時的な形状を維持しながら、その比較的より剛性の状態に戻ることになります。このプロトコルでは、SMPの足場は、生分解性ポリマーは、組織再生、および他の生物医学的用途のために広く研究9-11、ポリカプロラクトン(PCL)から調製されます。形状記憶のために、目PCLのEのT mは、T トランスとして機能し、PCL 12の分子量に応じて、43〜60ºCの間で変化します。このプロトコルでは、足場のT トランス ( すなわち T m)は56.6±0.3ºC6です。
骨伝導性を達成するために、プロトコルは、溶媒キャスティング微粒子浸出(SCPL)法6,13,14に基づいて高度に相互接続された細孔を有するPCLベースSMP足場を作るために開発されました。ポリカプロラクトンジアクリレート(PCL-DA)(M = N〜10,000グラム/モル)を急速な、光化学的な架橋を可能にするために利用された塩のテンプレート上溶剤キャストを可能にするために、ジクロロメタン(DCM)に溶解しました。光化学硬化、溶媒の蒸発の後、塩のテンプレートを水に浸出することによって除去しました。平均塩サイズは足場の細孔サイズを調節します。重要なことには、塩テンプレート前細孔interconnectiviを達成するために、キャスティング溶媒を水と融合しましたTY。
生物活性は、細孔壁6上にポリドーパミンコーティングのその場形成のことで、SMPの足場に付与しました。生物活性は、多くの場合、ガラスまたはガラス-セラミック充填材15を含めることによって足場に導入されます。しかし、これらは、望ましくない脆性、機械的特性を生じ得ます。ドーパミンは、基板16〜19の様々な上に付着し、薄いポリドーパミン層を形成することが示されています。このプロトコルでは、SMPの足場は、すべての細孔壁面6にポリドーパミンのnanothickコーティングを形成するためにドーパミンのわずかに塩基性液(pH = 8.5)に供しました。改善された細胞接着のための表面の親水性を向上させ、拡散に加えて、ポリドーパミンは、擬似体液(SBF)18,20,21への曝露の際に、ハイドロキシアパタイト(HAP)を形成するという点で生物活性であることが示されています。最後のステップでは、コートされた足場は、85ºC(T> T トランス)WHで熱処理を露出させますICHは、足場の高密度化につながります。熱処理は、以前おそらく近接14に再編成するPCLの結晶ドメインに、足場形状記憶動作のために必須であることが認められました。
我々はさらに、孔の形態を、不規則なモデル欠陥内のセルフフィット挙動を特徴づけるための方法を記載するという点でひずみ制御環状の熱機械的圧縮試験を形状記憶挙動( すなわち形状回復と定着性を形作る)、 および in vitro生物活性に 。足場の特性を調整するための戦略も提供されます。
1. PCL-DAマクロマーの合成
SMP足場(図1)を準備する。2.
3. SMP骨格にポリドーパミンコーティングを塗布する(図1)
4.「セルフフィット」行動を評価します
5.テスト形状記憶挙動
6.可視化細孔サイズおよび細孔相互接続性
インビトロ生物活性の7テスト
得られたPCLベースSMP足場は自己フィッティングモデルCMF欠陥に( 図2)が可能です。短時間の露光後の生理食塩水(〜60℃)を暖めるために、円筒状の足場は、足場が手動に押され、モデルの欠陥内で膨張することができるように柔らかく。室温まで冷却した後、足場が欠陥から除去する際に保持され、新しい一時的な形状に固定されています。
SMP足場の形状記憶挙動は、形状固定性( 式中、R f)及び形状回復(R rの)( 図3)の条件で歪制御環式熱機械的圧縮試験によって定量化されます。このPCLベースのSMP足場については、サイクルの値(%)N = 1と2は、次のとおりです。 式中、R f(1)= 102.5 0.7 は 、R f(2)= 101.8 0.3、RをR(1)95.3 0.9、およびR rを(2)99.8 0.2 6 =。
観察されたように、SMP足場は、高度に相互接続孔の形態を表示しますSEM画像( 図4A)によります。これは、ふるい分け塩( 図1)に少量の水を添加することによって形成された溶融塩のテンプレートを使用することによって達成されました。
擬似体液(SBF; 1X)への曝露後14日間、SEMイメージングは、それによって足場の生物活性を示すのHAp( 図4B)の形成が確認されました。
ポリドーパミンで被覆されたSMPの足場を製造するための図1の回路図。ASMP足場を作製するポリカプロラクトンジアクリレート(PCL-DA)の光化学治療法に基づいて説明したプロトコルを介して溶融塩テンプレートを使用する溶剤キャスト微粒子浸出(SCPL)を用いる方法生理活性ポリドーパミンコーティングの適用。 85°C(T> T トランス)での最終熱処理は足場デンを誘導sification。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
自己フィッティング動作図2.観測。円筒形のSMP足場(〜X〜5ミリメートルの高さ、直径6mm)」は、不規則な欠陥モデル」に装着されている(A)としては、以下の通りです。モデル欠陥(C)中の〜60ºC(T> T トランス)、足場は軟化し、可鍛性になる(B)を 、したがって、機械的に(「装着」)を押すことができるの水中で加熱します。 RTに冷却後、SMP足場を取り出し、新しい固定一時的な形状(D)を保持されています。 〜60℃で、その後の加熱により、足場は、元の、一般的な円筒形状に形状回復を受けます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
形状記憶挙動を図3の測定。SMP足場の形状記憶挙動は、形状固定性( 式中、R f)に基づいて形状回復(R rを)決定するために足場上の歪み制御環式熱機械的圧縮試験により定量化されますεmの測定、εU、εP。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
PORの図4.観察電子相互接続およびハイドロキシアパタイト(HAP)の形成。コーティングされていない、熱処理されたSMP足場の代表的なSEM像(スケールバー= 200μm)の(A)及びコーティングされ、14日間SBF(1X)に曝露した後、熱処理された足場(スケールバー= 50μm)と(B)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
このプロトコルは、自己フィッティング行動だけでなく、骨誘導性および生物活性ポリドーパミン被覆された、PCLベースの足場の製造を記載し、不規則なCMFの骨欠損の治療に関心のそれを作ります。プロトコルの態様は、様々な骨格の機能を変更するために変更することができます。
プロトコルは、UV硬化を可能にするために、PCLジオールのアクリルから始まります。報告された例では、PCLジオールのM nは〜10,000グラム/モルです。しかし、適切にN塩化アクリロイルとPCL-DAの合成中に使用されるのEt 3 N、より高いまたはより低いMとPCLジオールの量を調整することにより、それぞれ、架橋密度を減少または増加させるために利用されてもよいです。
溶融塩テンプレートは、プロトコル( 図1)への重要な構成要素です。平均的な塩分のサイズが得られた足場の孔のサイズを決定します。説明した例では、平均的な塩の大きさは460〜±70でしたµメートル。より小さい塩サイズを利用することができるが、それは、足場は、細孔サイズが小さくなり、最終的な熱処理工程中に収縮することに留意すべきです。塩は、塩のふるいサイズ分布、従って、細孔サイズ分布を減少させるために利用されます。高度に相互接続された細孔を有する足場を製造するために、塩の融合は、少量の水(塩の重量に基づいて7.5重量%)の添加によって誘導しました。これは、部分的に連続的なポラゲンテンプレート25,26に単離されたNaCl粒子を溶解することが知られています。平均塩の大きさに応じて、水を添加量が14を調整する必要があります。さらに、塩溶融中に、水は徐々に、機械的に混合し、最終的に均一な分布だけでなく、塩粒子の充填を確実にするために遠心分離を追加する必要があります。
溶融塩のテンプレートを形成した、PCL-DAは、溶媒キャスティングのためのDCMに溶解します。記載されたプロトコルで、concentratioDCMを1mlあたりPCL-DAの0.15グラムのnを使用しました。この濃度が増加または減少させることができます。増加する濃度の足場弾性率を増加させることが予想されるがしかし、それはまた、より低い孔14との相互接続性足場を生成することができます。
前駆体溶液は、塩型に追加された後、遠心分離は、テンプレートにその普及に側近に便利です。迅速なUV硬化の後、空気乾燥は、DCMの溶媒の蒸発を可能にします。塩のテンプレートを除去するために、4日間(容量:1容量1)金型から取り出した後、足場を、水/エタノール中に浸漬します。 SEM画像は、高度に相互接続された孔の形態( 図4A)の形成を確認します。
ポリドーパミンコーティングは、生物活性を付与するために、足場の孔壁に適用されます。得られた足場の収縮に、最終熱処理工程6の前にコーティングを適用することをお勧めします。加えて、脱気水性のドーパミン溶液に沈めながら足場は浸潤を支援します。溶液中に沈め脱気骨格跡は、均一なポリドーパミン被覆を容易にします。一度コーティングし、十分に洗浄し、以前に白い足場は、ポリドーパミン21の茶色の色特性を示します。したがって、足場全体にカバレージをポリドーパミン拡散を確認するために足場を半分にすることにより、視覚的検査によって評価することができます。
ポリドーパミンコーティングを塗布した後、最終熱処理は、(85ºC、1時間)を行います。述べたように、このプロセスは、足場の収縮をもたらします。しかしながら、熱処理は、近接しておそらくPCLの結晶ドメイン( すなわち、スイッチングセグメント)の再編成のために、形状記憶挙動14を達成するために不可欠です。
図2に示すように 、SMPの足場は、その温度応答性形状私にモデル欠陥自己嵌合を達成しますMORY自然。生理食塩水を温めるために露出軟化足場がモデル欠陥に圧入することができるように、PCLの結晶ドメインの(〜60℃)で誘導される溶融。マニュアル圧力がリリースされた時、形状回復は、不規則な境界を埋めるために足場の拡大を推進しました。室温まで冷却すると、PCL結晶ドメインは、欠陥から除去する際に保持された、新しい一時的な形状に足場を固定、改革します。以前、我々は削除足場の縁に沿って孔が金型6との接触にもかかわらず、非常にオープンなままであることが確認されました。
歪み制御環式熱機械的圧縮試験( 図3)により測定した場合、理想的な形状記憶挙動は100%のR fおよび R rの値によって特徴付けられます。説明SMP足場については、サイクル1および2のR f値は、わずかに> 100%であった6。 R fは先に少しグラムであることが観察されています原因27よりコンパクトな構造にまたはPCLの圧縮によって誘発される再結晶からのPCLセグメントの再結晶からの形状の定着時の圧縮歪みがわずかに増加する100%14,27よりも食べます。また、R rはサイクル2〜6サイクル1から増加。R rの値の増加は、以前28,29,22固体と多孔質のSMP 13,14,23のために注目されています。これは、最初のサイクルの間に、処理に由来する残留歪みは、次のサイクル7のように形状回復増加除去されると考えられます。
説明組織工学足場は、CMFの骨欠損の治療の成功のための重要な特性の特定のセットを実現しています。足場は、「自己適合」不規則なCMFの骨欠損内にその能力を介して骨結合を促進することが期待されます。骨伝導性は同様に達成細孔の相互接続性に基づいて予測されます足場生分解性。 in vitro試験 ( 図4B)の間に、HAの形成によって示されるように、最後に、原因ポリドーパミンコーティングに、足場は、生物活性です。この生物活性は、骨組織の周囲との統合との結合を促進すると予測されます。したがって、この足場は、CMF骨欠損の修復のための自己移植従来の骨代替の代替を表します。
The authors have nothing to disclose.
著者は、テキサスA&M大学のエンジニアリングに感謝し、本研究の財政支援のためのステーション(TEES)を実験します。リンジーネイルは感謝して少数の参加のためのテキサスA&M大学のルイ・ストークス・アライアンス(LSAMP)と国立科学財団(NSF)大学院研究フェローシッププログラム(GRFP)からの支援を認めています。偉張のおかげで、テキサスA&M大学論文フェローシップ。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Polycaprolactone-diol (Mn ~ 10,000 g/mol) | Sigma-Aldrich | 440752 | |
Dichloromethane (DCM) | Sigma-Aldrich | D65100 | Dried over 4A molecular sieves |
4-dimethylaminopyridine (DMAP) | Sigma-Aldrich | D5640 | |
Triethylamine (Et3N) | Sigma-Aldrich | T0886 | |
Acryloyl chloride | Sigma-Aldrich | A24109 | |
Ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
Potassium carbonate (K2CO3) | Sigma-Aldrich | 209619 | |
Anhydrous magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher | M65 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
2,2-dimethoxy-2-phenyl acetophenone (DMP) | Sigma-Aldrich | 196118 | |
1-vinyl-2-pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | |
Dopamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | H8502 | |
Tris buffer (2mol/L) | Fisher | BP1759 | Used at 10 mM concentration, pH = 8.5 |
Sieve | VWR | 47729-972 | |
UV-Transilluminator (365 nm, 25 W) | UVP | 95-0426-02 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Dynamic Mechanical Analyzer (DMA) | TA Instruments | Q800 | |
High Resolution Sputter Coater | Cressington | 208HR | |
Scanning Electron Microscope (SEM) | FEI | Quanta 600 |
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