Прямая индукция гемогенного эндотелия и крови сверхэкспрессией факторов транскрипции в человека плюрипотентные стволовые клетки

This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.

Во время разработки, кроветворные клетки возникают из специализированного подмножества эндотелиальных клеток, кроветворный эндотелия (ОН). Развитие моделирования Его в пробирке имеет важное значение для механистических исследований эндотелия-гемопоэтических перехода и кроветворной спецификации. Здесь мы описываем способ эффективного индукции HE от человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) путем сверхэкспрессии различных наборов транскрипционных факторов. Сочетание ETV2 и GATA1 или GATA2 ТФ используется, чтобы вызвать он, пан-миелоидный потенциала, в то время как комбинация GATA2 и TAL1 факторов транскрипции позволяет для производства он, эритроидных и мегакариоцитарной потенциала. Добавление LMO2 к GATA2 и комбинации TAL1 существенно ускоряет дифференциацию и увеличивает эритроидной и мегакариоцитарной клеток производства. Этот метод обеспечивает эффективное и быстрое средство индукции Его из hPSCs и позволяет для наблюдения эндотелиальной-hematopoietiС переходом в культуральной чашке. Протокол включает в себя процедуры hPSCs трансдукции и пост-трансдукции анализ он и предшественники крови.

Уникальная способность человека плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) для самообновлению и дифференцировке в клетки трех зародышевых листков, в том числе крови, сделать их ценный инструмент для механистических исследований кроветворной развития, моделирования болезней крови, скрининг наркотиков, исследования токсичности и развитие клеточной терапии. Потому что образование в крови эмбриона выручки от гемогенного эндотелия (ОН) через эндотелиальной кроветворной перехода ^1,2, генерация HE в культурах бы важно изучить молекулярные механизмы, регулирующие эндотелиальные к кроветворной перехода и кроветворной спецификации. Современные методы исследований HE основаны на индукции дифференциации в hematoendothelial агрегатов (EBS) с добавлением гемопоэтических цитокинов ^3-5, и совместного культивирования в hPSCs с кроветворения-поддержку стромальных клеток ^6,7 или в двумерных культур с внеклеточной матрицы и сytokines ^8,9. Эти классические методы дифференциации основаны на введении внешних сигналов, действующих на поверхности клеток и инициирующих каскады молекулярных путей, которые в конечном итоге приводят к активации транскрипции программы руководящей hematoendothelial развития. Таким образом, эффективность hPSCs дифференциации в этих системах зависит от эффективной индукции этих сигналов, сигнальной трансдукции к ядру, и в результате активации специфических транскрипционных регуляторов. Кроме того, изучение HE в обычных культурах дифференцировки требует дополнительного шага изоляции HE клеток с использованием клеток сортировку. Здесь мы опишем простой протокол для прямого индукции он и крови по избыточной экспрессии кроветворных факторов транскрипции. Этот метод позволяет эффективно индукции HE в блюдо и непосредственного наблюдения за эндотелиальной к кроветворной перехода без необходимости выделения HE с использованием процедуры сортировки громоздким клеток.

Формирование он и кровь из человека плюрипотентных стволовых клеток может быть эффективно индуцируется с гиперэкспрессией всего несколько транскрипционных факторов (ТФ). Оптимальное сочетание ТФ, способных индуцировать надежную пан-миелоидный кроветворение из hPSCs включает ETV2 и GATA1 или GATA2. В отличие от этого, сочетание GATA2 и TAL1 вызывает erythromegakaryocytopoiesis ^10. Программирование hPSCs через гиперэкспрессией этих факторов отличает hPSCs непосредственно к VE-хама ⁺ CD43 ^- CD73 ^- клетки, которые HE постепенно приобретают кроветворную фенотип определяется выражением раннего маркера CD43 гемопоэтических ^7. Этот метод основан лентивирусов-за непосредственного программирования методом человека плюрипотентных стволовых клеток применяется для генерации он и клеток крови для механистических исследований, исследований эндотелиальных к кроветворной перехода и регуляции транскрипции гемопоэтических развития и спецификации. Хотя CПротокол омер текущего описано получение крови с помощью конститутивной экспрессии трансгенов, аналогичные результаты можно было бы получить с использованием модифицированной мРНК ^10.

1. Вирусные препараты и фактор транскрипции Комбинации

1. Готовят растворы с pSIN-EF1α лентивирусов плазмида экспрессии, содержащий ДНК, кодирующей белок по ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 и LMO2 (Таблица 1).
2. Измерение концентрации и чистоты плазмидных составов, используемых для производства лентивирусов путем записи УФ-поглощению с помощью спектрофотометра при 230 нм, 260 нм, и 280 нм. Примечание: Препараты ДНК, демонстрирующие A260 / A260 280 и / 230 значения выше 1,8, как правило, считается хорошим качеством. Нижние A260 / 280 значение может указывать на заражение белка, тогда как более низкие A260 / 230 значения указывают примеси солей или с какой-то растворителе, таком как фенол. Рекомендуемая концентрация плазмида 1-3 мкг / мкл.
3. Продукция лентивирусы для каскадов, как описано в ранее опубликованных протоколов ^11. Индукция он с пан-миелоидный потенциала требует сотрудничества выражение ETV2 и GATA1 или ETV2 и GATA2.Индукция он с эритро- и мегакариоцитарной потенциала требует GATA2 и TAL1. Добавление LMO2 значительно улучшает выход эритро-мегакариоцитов клеток от hPSCs в присутствии GATA2 и TAL1 ^10.

2. hPSCs Культура протокол

1. Растут плюрипотентных стволовых клеток в труднодоступных колоний с острыми краями 70-80% слияния, прежде чем пересева. Марк и удалить спонтанно дифференцироваться колонии, прежде чем пассажей клеток.
2. Развести коммерческую внеклеточного матрикса геля (таблица 2) в соответствии с инструкциями производителя и покрытие 6-луночных планшетах в течение ночи при 4 ° С, или, по крайней мере, одного часа при 37 ° С до использования. Перед пассажей клетки, аспирация матрицу, добавьте 2 мл свежей коммерческой полной culturemedium (таблица 2) и держать пластины в 37 ° С, 5% СО ₂ до клетки готовы для посева.
3. Прохождение hPSCs
   1. Аспирате вещества из одной сливной лунку 6-луночного планшета с hPSCs и добавить 1,5 мл подогретого раствора диспаза II (2 мг / мл в DMEM / F12, стерилизуют фильтрацией через 0,22 мкм фильтры). Инкубировать в течение 5-7 мин при температуре 37 ° С, 5% СО ₂ до края колоний начинают поднимать с поверхности.
   2. Решение Аспирируйте диспазу II и тщательно мыть колонии дважды, добавив затем аспирации 2 мл свежей DMEM / F12 среде. Затем, используя 5 мл серологические пипетки стекла, отделить hPSCs с 3 мл свежего коммерческой полной культуральной среде (таблица 2) с помощью пипетки клеточной суспензии вверх и вниз несколько раз.
   3. Добавить 0,5 мл суспензии клеток в каждую лунку 6-луночного планшета, содержащего 1,5 мл коммерческой полной культуральной среде (таблица 2). Перемешайте пластину назад и вперед и справа налево несколько раз, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток при располагающий пластины в инкубатор. Сохранить клетки при 37 ° С, 5% СО ₂ в течение 18-24 ч.
   4. На следующий день изменение средней на свежий коммерческой полной культуральной среде (таблица 2) и проверьте hPSCs морфологию. Успешные результаты пассажей в небольших, хорошо прикрепленными колонии подпорных HPSC морфологию. hPSCs должны подаваться с 2,5-3 мл freshmedium за хорошо на ежедневной основе, и пассировать каждые 4-5 дней не более чем на 70-80% слияния.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если hiPSCs поддерживали на эмбриональных фибробластов мыши (МЭФ), они должны быть переданы в фидерных без условиях и пассировать 2-3 раза до трансдукции для обеспечения эффективного дифференциации.

3. Индукция Hematoendothelial Pprecursors от hPSCs (день 0, трансдукции hPSCs)

1. Для подготовки реакционную среду объединить 1,3 мл коммерческой полной среде без сыворотки (см таблицу 2), вирус, Полибрен и Y27632 ROCK ингибитор (таблица 1): добавить 1,3 мкл ингибитора ROCK 10 мм до 1,3 мл среды до конечной ConCentraние 10 мкм, и полибрен до конечной концентрации 6 мкг / мл.
   1. Добавить соответствующее количество вирусного концентрата (ов) в конечной концентрации 0,5-1,0 MOI (множественность инфекции) каждого вируса на клетку. Хранить реакционную среду на льду или при 4 ° С до тех пор, суспензии отдельных клеток не будет готов.
      Примечание: То же самое количество MOI для каждого вируса в GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1, и смеси GATA2 / TAL1 / реакции LMO2 является оптимальным для индукции дифференцировки. Тем не менее, в ETV2 / GATA2 трансдуцированные культуры удвоения МВД для GATA2, по отношению к ETV2, повышает дифференциацию. Таким образом, для этих культур, отношение 1: 2 по МВД ETV2 и 1 МВД GATA2 рекомендуется (например, если вирусные концентрат оценивается приблизительно 6,8 х 10 ⁷ частиц / мл, добавляют 10 мкл ETV2 и 20 мкл GATA2 вирусных концентратов 0,68 ^× 10 6 клеток на одной реакции ETV2 / GATA2 в 35 мм лунку 6-луночного планшета).
2. Подготовка hPSCs в одном SUSP клетокension.
   1. Растут hPSCs в фидерных без условиях, как описано в разделе 2. На 4-й день после последнего прохода, наблюдать плотность клеток и морфологию под инвертированным микроскопом. hPSCs должны расти в плотных колониях с острыми краями, без спонтанной дифференцировки и достигать ~ 60-70% слияния в день трансдукции.
   2. Аспирируйте среднего, добавить 1,5-2 мл коммерческого реагента для диссоциации клеток (таблица 1) на лунку и инкубируют при 37 ° С с 5% СО ₂ в течение 5-7 мин.
   3. Сбор клеток в равных объемах коммерческой полной среде (таблица 2) с 10 мкМ ингибитора ROCK, подсчет клеток и определить жизнеспособность. Гранул клетки центрифугированием при 200 х г в течение 5 мин и затем вновь суспендируют клетки в полной среде коммерческой с 10 мкМ ингибитора ROCK до концентрации 3.4-5 х 10 ⁶ клеток на мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток имеет решающее значение для успешного вирусного преобразования и последующей дифференциации.Как правило, жизнеспособность клеток, прежде чем трансдукции должна превышать 90%.
3. Добавить 200 мкл клеточной суспензии, содержащие 0.68-1 x10 ⁶ клеток, в 1,3 мл реакционной среде, приготовленной в разделе 3.1.
4. Аспирируйте матричного раствора, из ночной покрытием 6-луночного планшета, полученного в 2.2., Передача реакционной смеси до одну лунку 6-луночного планшета и распространять клетки равномерно. Инкубируют при 37 ° С с 5% СО ₂ в течение 24 часов. Через 24 часа, по крайней мере 80% клеток должны быть прикреплены к матрице.

4. Индукция Hematoendothelial прекурсоров из hPSCs (День 1-7)

1. 24 ч после трансдукции, удалить вирус-среде, содержащей и мыть прикрепленные клетки с коммерческой неполным культивирования клеток среды (см таблицу 1), а затем добавить 3 мл на лунку коммерческой неполным культивирования клеток среде, содержащей гемопоэтические цитокины: SCF 100 нг / мл, ТПО 50 нг / мл, оФРФ 20 нг / мл (в дальнейшем именуемые 3F-среде),
2. Заменить общую среду со свежим 3F-среды в дни 2, 3 и 4 день, чтобы удалить мертвые клетки и мусор. Через 4 дня, когда плавающие кроветворные клетки возникают, заменить половина 3F-среднего через день, сохраняя при этом общий объем в 4 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: pSIN-EF1α лентивирусный плазмиды экспрессии включают ген устойчивости к пуромицину тем самым позволяя позитивной селекции трансдуцированных клеток. 1-мкг / мл пуромицин может быть добавлен к среде в течение первых 1-2 суток дифференцировки для устранения любых остаточных недифференцированных hPSCs.
3. Соблюдайте морфологии клеток на 4-й день под инвертированным микроскопом: жесткие скопления клеток с типичной морфологией эндотелиальных начинают появляться (2А, 3А). Круглые клетки крови появляется из 5 день 7 день дифференцировки, в то время как в некоторых районах может сохранить hPSCs морфологию. Анализ он и кроветворной дифференциации, как описано ниже.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Успешное hematoendothelial отличаетсятельная приводит к получению клеток крови, которые появляются в рефрактильные круглые клетки слабо прикреплены к основных плоских эндотелиальных клеток. Эти клетки активно размножаются образуя небольшие агрегаты, и в конечном итоге снять и поплавок (2А и 3А). Текущие кровяные клетки могут быть визуально отличается от мертвых и умирающих клеток в зависимости от их способности отражать свет и расширения в условиях культивирования.

5. Анализ гемогенного эндотелия (ОН) Стадия дифференциации.

1. Обнаружение образование он сквозь дней 3 и 4 дифференциации микроскопическим наблюдением клеток с эндотелиальными морфологии. Там нет плавающие клетки крови в культуре на данном этапе дифференциации. Наличие он может быть подтвержден иммунофлуоресцентным окрашивания и проточной цитометрии анализ с использованием VE-кадгерин, CD73, CD226 и CD43 антитела.
   1. Для оценки образования HE с помощью проточной цитометрии использовать анализ клеток на 3-й деньи 4-й день от одного эксперимента. Собирают клетки путем инкубации культур с коммерческой диссоциации клеток реагентом (таблица 1) в течение 5-10 мин при температуре 37 ° С, 5% СО _2, а затем использовать до 1 × 10 ⁵ клеток на реакцию окрашивания (проточной цитометрии процедуры окрашивания, описанной в ^12).
      ПРИМЕЧАНИЕ: VE-кадгерин ⁺ ОН клетки приобретают экспрессию раннего маркера гемопоэтических CD226, но не хватает экспрессии CD73 и CD43 ^6. В отличие от этого, не-HE клетки CD73 выразить (цифры 2B, 3B).
2. Иммунофлуоресценции окрашивание HPSC-производного он.
   1. Промыть прилагаемый монослой клеток фосфатно-солевым буфером (PBS), а затем исправить клеток в 4% параформальдегид от 30 до 60 мин при комнатной температуре.
   2. Промывают клетки снова PBS и затем проницаемыми использованием 0,1% Тритона Х-100 в PBS в течение 20 мин при комнатной температуре.
   3. Вымойте клеток в PBS два-три раза, а затем инкубировать вблокирующем буфере, состоящий из PBS с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), в течение от 30 до 120 мин.
   4. Подготовьте красящим раствором, содержащим как первичные антитела (1: 1,000 разведение) мышиного антитела против человеческого CD43 и кроличьим антителом против человека VE-кадгерин в PBS с 5% FBS, (Таблица 1).
   5. Аспирируйте блокирующий буфер из клеток и добавить 1 мл на лунку окрашивающего буфера с добавлением первичных антител; инкубировать 3 часа при комнатной температуре, или в течение ночи при 4 ° C.
   6. Промыть клетки три раза, добавив 2 мл PBS с 5% FBS.
   7. Подготовьте второй буфер окрашивания, содержащий вторичные антитела 1: 500 разбавление в PBS с 5% FBS: осла против кролика, конъюгированного с зеленым флуоресцентным красителем, и анти-мышь, конъюгированного с красным флуоресцентным красителем (Таблица 1). Добавить 1 мл на лунку вторичного буфера окрашивания и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа.
   8. Промыть три раза PBS без сыворотки. Пятно клетки с 300 нМ рабочего раствора DAPI в дН2 О в течение 10-15 мин.
   9. Вымойте клеток с PBS в два раза и добавить 2-3 мл PBS в хорошо окрашенных клеток. Соблюдайте флуоресценции с зелеными, красными и синими микроскопа фильтров.

6. Анализ индуцированных гемопоэтических прекурсоров

1. Поддержание дифференциации культур до плавающие клетки не расширить значительно, до 10-14 дней, меняя половину 3F-среде, как описано в 3.1, раз в два дня.
2. Разбить и собирать дифференциации монослоев клеток при обработке клеток с коммерческой диссоциации клеток реагентом (см таблицу 1) в течение 5-10 мин при 37 ° С, 5% СО _2.
3. Выполните проточной цитометрии с использованием анти-VE-кадгерина, CD43 и CD45 антитела, чтобы оценить кроветворение в культурах ^12. Обратите внимание, что большая часть клеток, вплоть до 40% от ETV2 и GATA2 трансдуцированных клеток, со-экспрессов VE-CAD и CD43. Следующие антитела могут быть использованы для определения специфических клеточных клонов следующий адресXpansion или дифференциация индуцированных клеток-предшественников крови: CD235a (эритроидных клеток), CD41a (мегакариоцитарной), CD32 (все виды клеток миелоидного), CD66b (нейтрофилы) и CD163 (макрофаги).
4. Выполните ХФУ-анализа с использованием коммерческого клоногенных среду (таблица 1) в соответствии с инструкциями изготовителя.
   1. Трансфер 1-2 х 10 ⁴ клеток в 3 мл коммерческой клоногенного среды (таблица 3), чтобы оценить количество колониеобразующих клеток и типов гемопоэтических колоний. Оптимальная плотность посева позволяет для идентификации и изоляции отдельных колоний, которые растут отдельно друг от друга и не пересекаются. Посев плотность может варьироваться от экспериментов в зависимости от эффективности дифференцировки, но не должна превышать 1 х 10 ⁴ клеток на 1 мл среды коммерческой образующих клоны.
   2. Смешайте клетки в коммерческой среде клоногенного нежным встряхивания и передать 3 мл суспензии двух 35 мм ультра-низкие блюд креплениядля CFC анализа 1,5 мл суспензии в каждую чашку. Распределить равномерно среду и инкубируют при 37 ° С, 5% СО ₂ в течение 14 дней. Избегайте нарушая блюда; наблюдать образование колоний на 7 день и 10 день анализа.
   3. Выявление и подсчет колоний кроветворных в соответствии с их морфологии на 14 день.

Принципиальная схема он и индукции крови из hPSCs по избыточной экспрессии транскрипционных факторов показана на рис 1. ETV2 с GATA1 или GATA2 комбинации вызывает пан-миелоидный кроветворение, в то время как GATA2, TAL1 +/- LMO2 сочетание вызывает преимущественно эритро-мегакариоцитарной кроветворение. Обе комбинации TF непосредственно индуцированных клеток HE, которые впоследствии превращаются в предшественников крови с отчетливым спектра гемопоэтических дифференциации. Дифференциация hPSCs из плюрипотентных государства в крови производству Его занимает в среднем 4 дня. Круглые клетки крови первого появления на 5-й день дифференциации. Впоследствии, многочисленные плавучие клетки крови появляются и расширить в культурах. Чтобы максимизировать количество плавающих клеток крови, после трансдукции культуры могут быть продлен до 10-14 дней. Желаемый линия клеток может быть расширен в странах с низким прилипшие условиях с соответствующей комбинации гемопоэтических цитокинов. Рисунок 2 DEMдемонстрирует существующую индукции крови из hPSCs использованием ETV2 и GATA1 или GATA2 ТФ. После трансдукции ETV2 и GATA2, клетки приобретают типичную морфологию эндотелия по 4-й день дифференциации, и в конечном итоге превращаются в круглые клетки крови (6-8 день дифференцировки (2А). Cells, собранные в дни 3-4 дифференциации показать типичный VE-кадгерин ⁺ CD226 ⁺ CD73 ^-. ОН фенотип (Фигура 2В, 3В) К 7 дню дифференциации более 50% от VE-кадгерин ⁺ клетки приобретают гемопоэтических CD43 ⁺ фенотип (фиг.2с) CFC-анализы GATA2 / ETV2. индуцированного клетки показывают, что колонии состоят из высокой пролиферативной потенциала (ГЭС) ХФУ, эритроидных (Е) ХФУ, макрофаги (М) ХФУ, и гранулоциты (Г) ХФУ (рис 2E). hematoendothelial дифференциация в hPSCs следующие гиперэкспрессией GATA2 и в одиночку или с TAL1LMO2 показано на рисунке 3. Его этапе лучше определены в культурах с GATA2 и TAL1. Добавление LMO2 ускоряет дифференцировку и заметно стягивает HE этап. GATA2 и TAL1 в одиночку или с LMO2 сочетание демонстрирует дифференцировку и созревание клеток-предшественников крови в основном эритроидных и мегакариоцитарной клетки Рисунок 3D и 3E. Рисунок 4 показывает оптимизацию эффективности трансдукции в H1 ЭСК с использованием GFP лентивирус (A) и клеточной смерти и эффективности дифференциации в культуры трансдуцировали GATA2 / TAL1 / LMO2 на высокой и низкой МВД.

Рисунок 1:. Принципиальная схема протокола для индукции кроветворных эндотелиальных клеток и кровеносных через принудительного выражения ТФ мультфильм изложены основные экспериментальные шаги и сроки. После подготовки суспензии отдельных клеток, которые hPSCs трансдуцированных TFс и высевали на матрице в полной коммерческой бессывороточной среде. На следующий день, среду заменяют фактора роста свободного коммерческого среде с добавлением оФРФ, ТПО и SCF (3F среды). После 3-4 дней культуры, он формируется. Впоследствии он подвергается эндотелиальной в кроветворной перехода с образованием множественных кровяных клеток.

Рисунок 2:. ETV2 / GATA2-индуцированной дифференциации hPSCs (А) фазового контраста изображения ETV2 / GATA2-индуцированной дифференциации в ЭСК H1 в дни 2, 4, 6 и 8 после трансдукции; Масштаб бар, 100 мкм. (B), проточной цитометрии анализ ETV2 / GATA2-индуцированной клеток, подвергающихся эндотелия в кроветворной перехода на 3-й день дифференциации: VE-кадгерин ⁺ ОН клетки выразить CD226 и лишены экспрессии CD73. Небольшой процент эндотелиальных клеток CD73 выразить (не-HE). (С) проточной цитометриинализ из ETV2 / GATA1- и ETV2 / GATA2-индуцированной H1 hPSCs на 7 день после трансдукции. (D) проточной цитометрии анализ ETV2 / GATA2-индуцированной кроветворных клеток расширенных в среде с добавлением FBS и SCF, IL-6, ИЛ-3, GM-CSF, G-CSF и ЕРО в течение 14 дней. (Е) Типы гемопоэтических колоний, образованных из ETV2 / GATA2 трансдуцированных клеток в CFC-анализе и соответствующих Райт-окрашенных cytospins представляющих эритроидных (E), макрофаги (M), гранулоциты (GR) и высокий пролиферативный потенциал колонии (ГЭС). Масштабные бары для CFC-анализе, 250 мкм, для cytospins, 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3:. GATA2 / TAL1 и GATA2 / TAL1 / LMO2-индуцированной дифференциации hPSCs (A) фазового контраста изображения GATA2 / TAL1 / LMO2индуцированной дифференциации в ЭСК H1 в дни 2, 4, 6 и 8; Масштаб бар, 100 мкм. (Б) проточной цитометрии анализ GATA2 / TAL1-индуцированных клеток, подвергающихся эндотелиальные чтобы кроветворной перехода на 3-й день дифференциации: VE-кадгерина ⁺ клетки приобретают экспрессию маркера Его CD226. Небольшой процент эндотелиальных клеток CD73 выразить (не-HE). (С) Иммунофлуоресцентное окрашивание GATA2 / TAL1-индуцированной дифференциации в ЭСК H1, 5 день; VE-кадгерин + клеток (зеленые) приобретают выражение кроветворной маркера CD43 (красный). (D) проточной цитометрии анализ GATA2 / TAL1 / LMO2-индуцированной гемопоэтические культуры в суспензии на 14 день после трансдукции следующие расширения в среде без сыворотки с добавлением SCF, ТРО, ЕПВ и оФРФ; (Е) Типы гемопоэтических колоний, образовавшихся в CFC-анализе с GATA2 / TAL1 / LMO2 дифференцированного cellsand соответствующей Райт-окрашенных cytospins представляющих эритроидных (E), макрофаги (M), и Megakaryocytes (MK). Масштабные бары для CFC-анализе, 250 мкм, для cytospins, 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Оптимизация процедуры лентивирусный трансдукции (А) трансдукция ЭСК H1 с различной МВД GFP лентивирусов.. (Б) Жизнеспособность клеток и эффективность дифференциации в культурах, трансдуцированных GATA2 / TAL1 / LMO2 при низкой (1 для каждого вируса) и высокий (2 для каждого вируса) МВД.

Описанный выше метод кроветворной дифференциации hPSCs по избыточной экспрессии ТФ, представляет собой быстрое и эффективный подход для генерации он и миелоидных и erytho-magakaryocytic предшественников из ЭСК и ИПСК, тем самым позволяя производить до 30 миллионов клеток крови из один миллион плюрипотентные стволовые клетки ^10. Этот метод выставлены последовательную дифференциацию в нескольких чЭСК и ИПСК линий ^10. Во время дифференциации по ETV2 и GATA2 факторы GATA1 а также GATA2 и TAL1 факторы, клетки образуют крови производить эндотелий, он и пройти эндотелий в кроветворной перехода. Формирование он, как правило, наблюдается между днями 3 и 4 дифференциации. Добавление LMO2, транскрипционный ко-фактор TAL1, в GATA2 и комбинации TAL1, значительно увеличили надежность дифференциации, в то время как этап стал заметно сократился.

Успех режиссера отличительноение hPSCs по транскрипционных факторов, главным образом, зависит от (I) с эффективной доставки нуклеиновых кислот в клетки, (II) жизнеспособность клеток следующие генетические манипуляции, и (III) эффективное перевода экзогенных транскриптов внутри клетки.

Одним из ключевых шагов в рамках описанного способа является производство эффективных лентивирусных единиц, что зависит от точного буфера рН для НЕК 293T трансфекции клеток, и отсутствие эндотоксинов на всех этапах производства и вирусных трансдукции экспериментов. Целостность всех конструкций, в том числе упаковки и оболочки плазмид, должны быть проверены, если нет признаков вирусного производства в НЕК 293Т не наблюдается ^13.

Конструкция протокол дифференцировки с помощью комбинации транскрипционных факторов, следует учитывать несколько переменных. Высокая эффективность вирусной трансдукции имеет важное значение для успешного дифференциации. Так эффективность трансдукции зависит от используемого метода для вирусапроизводство и очистка, оптимизация HPSC трансдукции с использованием GFP-лентивирусный вектор рекомендуется (рис 4а). Вирусный интеграция следующие трансдукции должны быть проверены с использованием геномной ПЦР с трансгенными-специфических праймеров (таблица 3). Дифференцирование оптимизации должен также включать регулировку лентивирусов концентрации в реакционной смеси. Относительно низкое количество вируса, МВД 0,5-1, способен индуцировать дифференциацию HPSC. В то время как выше MOI повышает эффективность дифференциации, но и повышает гибель клеток (фиг.4В). Дополнительный этап оптимизации может включать в себя установку масштаба MOI для каждого вируса в реакционной смеси. В GATA2 / ETV2 трансдуцировали культур, удвоение МВД для GATA2, по отношению к ETV2, повышает эффективность дифференциации. Для GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1 и GATA2 / TAL1 / LMO2 равно МВД для каждого вируса является оптимальным.

После трансдукции с ТФ, подавляющее большинство клеток UnderwЛОР angiohematopoietic дифференциации в то время как лишь очень немногие клетки сохранили морфологию недифференцированные. Так pSIN-EF1α лентивирусов векторов включают устойчивость к антибиотикам, лечение культур с пуромицин может быть использован для устранения остаточных недифференцированных клеток.

Формирование клеток с характерными эндотелиальных морфологии и последующих круглых клеток крови, указывает на успешное дифференциации. В среднем, сочетание GATA2 / ETV2 производит 40-50% CD43 ^{+ VE-кадгерин} клеток крови от ^+/- день 9-10 дифференциации с до 30% клеток, оставшихся VE-кадгерин ⁺ CD43 ^-. GATA1 / Комбинация ETV2 индуцирует экспрессию CD43 быстрее и генерирует большее количество CD43 ^{+ клеток} по сравнению с комбинацией GATA2 / ETV2. В этих культурах, большинство CD43 ^{+ клеток} coexpress VE-кадгерин. В культурах, трансдуцированных GATA2 / TAL1, количество CD43 ^{+ клеток,} как правило, достигает 40-50%. Добавление LMO2 в GATA2 / TAL1 существенно ускоряет и усиливает выработку крови, и заметно стягивает эндотелия этап развития.

Колониеобразующих анализы должны быть использованы для определения частоты и тип индуцированных гематопоэтических предшественников. Природа колониеобразующих клеток может быть подтверждено путем подготовки Райт-окрашенных cytospins из отдельных колоний. hPSCs трансдуцированные ETV2 и GATA2 производить в основном большие (больше, чем 0,5 мм в диаметре) высокие пролиферативный потенциал (ГЭС) миелоидных колоний, состоящих из незрелых гранулоцитарного и моноцитов, с некоторыми зрелых миелоидных клеток и иногда эритроидных и мегакариоцитарных клеток. В среднем более чем на 80% ХФУ в GATA2 / ETV2 трансдуцированные культуры являются миелоидной ГЭС. Кроме того, эти культуры генерировать эритроидных и макрофагов колонии (рис 2E), которые, как правило, содержат меньше, чем 20% от общего объема ХФУ. HPSC трансдукции с ETV2 и GATA1 значительно увеличивает тысе часть CFC-E, чтобы до 50%. TAL1 и GATA2 трансдуцированные культуры производства в основном эритроидных (более 80% от общего ХФУ) и мегакариоцитарных колоний (более 10% от общего ХФУ) с очень немногих колоний макрофагов (менее 5% от общего ХФУ). Добавление LMO2 к TAL1 и комбинации GATA2 значительно увеличивает частоту колониеобразующих клеток с эритро-мегакариоцитов потенциал ^10. Характер CFC активности после трансдукции с описанными комбинациями транскрипционных факторов согласуется между различными ЭСК и hiPSC линий ^10.

Таким образом, лентивирусов-опосредованной избыточная экспрессия в hPSCs является относительно быстрым и эффективным инструментом для индукции он и крови с использованием TFS. Эта система также может быть использован для оценки дифференциации потенциала других ТФ и идентифицировать те, которые необходимы для эндотелиальных и гемопоэтических спецификации. Тем не менее, текущий протокол имеет ограниченное применение для исследований эксtracellular сигнализации участвуют в индукции он, как он использует ТФ в обход опосредованного рецептором передачу сигнала поверхности. Хотя в настоящее время протокол описывает производство крови с помощью конститутивной экспрессии трансгена, аналогичные результаты могут быть получены с использованием модифицированных мРНК ^10.

ЕСТЬ является одним из основателей акционером и консультантом по Cynata.

We thank Matt Raymond for editorial assistance. This work was supported by funds from the National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221, and P51 RR000167) and The Charlotte Geyer Foundation.