Method Article
This protocol describes the efficient induction of hemogenic endothelium and multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via the forced expression of transcription factors.
Durante lo sviluppo, cellule ematopoietiche derivano da un sottoinsieme specializzato di cellule endoteliali, endotelio hemogenic (HE). Modellazione sviluppo HE in vitro è essenziale per gli studi meccanicistici della transizione endoteliale-ematopoietiche e le specifiche ematopoietiche. Qui, si descrive un metodo per l'induzione efficiente di SE da cellule umane pluripotenti staminali (hPSCs) mediante sovraespressione di diverse serie di fattori di trascrizione. La combinazione di ETV2 e GATA1 o GATA2 TF viene usato per indurre HE con potenziale pan-mieloide, mentre una combinazione di fattori di trascrizione e GATA2 TAL1 consente la produzione di HE con eritroide e potenziale megacariocitica. L'aggiunta di LMO2 a GATA2 e la combinazione TAL1 accelera notevolmente il differenziamento eritroide e aumenta e le cellule megacariociti produzione. Questo metodo fornisce un mezzo efficace e rapido di induzione HE da hPSCs e permette l'osservazione del endoteliale-hematopoietic transizione in un piatto di coltura. Il protocollo comprende le procedure hPSCs trasduzione e analisi post-trasduzione di SE e progenitori sangue.
La capacità unica di cellule staminali umane pluripotenti (hPSCs) per auto-rinnovarsi e di differenziarsi in cellule di tre foglietti embrionali, compreso il sangue, li rendono uno strumento prezioso per gli studi meccanicistici di sviluppo ematopoietiche, la modellazione di malattie del sangue, lo screening di stupefacenti, studi di tossicità, e lo sviluppo di terapie cellulari. Perché la formazione del sangue nei proventi embrioni da endotelio hemogenic (HE) attraverso una transizione ematopoietiche endoteliale 1,2, la generazione di SE nelle culture sarebbe essenziale per studiare i meccanismi molecolari che regolano la endoteliale transizione ematopoietiche e le specifiche ematopoietiche. Metodi attuali per studi di HE si basano sull'induzione di differenziazione hematoendothelial in aggregati (EBS) con l'aggiunta di citochine ematopoietiche 3-5, e di co-coltura con cellule stromali hPSCs Emopoiesi-solidale 6,7 o nelle culture bidimensionali con extracellulare matrici e cytokines 8,9. Questi metodi di differenziazione classici si basano sull'introduzione di segnali esterni che agiscono sulla superficie cellulare e avvio cascate di percorsi molecolari che conducono alla attivazione del programma trascrizionale guidare lo sviluppo hematoendothelial. Quindi, l'efficienza di hPSCs differenziazioni in questi sistemi si basa su una induzione effettivo di questi segnali, la trasduzione del segnale al nucleo, e l'attivazione di specifiche risultante regolatori trascrizionali. Inoltre, lo studio di HE in colture di differenziazione convenzionali richiede l'ulteriore fase di isolare HE cellule usando separazione delle cellule. Qui, descriviamo un semplice protocollo per l'induzione diretta di SE e sangue sovraespressione di fattori di trascrizione ematopoietiche. Questo metodo consente l'induzione efficiente HE in un piatto e osservazione diretta della endoteliale transizione ematopoietiche senza la necessità di isolamento di HE utilizzando una procedura di ordinamento cellule ingombrante.
Formazione di SE e del sangue da cellule staminali umane pluripotenti possono essere efficacemente indotti da iperespressione pochi fattori di trascrizione (TFS). La combinazione ottimale di TF in grado di indurre robusto emopoiesi pan-mieloide da hPSCs include ETV2 e GATA1 o GATA2. Al contrario, la combinazione di GATA2 e TAL1 induce erythromegakaryocytopoiesis 10. Programmazione hPSCs attraverso la sovraespressione di questi fattori differenzia hPSCs direttamente al VE-cad + CD43 - CD73 - HE cellule che acquisiscono gradualmente il fenotipo ematopoietiche definito mediante l'espressione dei primi ematopoietiche marcatore CD43 7. Questo metodo basato lentivirali-per la programmazione diretta del metodo di cellule staminali pluripotenti umane è applicabile per la generazione di HE e cellule del sangue per studi meccanicistici, studi di endoteliale di transizione ematopoietiche e regolazione trascrizionale di sviluppo ematopoietiche e le specifiche. Sebbene la cprotocollo orrente descrive la produzione di sangue usando l'espressione costitutiva dei transgeni, risultati simili possono essere ottenuti utilizzando modificato mRNA 10.
1. Preparativi Virus e fattore di trascrizione combinazioni
2. hPSCs Cultura protocollo
3. Induzione di Hematoendothelial Pprecursors da hPSCs (giorno 0, trasduzione di hPSCs)
4. Induzione Hematoendothelial precursori da hPSCs (giorno 1-7)
5. Analisi di Hemogenic endotelio (HE) Fase di differenziazione.
6. Analisi della indotte ematopoietiche precursori
Lo schema di SE e induzione sangue da hPSCs di sovraespressione di fattori di trascrizione è mostrato in Figura 1. ETV2 con combinazione GATA1 o GATA2 induce emopoiesi pan-mieloide, mentre un GATA2, TAL1 +/- combinazione LMO2 induce emopoiesi prevalentemente eritro-megacariocitica. Entrambe le combinazioni TF direttamente indotto cellule HE che in seguito trasformati in progenitori di sangue con una gamma diversa di differenziazione ematopoietiche. Differenziazione delle hPSCs dallo stato pluripotente di sangue produrre HE richiede in media 4 giorni. Globuli rotondi primo emergono dal giorno 5 di differenziazione. Successivamente, numerose cellule del sangue galleggianti appaiono e si espandono nelle culture. Per massimizzare il numero di galleggiare cellule del sangue, le culture post-trasduzione possono essere prorogati per 10-14 giorni. La stirpe di celle desiderato può essere ampliato in condizioni di scarsa aderenti con la combinazione appropriata di citochine ematopoietiche. Figura 2 demonstrates l'induzione di sangue da hPSCs utilizzando ETV2 e GATA1 o GATA2 TF. Dopo trasduzione con ETV2 e GATA2, cellule acquisiscono una tipica morfologia endoteliale di giorno 4 di differenziazione, e alla fine si trasformano in globuli rotonde (giorno 6-8 di differenziazione (Figura 2A). Le cellule raccolte nei giorni 3-4 di differenziazione mostrano una tipica VE-caderina + CD226 + CD73 -. HE fenotipo (Figura 2B, 3B) Di giorno 7 di differenziazione più del 50% di CFC-test di GATA2 / ETV2 VE-caderina cellule + acquisire il CD43 ematopoietiche + fenotipo (Figura 2C). cellule -indotta rivelano che le colonie sono costituiti da alto potenziale proliferativo (HPP) CFC, eritroide (E) CFC, macrofagi (M) CFC e granulociti (G) CFC (Figura 2E). La differenziazione hematoendothelial in hPSCs seguito sovraespressione di GATA2 e da solo o con TAL1LMO2 è mostrata in fase Figura 3. Egli è meglio identificato nelle culture con GATA2 e TAL1. L'aggiunta di LMO2 accelera differenziazione e contratti marcatamente HE palco. La combinazione GATA2 e TAL1 solo o con LMO2 dimostra differenziazione e maturazione dei progenitori di sangue per lo più cellule eritroidi e megacariociti Figura 3D e 3E. La Figura 4 mostra l'ottimizzazione di efficienza di trasduzione in H1 hESC usando GFP lentivirus (A) e la morte cellulare ed efficienza differenziazione culture trasdotte con GATA2 / TAL1 / LMO2 ad alto e basso MOI.
Figura 1:. Schema di protocollo per l'induzione delle cellule endoteliali e del sangue hemogenic tramite l'espressione forzata di TF del fumetto delinea i principali passaggi sperimentali e scadenze. Dopo la preparazione di sospensione di cellule singole, hPSCs sono trasdotte con TFs e seminati su matrice in mezzo completo privo di siero commerciale. Il giorno dopo, di media viene sostituito con il fattore di crescita medio commerciale gratuito integrato con bFGF, TPO e SCF (3F media). A seguito di 3-4 giorni di coltura, SE è formato. Successivamente, egli subisce endoteliali di transizione ematopoietiche con formazione di più cellule del sangue.
Figura 2:. ETV2 / differenziazione GATA2 indotta hPSCs (A) immagini fase di contrasto ETV2 / differenziazione GATA2 indotte H1 hESC a giorni 2, 4, 6 e 8 dopo trasduzione; Barra della scala, 100 micron. (B) analisi citofluorimetrica di ETV2 / cellule GATA2 indotta sottoposti endoteliale di transizione ematopoietiche al giorno 3 di differenziazione: VE-caderina + HE cellule esprimono CD226 e mancanza di espressione di CD73. Una piccola percentuale di cellule endoteliali esprimono CD73 (non-HE). (C) una citometria a flussonalisi di ETV2 / GATA1- e ETV2 / GATA2 indotta H1 hPSCs il giorno 7 post-trasduzione. (D) analisi citofluorimetrica di ETV2 / cellule ematopoietiche GATA2 indotta espanse in mezzo supplementato con FBS e SCF, IL3, IL6, GM-CSF, G-CSF e EPO per 14 giorni. (E) Tipi di colonie ematopoietiche formate da ETV2 / GATA2 cellule trasdotte in CFC-test e la corrispondente cytospins Wright-colorate che rappresentano eritroide (E), macrofagi (M), Granulociti (Gr) e High proliferativa colonie potenziali (centrali è). Barre di scala per CFC-test, 250 micron, per cytospins, 20 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. GATA2 / TAL1 e GATA2 / TAL1 / differenziazione LMO2 indotta hPSCs (A) immagini fase di contrasto GATA2 / TAL1 / LMO2differenziazione indotta in hESC H1 a giorni 2, 4, 6 e 8; Barra della scala, 100 micron. (B) analisi citofluorimetrica di GATA2 / cellule TAL1 indotte sottoposti endoteliale di transizione ematopoietiche il giorno 3 di differenziazione: VE-caderina cellule + acquisiscono espressione di SE marcatore CD226. Una piccola percentuale di cellule endoteliali esprimono CD73 (non-HE). (C) colorazione immunofluorescente di GATA2 / differenziazione TAL1 indotta in H1 hESC, giorno 5; VE-caderina + cellule (verdi) acquisiscono espressione di ematopoietiche CD43 indicatore (rosso). (D) analisi citofluorimetrica di GATA2 / TAL1 / LMO2-indotta culture ematopoietiche in sospensione il giorno 14 post-trasduzione seguenti espansione in mezzo privo di siero integrato con SCF, TPO, EPO e bFGF; (E) Tipi di colonie ematopoietiche formate in CFC-test da GATA2 / TAL1 / LMO2 cellsand differenziata corrispondente cytospins Wright-colorate che rappresentano eritroide (E), macrofagi (M), e Megakaryocytes (Mc). Barre di scala per CFC-test, 250 micron, per cytospins, 20 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Ottimizzazione della procedura lentivirali trasduzione (A) trasduzione di H1 hESC con differenti MOI di GFP lentivirus.. (B) La vitalità cellulare e l'efficienza differenziazione culture trasdotte con GATA2 / TAL1 / LMO2 a bassa (1 per ciascun virus) e alto (2 per ogni virus) MOI.
Il metodo sopra descritto per ematopoietiche differenziazione hPSCs di sovraespressione di TF, rappresenta un metodo veloce ed efficace per la generazione di HE e mieloidi e erytho-magakaryocytic progenitori da hESC e iPSCs, consentendo in tal modo la produzione di fino a 30 milioni di cellule del sangue dal un milione di cellule staminali pluripotenti 10. Questo metodo esposto differenziazione consistente in più di hESC e iPSCs linee 10. Durante differenziazione per ETV2 e GATA2, fattori GATA1 nonché i fattori GATA2 e TAL1, cellule formano il sangue producendo endotelio, HE e sottoposti a un endotelio di transizione ematopoietiche. La formazione di SE si osserva di solito tra i giorni 3 e 4 di differenziazione. L'aggiunta di LMO2, un co-fattore trascrizionale di TAL1, al GATA2 e la combinazione TAL1, ha aumentato significativamente la robustezza della differenziazione, mentre lo stadio è diventato notevolmente contratta.
Il successo di differenziazione direttazione di hPSCs di fattori di trascrizione dipende principalmente (i) una efficace erogazione di acidi nucleici nelle cellule, (ii) vitalità cellulare dopo manipolazioni genetiche, e (iii) un dizionario efficace di trascritti esogeni all'interno della cellula.
Una delle fasi principali del metodo descritto è la produzione di unità lentivirali efficaci, che dipende da una precisa pH buffer per la trasfezione delle cellule HEK 293T, e l'assenza di contaminanti endotossina in tutte le fasi di produzione e di trasduzione esperimenti virali. L'integrità di tutti i costrutti, compreso l'imballaggio e buste plasmidi, deve essere verificata se segni di produzione virale in cellule 293T HEK si osserva 13.
Il design protocollo di differenziazione utilizzando combinazioni di fattori di trascrizione dovrebbe prendere in considerazione diverse variabili. Alta efficienza di trasduzione virale è importante per la differenziazione di successo. Poiché l'efficienza di trasduzione dipende dal metodo usato per il virusproduzione e purificazione, ottimizzare HPSC trasduzione utilizzando un vettore lentivirale-GFP è raccomandata (figura 4A). Viral integrazione seguente trasduzione vanno verificate mediante genomica PCR con primer specifici transgene (Tabella 3). Ottimizzazione differenziazione dovrebbe comprendere anche la regolazione della concentrazione lentivirale nella miscela di reazione. Un relativamente bassa quantità di virus, MOI di 0,5-1, è in grado di indurre il differenziamento HPSC. Mentre un più alto MOI aumenta l'efficienza della differenziazione, aumenta anche la morte cellulare (Figura 4B). Ulteriori fase di ottimizzazione può includere regolazione del rapporto MOI per ciascun virus nella miscela di reazione. In GATA2 / ETV2 trasdotta culture, raddoppiando il MOI per GATA2, rispetto al ETV2, aumenta l'efficacia della differenziazione. Per GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1 e GATA2 / TAL1 / LMO2 pari MOI per ogni virus è ottimale.
A seguito di trasduzione con TF, una vasta maggioranza di cellule UNDERWent differenziazione angiohematopoietic mentre pochissime cellule mantenute una morfologia indifferenziata. Poiché PSIN-EF1α vettori lentivirali incorporano la resistenza agli antibiotici, trattamento delle colture con puromicina può essere utilizzata per eliminare le cellule indifferenziate residue.
La formazione di cellule con caratteristiche morfologie endoteliali, e successive globuli rotonde, indicano una differenziazione di successo. In media, la combinazione GATA2 / ETV2 produce 40-50% di CD43 + VE-caderina cellule +/- del sangue di giorno 9-10 di differenziazione con un massimo di 30% di cellule rimanenti VE-caderina + CD43 -. GATA1 combinazione / ETV2 induce l'espressione CD43 più rapidamente e genera un maggior numero di cellule CD43 + rispetto alla combinazione GATA2 / ETV2. In queste culture, la maggior parte delle cellule CD43 + coesprimere VE-caderina. Nelle culture trasdotte con GATA2 / TAL1, il numero di cellule CD43 + solito raggiunge 40-50%. L'aggiunta di LMO2 a GATA2 / TAL1 accelera notevolmente e aumenta la produzione di sangue, e contrae notevolmente la fase endoteliale dello sviluppo.
Saggi che formano colonie dovrebbero essere utilizzati per determinare la frequenza e il tipo di progenitori emopoietici indotte. La natura delle cellule che formano colonie può essere confermata attraverso la preparazione cytospins Wright-macchiati dalle singole colonie. hPSCs trasdotte con ETV2 e GATA2 producono per lo più di grandi dimensioni (superiori a 0,5 mm di diametro) ad alto potenziale (HPP) colonie mieloidi proliferative composte di granulociti immaturi e cellule monocitiche, con alcune cellule mieloidi mature e eritroide occasionali e cellule megacariociti. In media oltre l'80% dei CFC in GATA2 / culture ETV2 trasdotte sono centrali è mieloidi. Inoltre, queste culture generano eritroidi e macrofagi colonie (Figura 2E), che di solito comprendono meno del 20% dei CFC totale. HPSC trasduzione con ETV2 e GATA1 aumenta significativamente °e percentuale di CFC-E fino al 50%. Culture trasdotte TAL1 e GATA2 producono principalmente eritroide (oltre l'80% del totale CFC) e le colonie megacariociti (oltre il 10% del totale CFC), con pochissime colonie di macrofagi (meno del 5% del totale CFC). L'aggiunta di LMO2 al TAL1 e la combinazione GATA2 aumenta notevolmente la frequenza di cellule che formano colonie con eritro-megacariocitica potenziale 10. Il modello di attività CFC dopo trasduzione con le combinazioni descritte di fattori di trascrizione è coerente tra le diverse linee di hESC e hiPSC 10.
In sintesi, la sovraespressione lentiviral-mediata hPSCs è uno strumento relativamente rapido ed efficiente per l'induzione di HE e sangue utilizzando TF. Questo sistema può essere utilizzato anche per valutare la capacità di differenziazione altre TF e identificare quelli che sono necessari per endoteliale e specifica ematopoietiche. Tuttavia, l'attuale protocollo ha un'utilità limitata per gli studi di exintracellulare segnalazione coinvolti nell'induzione di SE, in quanto utilizza TF per aggirare la segnalazione mediata da recettori di superficie. Anche se l'attuale protocollo descrive la produzione di sangue con l'espressione costitutiva di un transgene, risultati simili potrebbero essere ottenuti utilizzando mRNA modificati 10.
IS è socio fondatore e consulente per Cynata.
We thank Matt Raymond for editorial assistance. This work was supported by funds from the National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221, and P51 RR000167) and The Charlotte Geyer Foundation.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Table 1. Induction of hPSCs differentiation with trancription factors and analysis of hemogenic endothelium and blood cells. | |||
pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61061 | Lentiviral Vector |
pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61063 | Lentiviral Vector |
pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61062 | Lentiviral Vector |
pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro | Addgene | Plasmid #61064 | Lentiviral Vector |
Hexadimethrine bromide (Polybrene) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Cationic polymer used to increase the efficiency of infection |
Y-27632 (Dihydrochloride) ROCK inhibitor | STEMCELL Technologies | 72302 | RHO/ROCK pathway inhibitor Inhibits ROCK |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies | A11105-01 | Cell Dissociation Reagent |
Incomplete (growth factor- free) culture medium mTeSR1 Custom formulation | WiCell Research Institute (Madison, WI) | MCF | Serum-free mTeSR1 medium without bFGF and TGFb |
human SCF | Peprotech | 300-07 | Premium grade |
human TPO | Peprotech | 300-18 | Research grade |
human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Premium grade |
CD144 (VE-cad) FITC | BD Biosciences | 560411 | Endothelial marker (FACS) |
CD226 PE | BD Biosciences | 338305 | Hematopoietic (FACS) |
CD43 PE | BD Biosciences | 560199 | Hematopoietic (FACS) |
CD73 APC | R&D Systems | FAB5795A | Endothelial marker (FACS) |
CD45 APC | BD Biosciences | 555485 | Hematopoietic (FACS) |
7AAD | Life Technologies | A1310 | Live/Dead assay (FACS) |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Cell fixation |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | Permeabilization |
FBS | Fisher Scientific | SH3007003 | Fetal bovine serum |
Mouse anti-human CD43 | BD Biosciences | 551457 | Pure, primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining |
Rabbit anti-human VE-cadherin | BenderMedSystem | BMS158 | Primary (IF) |
Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated | JacksonResearch | 715-486-152 | Secondary (IF) |
Anti-mouse Alexa Fluor 594-conjugated | JacksonResearch | 715-516-150 | Secondary (IF) |
DAPI nucleic acid stain | Life Technologies | D1306 | Live/Dead assay (IF) |
Clonogenic medium MethoCult H4435 Enriched | STEMCELL Technologies | 4435 | CFC-assay |
Wright Stain solution | Sigma -Aldrich | 32857 | Staining cytospins |
Table 2. hPSCs culture. | |||
Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs) | WiCell Research Institute (Madison, WI) | hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) transgene-free induced Pluripotent Stem Cells | hPSCs are able to self-renew and to differentiate into cells of three germ layers |
Complete serum-free medium for culture of hPSCs mTeSR1 media | WiCell Research Institute (Madison, WI) | M500 | Serum-free medium with growth factors for feeder free culture of ESC/iPSCs |
Matrigel | BD Biosciences/ Corning | 356234 | Matrix for maintenance of human ESC/iPSCs |
DMEM/F-12, powder | Life Technologies | 12500-062 | Basal Medium |
HyClone Dulbecco's PBS powder | Fisher Scientific | dSH30013.04 | PBS |
Dispase II, powder | Life Technologies | 17105-041 | Neutral protease, Cell dissociation |
Table 3. Primers for detection of virus genomic integration. | |||
Primer's Name | Forward (Fwd) 5’ -->3’ | Reverse (Rev) 5’-->3’ | Discription |
pSIN EF1a Fwd | TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA | -- | EF1a promoter sequence |
GATA1 Rev | -- | TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC | Coding Region |
GATA2 Rev | -- | GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG | Coding Region |
TAL1 Rev | -- | AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT | Coding Region |
LMO2 Rev | -- | GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC | Coding Region |
ETV2 Rev | -- | GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC | Coding Region |
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