Измерения воздействия бактерий на

Яйцо-в-червь (ЕНИ) анализ является полезным методом для количественной яйцекладки поведения. Изменения в откладки яиц может быть поведенческая реакция модельного организма Caenorhabditis Элеганс Потенциально вредных экологических веществ, таких как произведенные патогенных бактерий.

C. Элеганс яйцекладка поведение влияют сигналы окружающей среды, такие как осмолярность ¹ и вибрации ^2. При полном отсутствии питания C. Элеганс также прекратить яйцекладка и сохранять оплодотворенные яйца в матке ^3. Тем не менее, влияние различных источников пищи, особенно патогенных бактерий и, в частности Enterococcus фекальный, на яйцекладка поведение не хорошо описана. Яйцо-в-червь (ЕНИ) анализ является полезным инструментом для количественной оценки влияния различных видов бактерий, в данном случае Е. фекальный, на яйцекладка поведения.

ЕНИ анализов включает подсчет количества яиц сохраняется в матке C. Элеганс ^4. Анализ ЕНИ включает отбеливание поставил, беременной взрослого C. Элеганс для удаления кутикулы и отделите сохранил яйца от животного. До отбеливания, червей подвергаются воздействию бактерий (или любой другой тип экологических кий) В течение фиксированного периода времени. После отбеливания, одна очень легко рассчитывать количество яиц, сохранил в матку червей. В этом анализе количественного увеличения яйцо удержание после E. фекальный воздействие может быть легко измерено. Анализ EIW поведенческие анализа, которые могут быть использованы для скрининга потенциально патогенных бактерий или наличие токсинов окружающей среды. Кроме того, анализ EIW может быть инструментом для скрининга препаратов, которые влияют на нейротрансмиттер сигнализации с яйцекладки поведение модулируется нейротрансмиттеров, таких как серотонин и ацетилхолин ^5-9.

Caenorhabditis Элеганс, микроскопический, свободной жизни аскариды, является модельным организмом традиционно используется для изучения и развития клеточных сигнальных процессах из-за его прозрачной анатомии, хорошо характеризуется, С-геномом, последовательность, короткая поколение времени, и генетической гомологии для человека . Совсем недавно С. Элеганс стала модель организма в области экологической токсикологии и врожденный иммунитет ^{10, 11.}

Эти самооплодотворяющимися гермафродиты черви становятся половозрелыми в течение двух-трех дней вылупления из яйца. Во время его жизненного цикла, C. Элеганс проходит через четыре личиночной стадии (L1-L4), до достижения совершеннолетия. Один изолированный гермафродитом может производить, в среднем, 300 потомство в течение трех дней пик плодовитости. В зрелом репродуктивном C. Элеганс гермафродиты, оплодотворенные яйца задерживаются в матке в течение нескольких часов перед укладкой.Нормальное количество яиц, хранившихся в матке в любой момент времени (во время пика плодовитости) составляет от десяти до пятнадцати ^12. Число яиц в матке является функцией как скорость производства яиц и скорость откладки яиц. Оплодотворенные яйцеклетки изгоняется из полости матки на сокращения вульвы шестнадцать мышц, расположенных вокруг открытия вульвы ^13. Гермафродит конкретных двигательных нейронов (HSN), и VC синапсов мотонейронов на вульвы мышц, влияющих сокращение мышц и, следовательно, яйценоскость поведения ^5,7,13,14. Высылка яйца из матки происходит за счет скоординированной деятельности нейронов и мышц.

Лаборатория культур C. Элеганс, как правило, поднял на диете из непатогенных кишечная палочка OP50. В природной среде, C. Элеганс вступают в контакт с различных пищевых источников, таких как патогенные бактерии, которые могут быть потенциально вредными. Под воздействием вредных веществ вокружающей среде, C. Элеганс сохранить яйца, пока окружающая среда не станет более благоприятной. Предположительно это яйцо удержания усилия, чтобы защитить их потомство.

В этом яйцо в червя (ЕНИ) анализа, C. Элеганс подвергаются воздействию потенциально патогенных бактерий, Enterococcus фекальный, который находится в окружающей среде. Воздействие патогенных форм E. фекальный может привести к постоянной кишечной инфекции и даже смерти в C. Элеганс ^15. Воздействие других форм патогенных бактерий, как было показано, влияют на яйцо удержание ^16,17, однако эффект не был количественно. Кроме того, эффект мягко патогенных штаммов E. фекальный, штаммы, которые не сразу смертельным, на яйцекладка поведении не было изучено.

ЕНИ анализов включает подсчет количества яиц сохраняется в матке C. Элеганс ^4. Хотя C. Элеганспрозрачны, яйца накапливается в матке может быть трудно определить количественно в интактного животного. Анализ ЕНИ включает отбеливание беременной взрослого C. Элеганс, которые подвергались воздействию бактерий в течение фиксированного периода времени. Раствор отбеливателя растворяет кутикулу внешней оставляя за яйца. Яйца преломления к воздействию отбеливатель в связи с наличием защитного скорлупы. После отбеливания, одна очень легко рассчитывать количество яиц выпустили из матки червей на отбеливание.

Анализ, описанный простой, недорогой и быстрый метод для количественного определения количества яиц в матке в одно время, и, таким образом количественной оценки последствий E. фекальный на яйцо удержания. Этот анализ может быть использован для количественной оценки влияния других видов бактерий, токсины окружающей среды или препаратов на яйцо удержания. Этот анализ также имеет потенциал для использования в качестве экрана для бактериальной патогенности.

1) Получение медиа Нематоды роста (НГО)

1. Чтобы 50 пластин, добавьте 1,5 г NaCl, 8,5 г Ultrapure агар и 1,25 г пептона до 1 Lflask.
2. Добавить 487,5 мл дН ₂ O в колбу. Вихревой осторожно перемешать и охватывают открытие колбе с куском алюминиевой фольги.
3. Стерилизовать раствор в автоклаве при стандартных условиях (121 фунтов на квадратный дюйм, 120 ° C, 20 мин).
4. Дайте раствору остыть до 45 ° С на водяной бане.
5. К раствору, добавьте следующую по порядку: 500 мкл холестерина из 5 мг / мл маточного раствора (растворяют в этаноле), 500 мкл 1 М CaCl _2, 500 мкл 1 М MgSO ₄ и 12,5 мл КПО ₄ буфера (54,15 г KH ₂ PO ₄ и 17,8 г К ₂ НРО ₄ в 500 мл дН ₂ O), как описано в ^18.
6. Использование стерильной пипеткой, добавляют 10 мл раствора агара, чтобы каждые 60 мм чашки Петри полистирола. Разрешить СМИ укрепить при комнатной температуре OvernIGHT.

2) Получение B Бульон E. Медиа палочка

1. Чтобы пяти культур 100 мл, добавить 5,0 г бактотриптон, 2,5 г дрожжевого экстракта, 5,0 г NaCl в стакан.
2. Добавить стерильной дистиллированной водой до конечного объема 500 мл. Раствор нагревают на горячей плите, при помешивании до растворенные вещества не растворятся.
3. Залить 100 мл бульона B на пять стеклянных бутылках (по крайней мере 200 мл объема).
4. Стерилизовать решений в автоклаве при стандартных условиях (121 фунтов на квадратный дюйм, 120 ° С, 20 минут).
5. Разрешить B бульон охлаждают до комнатной температуры перед использованием.

3) Сеялки C. Плиты Элеганс обслуживание

1. После того как NGM пластин высохнуть при комнатной температуре в течение по крайней мере одной недели, один прививку 100 мл культурального бульона B с помощью нескольких колоний E. палочка (OP50).
2. Расти E. кишечной культивирования при 37 ° С в течение ночи.
3. Пипетка одну-две капли (около 10081; л) из OP50 культуры на центр каждой пластины NGM. Пластины обычно сложены крышки вверх. Когда пипетки (посев), начинают с помощью пипетки культуры на тарелку в нижней части стопки. Работа ваш путь каждого стека. Попытка не для перемещения пластин после посева, поскольку важно, чтобы культура не слишком близко к краю пластины.
4. Разрешить семенами пластин высохнуть при комнатной температуре в течение не менее одной недели, прежде чем использовать.
5. Отобранные пластины хранятся (перевернутого) в запечатанных пластиковых контейнерах при комнатной температуре.

4) поддержание C. Штаммы Элеганс

1. Для поддержания сытых C. Элеганс акции, использовать червя выбрать, чтобы переместить три L4S или беременной взрослых на новый, отобранный NGM пластины каждые 3-4 дня.
2. Магазин пластин (перевернутый), предпочтительно внутри инкубатор при 15 - 22 ° С. Культуры в анализах, описанных хранили при 20 ° С. Элеганс развития зависит от температуры. Как Maintenaсть повышение температуры, время между стадиями развития уменьшается.

5) Подготовка триптической соевый агар (TSA) E. фекальный Культура СМИ

1. Чтобы 50 пластин, измерения 500 мл стерильной дистиллированной водой в колбу и довести до кипения, помешивая, на плите.
2. Добавить 20 г агара порошкообразных TSA в колбу и позволить, чтобы растворить.
3. Стерилизовать решений в автоклаве при стандартных условиях (121 фунтов на квадратный дюйм, 120 ° С, 20 минут).
4. Дайте раствору остыть до 45 ° С на водяной бане.
5. Использование стерильной пипеткой, добавляют 10 мл раствора агара, чтобы каждые 60 мм чашки Петри полистирола. Разрешить СМИ затвердевать при комнатной температуре на ночь.

6) подготовка триптической соевый бульон (TSB) E. фекальный Культура СМИ

1. Чтобы 250 трубы культуры, измерения 500 мл стерильной дистиллированной воды в колбу и теплой на плите при перемешивании.
2. Добавьте 15 г порошка агар TSB в колбу и позволить порошку до растворения.
3. Стерилизовать решений в автоклаве при стандартных условиях (121 фунтов на квадратный дюйм, 120 ° С, 20 минут).
4. Разрешить раствор охлаждают до комнатной температуры, затем пипеткой 2 мл в стерильные 5 мл пробирок.

7) подготовка сердечно-мозговым вливания (BHI) СМИ, стрептомицин, для E. фекальный культуры

1. Измерьте 500 мл стерильной дистиллированной водой в колбу и довести до кипения, помешивая, на плите.
2. Добавить 26 г среды BHI в колбу и позволить, чтобы растворить.
3. Стерилизовать решений в автоклаве при стандартных условиях (121 фунтов на квадратный дюйм, 120 ° С, 20 минут).
4. Разрешить раствор охлаждают до 45 ° С на водяной бане.
5. С использованием стерильной техники, добавляют 0,5 мл 10 мг / мл маточного раствора стрептомицина и вихрем перемешать.
6. Добавить 10 мл раствора в каждую 60 мм чашку Петри полистирола.
7. Разрешить СМИ затвердевать при комнатной температуре на ночь. Магазин пластин (перевернутого) при 4 ° С вплоть до нескольких часов перед использованием.

8) поддержание E. Штаммы фекальный

1. Для поддержания E. фекальный акции, использовать стерильную петлю, чтобы подряд отдельных колоний на отдельные триптическому соевый агар (TSA) пластин.
2. Grow культур при 37 ° С в течение ночи. Магазин пластин (перевернутая) в запечатанном пакете или коробке при комнатной температуре в течение нескольких недель.

9) подготовка E. фекальный Пластины для анализа ЕНИ

1. Инокулируйте 2 мл TSB культуры с колонии E. фекальный и инкубировать в течение ночи при 37 ° С.
2. Внесите 20 мкл E. фекальный культуры на центр подготовленных BHI-стрептомицин пластины и инкубировать в течение ночи при 37 ° С.

10) Подготовка E. Пластины для кишечной ЕНИ анализа (управления пластины)

1. Привить 100 мл B-Broй культуры с колонии E. кишечной OP50 и инкубируют в течение ночи при 37 ° C
2. Пипеткой 20 мкл OP50 культуры на центр затравки NGM пластины и позволить семенами пластин высохнуть при комнатной температуре в течение ночи.

11) Яйцо в Пробирной Worm

1. Возьмите 15 - 20-L4 поставил C. Элеганс (рис. 1) на центр газон бактерий на подготовленную BHI-Стрептококковое-E. фекальный пластины. Будьте осторожны, чтобы не передавать много OP50 к пластине BHI. Выбор такого же количества L4S для управления NGM-OP50 пластины.
2. Планшеты инкубируют в течение 40 ч при 20 ° С.
3. Подготовить 20% раствором хлорной извести. Смешайте коммерческих отбеливателем (6,0% гипохлорита натрия) с соответствующим объемом дистиллированной воды.
4. Добавить 10 мкл капли раствора отбеливателя до десяти различных местах на пластиковой крышкой (червя или бактериальной табличку).
5. Использование червей выбор, передачи одного червя в каждой отбеливателя капли. Аккуратно водоворот кончикПика в капли отбеливателя, чтобы убедиться, червь смыла конце выбор (подтвердить, просмотрев капли при вскрытии микроскопом).
6. Разрешить кутикулы распустить в течение примерно 10 минут или пока черви не распахнулась, изгнав яйца (рис. 2). Будьте осторожны, чтобы не передавать яйца от пластины.
7. Использование рассекает микроскопом, подсчитать яйца в каждую каплю отбеливателя.

Этот анализ позволяет количественно количество яиц сохранены в C. Элеганс после воздействия E. фекальный. L4 постановке черви (характеризуется прозрачной открытое пространство над их вульвы, рисунок 1), подвергают воздействию E. фекальный до зрелого возраста. После сорока часов воздействия E. фекальный, отбеливание проводилось. Как кутикулы распалась в капли отбеливателя, яйца стали более очевидными (рис. 2). Количество удержанных яиц легко количественно путем подсчета при просмотре под рассекает микроскопом.

Более яйца были сохранены в присутствии E. фекальный штаммов по сравнению с E. OP50 кишечной управления (рис. 3). Существует несколько вариантов в действие любого одного штамма E. фекальный на отдельных червей, как видно из планки погрешностей. Однако эффект штаммов E. фекальный яйцо на удержание в пределахНаселение же червей значительно отличаться от контроля. Степень яйцо удержание вызвано различными штаммами E. фекальный проверенных также может варьироваться. Этот разнообразный эффект может быть связано с выражением различных факторов вирулентности каждого штамма.

Рисунок 1. Выявление L4 поставил C. Элеганс.. L4 стадии C. Элеганс личинки являются крупнейшими личинок на пластинах-лишь немного короче, чем взрослые черви. L4S тоньше, чем у взрослых, а также, в связи с отсутствием нераспределенной яйца (которые делают взрослые черви немного шире). B. После выявления тех личинок, которые немного короче, чем у взрослых, L4-ступенчатую C. Элеганс более четкого определения более легкими полумесяца место расположено всередине своего тела (черная стрелка). Это пятно видна в меньшем личинки (L2 и L3 этапов), но отсутствует у взрослых. Все изображения были взяты из червей на NGM пластин с камеры, установленной на вскрытии микроскоп (40X и 50X увеличением для А и В, соответственно). Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .

Рисунок 2. Раствором хлорной извести растворяется C. Элеганс кутикулы с течением времени. поставил взрослого червя помещают в капле раствор хлорной извести (A). За 9:55 минут, кутикулу червь начинает растворяться (BF). Поскольку большинство кутикула растворяется, яйца становятся видимыми (F черными стрелками). Жировые запасы внутри червя ALS Ø медленно растворяются в отбеливатель, и остаются видимыми (F, серые стрелки). Все изображения были взяты из червей на NGM пластин с камеры, установленной на вскрытии микроскоп (40X). Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .

Рисунок 3. Некоторые E. фекальный штаммов вызвать увеличение удержания яйца после 40 часов экспозиции. Черви воздействию двух из шести E. фекальный штаммов (оранжевые столбики) показал повышенный уровень удержания яйца по сравнению с червями кормили E. палочка (OP50) контрольного штамма (синие полосы). Десять червей кормили каждого штамма бактерий в каждом испытании. Испытания проводили трижды в разные дни. * Обозначает р <0,05 (Стьюдента-тест)."> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Наиболее важных шагов в успешного проведения этого анализа: 1) с помощью сытых запасов C. Элеганс, 2) культивирование одного типа бактерий на планшет для анализа, 3) точно идентифицировать постановке L4 червей для воздействия E. фекальный, 4) сохранение Выдержка Е. фекальный последовательным во всех испытаниях и 5) отбеливание время не должно превышать десяти минут, чтобы предотвратить распад яйцо.

Для этого анализа важно выбрать здоровые, сытые червей. Материнское голодание может повлиять плодовитость и рост потомства ^19,20, поэтому важно, что черви были сыты в течение нескольких поколений, прежде чем проведения этого анализа. Сытых запас червей легко поддерживается, просто передавая часть взрослых червей в новый семенами NGM пластины каждые 2-3 дня. Через два дня до анализа взрослых червей должен быть сделан на свежий газон OP50, чтобы иметь достаточную L4 потомство доступны для анализа.

Точно выбора постановке червей для этого анализа важно по нескольким причинам. Во-первых, важно, чтобы рассчитывать яйцо удержание в течение т он время производство яиц / прокладки в самооплодотворяющимися C. Элеганс. Производство яиц происходит только в течение первых пяти дней C. Элеганс зрелом возрасте (пик около 40 часов после L4) и быстро с последующим уменьшением ^4,21. Взрослые черви живут в среднем в течение двух-трех недель, так что многие взрослые черви живут, по крайней мере неделю, пока не производят оплодотворенных яйцеклеток. Таким образом, важно, чтобы убедиться, что анализ EIW не выполняется на unstaged взрослых червей неизвестного возраста.

Вторая причина важно использовать животных в постановке анализа ЕНИ, так что время в развитии, при котором черви были подвержены бактерий, токсинов или наркотиков жестко контролируется. Культуры C. Элеганс, как правило, синхронизированы на яйцо, или L1 L4 этапов. L4 этапе была использована для этого анализа из-за опасения, что длительное воздействие на E. фекальный приведет к летальности до червяков стали беременные взрослых.

Яйцо удержания отражает баланс между производством яйца и откладки яиц. Анализ ЕНИ само по себе не отличить ли количество яиц сохраняется в матке связано с изменениями в производстве яйца или откладки яиц. Это особенно проблемой, если червей обрабатывают бактериальным штаммом или токсин сохраняет меньше яиц, чем в контрольной группе. В этих случаях особенно, последующий размер выводка анализа должно быть сделано. Анализы размер выводка количественно количество яиц, отложенных в течение ⁴ репродуктивной жизни червя . Если размер выводка червей в экспериментальных и контрольных групп одинаковы, то различия в яйце удержания может быть связано с различиями в яйцекладки поведения. Поскольку маловероятно, что мягко патогенные штаммы бактерий, как E. фекальный бы действовать, чтобы увеличить производство яиц, то разумно предположить, что увеличение удержания яйца после воздействия E. фекальный (как показано на рисунке 3) является результатом снижения яйценоскости поведения.

Анализ ЕНИ также не определяет механизм, с помощью которых бактерии изменяют яйцо удержания. Вполне возможно, что С. Элеганс может сохранить яйца, потому патогенных бактерий влияет на кормление в колонизации и блокировки открывания рта или потому, что он является плохим источником пищи. Возможно также, что бактерии могут колонизировать и блокировать открытие вульвы, или влияют на функции клеток в яйцекладка системы. Дальнейший анализ необходим для определения механизма, с помощью бееCH яйцо удержания меняется.

Этот анализ ЕНИ могут быть легко изменены, чтобы определить эффекты многих видов соединений на яйцо удержания. Кроме того, этот анализ достаточно прост, что она может быть включена в экран для идентификации генов, либо в хост (C. Элеганс) или патогена (E. фекальный), необходимые для влияния патогена. Анализ EIW также могут быть использованы для выявления генов, необходимых для регулирования яйцекладки себя. С. Элеганс яйцекладка поведение модулируется нейротрансмиттеров, таких как серотонин и ацетилхолин ^5-9, и требует скоординированных активности нескольких нейронов и мышечных групп ^12. ЕНИ анализы были и продолжают быть использован для идентификации генов, важных для нейромедиатора сигнализации и / или мышечной активности. EIW анализов дать количественную, а не качественный анализ важную С. Элеганс поведения.

Авторы хотели бы поблагодарить июня Миддлтон для подачи E. фекальный штаммов и для руководства с культурой бактерий. C. Элеганс были предоставлены CGC, которая финансируется за счет НИЗ Управления программ исследовательской инфраструктуры (P40 OD010440).