에 박테리아의 효과를 측정

계란에서 웜 (EIW) 분석은 달걀 누워 행동을 정량화 할 수있는 유용한 방법입니다. 달걀 부설의 변화는 모델 유기체의 행동 반응 할 수 있습니다 Caenorhabditis의 엘레와 같은 병원성 박테리아에 의해 생성 된 것과 같은 잠재적으로 유해한 환경 물질.

C. elegans의 달걀 누워 동작은 같은 삼투압 ^{1과 진동이} 같은 환경 단서에 의해 영향을받습니다. 음식 C.의 총 부재 엘레은 달걀 부설을 중지하고 자신의 자궁 ³ 수정란을 유지합니다. 그러나 특히 다른 음식의 근원, 특히 병원성 박테리아와 계란을 낳는 행동에 엔테로 faecalis의 효과는 잘 특성화되어 있지 않습니다. 계란에서 웜 (EIW) 분석이 경우 E.에서 박테리아의 다른 유형의 효과를 정량화 할 수있는 유용한 도구입니다 faecalis, 달걀 누워 동작합니다.

EIW 분석 실험 C의 자궁에 남아 계란의 수를 계산 포함 엘레 ^4. EIW 분석은 단계적 표백, 임신하는 성인 C.를 포함 엘레는 표피를 제거하고 동물에서 유지 계란을 분리합니다. 이전 표백, 웜 박테리아 (또는 환경 큐의 모든 유형에 노출되는) 시간의 고정 기간 동안. 표백 후, 하나는 아주 쉽게 벌레의 자궁 안에 유지 계란의 수를 계산 할 수 있습니다. E. 후 계란 보존이 분석에서 정량화 증가 faecalis 노출을 쉽게 측정 할 수 있습니다. EIW 분석은 잠재적 병원성 세균이나 환경 독소의 존재를 선별하는 데 사용할 수 있습니다 행동 분석이다. 또한, EIW 분석 계란을 낳는 행동과 같은 세로토닌과 아세틸 콜린 ^5-9과 같은 신경 전달 물질에 의해 조절하기 때문에 신호 전달 물질에 영향을 미치는 의약품에 대한 화면 도구가 될 수 있습니다.

Caenorhabditis의 엘레, 현미경, 무료 - 생활 거위는 전통적으로 인간 때문에 투명 해부학, 잘 특성화 개발, 완벽하게 배열 된 게놈, 짧은 세대 시간 및 유전 상동의 발달 및 세포 신호 전달 과정을 연구하는 데 사용되는 모델 생물이다 . 더 최근에, C. 엘레 환경 독성학 및 선천성 면역 ^{10, 11} 분야의 모델 생물이되었다.

이러한 자기 비옥 자웅 동체 웜 계란에서 부화 2 ~ 3 일 이내에 성적으로 성숙된다. 수명주기, C. 동안 엘레 성인기에 도달하기 전에, 네 애벌레 단계 (L1-L4)를 통해 전달합니다. 하나의 고립 된 자웅 동체 피크 다산 3 일 안에 평균 300 자식을 생성 할 수 있습니다. 생식 성숙 C.에 엘레 자웅 동체는 수정란이 마련되기 전에 몇 시간 동안 자궁 내에서 유지됩니다.한 번에 자궁에 저장된 계란의 정상적인 수 (피크 생산력 중) 열 사이에 다섯 ^12. 자궁에 계란의 수는 계란 생산의 속도와 달걀 누워의 속도의 함수이다. 수정란은 외음부 ^(13)의 개구부 주위에 배치 여섯 외음부 근육의 수축에 의해 자궁에서 추방된다. 자웅 동체 특정 motorneurons (HSN)의 따라서 VC motorneurons 근육 수축에 영향을 미치는 외음부 근육 위에 시냅스와 계란을 낳는 행동 ^{5,7,13,14합니다.} 자궁 계란의 추방은 신경과 근육의 조정 활동으로 인해 발생합니다.

C.의 실험실 문화 엘레은 일반적으로 비병원성 대장균 OP50의 다이어트에 발생합니다. 자연 환경, C.에게있는 엘레 같은 병원성 박테리아와 같은 음식 소스의 다양한 접촉, 그 잠재적으로 유해 할 수 있습니다. 유해한 물질에 노출되었을 때환경, C. 환경이 더 유리한 될 때까지 elegans의 계란을 유지합니다. 아마이 계란 보존 그들의 자손을 보호하기 위해 노력합니다.

웜 (EIW) 분석, C.이 계란 엘레은 잠재적으로 병원성 세균, 환경에서 발견되는 엔테로 faecalis에 노출되어 있습니다. E.의 병원성 형태에 노출 faecalis는 C의 지속적인 창자 감염, 심지어 사망을 일으킬 수 있습니다 엘레 ^15. 병원성 세균의 다른 형태의 노출이 계란 유지 ^{16,17에 영향을} 미치는 것으로 알려져있다, 그러나 효과는 정량화되지 않았습니다. E.의 또한 약간 병원성의 효과는 변종 faecalis는 계란을 낳는 행동에 즉시 치명적인없는 긴장이 연구되지 않았습니다.

EIW 분석 실험 C의 자궁에 남아 계란의 수를 계산 포함 엘레 ^4. 비록 C. 엘레투명, 자궁에 축적 계란 그대로 동​​물의 정량화하기 어려울 수 있습니다. EIW 분석은 임신하는 성인 C. 표백 포함 시간의 고정 기간 동안 세균에 노출 된 엘레 간스. 표백제 솔루션은 뒤에 계란을 떠나 외부 큐티클을 녹인다. 계란은 보호 껍질의 존재로 인해 표백제의 효과 굴절입니다. 표백 후, 하나는 아주 쉽게 표백에 벌레의 자궁에서 풀어 계란의 수를 계산 할 수 있습니다.

기술 분석은 한 번에 자궁에 계란의 수를 정량화 할 수있는 간단하고 저렴하고 빠른 방법입니다, 따라서 E의 효과를 정량화 계란 유지에 faecalis. 이 분석은 계란 보존에 박테리아, 환경 독소 또는 약물의 다른 종류의 효과를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 분석은 세균의 병원성에 대한 화면으로 사용할 가능성이있다.

선충류 성장 미디어 1) 준비 (NGM)

1. 50 판을 만들기 위해 1.5 g 염화나트륨 8.5 g 초순수 한천과 1 Lflask 1.25 g의 펩톤을 추가합니다.
2. 플라스크에 dH보다 ₂ O의 487.5 ML을 추가합니다. 알루미늄 호일의 조각으로 플라스크의 입구를 혼합 커버 부드럽게 소용돌이.
3. 표준 조건 (121 PSI, 120 ° C, 20 분)에서 고압 증기 멸균하여 솔루션을 소독.
4. 솔루션 수욕에서 45 ° C로 냉각 할 수 있습니다.
5. 5 MG / ML 주식 솔루션 (에탄올에 용해), 500 μL 1 M _{염화칼슘,} 500 μL 1 M _황산 마그네슘, 12.5 ML KPO ₄ 버퍼 (54.15 g에서 500 μL 콜레스테롤 : 솔루션에 순서대로 다음을 추가 dH보다 ₂ O 500 ML에있는 KH ₂ PO ₄ 17.8 g K ₂ HPO _4)와 같은 ¹⁸ 설명했다.
6. 멸균 피펫을 사용하여 각 60mm의 폴리스티렌 페트리 접시에 한천 용액 10ml를 추가합니다. 미디어 실내 온도 overn에서 고화 할 수 있습니다광명.

B 국물 E. 2) 준비 대장균 미디어

1. 다섯 100 ML 문화를 만들기 위해 비커에 Bacto 트립 톤, 2.5 g 효모 추출물, 5.0 g 염화나트륨 5.0 g을 추가합니다.
2. 500 ML의 최종 볼륨에 멸균 증류수를 추가합니다. 용질이 용해 될 때까지 교반하면서, 핫 플레이트에 솔루션을 가열한다.
3. 다섯 개의 유리 병 (최소 200 ML 볼륨)에 B 국물 100 ㎖를 붓는다.
4. 표준 조건 (121 PSI, 120 ° C 20 분)에서 고압 증기 멸균하여 솔루션을 소독.
5. B 국물을 사용하기 전에 실온으로 냉각 할 수 있습니다.

3) 시드 C. 엘레 유지 보수 플레이트

1. NGM 플레이트 1 주일 이상 상온에서 건조 할 수 있도록 한 후, E. 몇 식민지로 한 100 ML B 국물 문화를 접종 대장균 (OP50).
2. E. 성장 37 ° C 하룻밤 대장균 문화.
3. 피펫 하나, 둘, 방울 (약 10081, L) OP50 문화의 각 NGM 플레이트의 중앙 위에. 플레이트는 일반적으로 뚜껑면을 쌓아됩니다. (시드) 피펫 팅 할 때, 스택의 하단에있는 접시에 문화를 pipetting하여 시작합니다. 각 스택을 당신의 방법을 작동합니다. 그것은 문화가 너무 가까이 접시의 가장자리에 접근하지 않는 것이 중요하기 때문에, 파종 후 판을 움직이지보십시오.
4. 시드 플레이트 사용하기 전에 적어도 한 주 동안 상온에서 건조하도록 허용합니다.
5. 시드 플레이트는 실온에서 밀폐 된 플라스틱 용기에 (반전) 저장됩니다.

4) C. 유지 엘레 균주

1. 잘 먹이 C를 유지하려면 엘레 주식은 매 3-4 일 새로운 시드 NGM 플레이트에 세 L4S 또는 임신하는 성인, 어린이, 유아를 이동하는 선택 웜을 사용합니다.
2. 매장 플레이트 (반전) 바람직 인큐베이터 안에 15에서 - 22 ° C. 기술 분석에서 문화는 20 ° C. ℃에서 보관 하였다 elegans의 발달은 온도에 따라 달라집니다. maintena로온도가 증가 NCE, 발달 단계 사이의 시간은 줄어 듭니다.

트립신 소이 한천 (TSA) E. 5) 준비 faecalis 문화 미디어

1. 열판에, 교반하면서 50 판을 만들려면, 플라스크에 멸균 증류수 500 mL를 측정하고 종기에 가져다.
2. 플라스크에 가루 TSA 한천 20 g을 솔루션을 용해 할 수 있습니다.
3. 표준 조건 (121 PSI, 120 ° C 20 분)에서 고압 증기 멸균하여 솔루션을 소독.
4. 솔루션 수욕에서 45 ° C로 냉각 할 수 있습니다.
5. 멸균 피펫을 사용하여 각 60mm의 폴리스티렌 페트리 접시에 한천 용액 10ml를 추가합니다. 미디어 하룻밤 실온에서 고화 할 수 있습니다.

트립신 간장 국물 (TSB) E. 6) 준비 faecalis 문화 미디어

1. 교반하면서 250 문화 튜브를 만들려면 철판에 플라스크 따뜻한에 멸균 증류수 500 mL를 측정합니다.
2. 플라스크에 TSB 한천 분말 15 g을 분말 용해 할 수 있습니다.
3. 표준 조건 (121 PSI, 120 ° C 20 분)에서 고압 증기 멸균하여 솔루션을 소독.
4. 무균 5 ML 테스트 튜브에 솔루션을 실내 온도까지 냉각 할 수 있도록, 다음, 피펫 2 ㎖.

7) E.에 대한 스트렙토 마이신과 뇌 심장 주입 (BHI) 미디어의 준비, faecalis 문화

1. 플라스크에 멸균 증류수 500 mL를 측정하고 열판에, 교반하면서, 종기에 가져다.
2. 플라스크에 BHI 배지 26g을 추가하고 솔루션을 용해 할 수 있습니다.
3. 표준 조건 (121 PSI, 120 ° C 20 분)에서 고압 증기 멸균하여 솔루션을 소독.
4. 솔루션 ° C의 물을 욕조에 45 식히십시오.
5. 무균 기술을 사용하여, 10 MG / ML 스트렙토 마이신 원액과 혼합하는 소용돌이의 0.5 ML를 추가합니다.
6. 각 60mm의 폴리스티렌 페트리 접시에 솔루션의 10 ML을 추가합니다.
허용 미디어 하룻밤 실온에서 응고합니다. 4에서 보관 플레이트 (반전) ° 사용하기 전에 몇 시간까지 C.

8) E. 유지 faecalis 균주

1. E.을 유지하기 faecalis 주식은 별도의 트립신 간장 한천 (TSA) 판에 연속 개별 식민지에 멸균 루프를 사용합니다.
2. 37 ° C에서 하룻밤 문화를 성장. 몇 주 동안 실온에서 밀폐 된 가방이나 상자에 보관 플레이트 (반전).

9) E. 준비 EIW 분석 실험을위한 faecalis 플레이트

1. E.의 식민지로 2 ML TSB 문화를 접종 faecalis 37에서 밤새 품어 ° C.
2. E.의 피펫 20 μL faecalis의 준비된 BHI - 스트렙토 마이신 플레이트의 중앙 위에 문화, 37 밤새 품어 ° C.

10) E. 준비 EIW 분석 실험 (제어 플레이트)에 대한 대장균 플레이트

1. 100 ML의 B-동생을 접종E.의 식민지 일 문화 대장균 OP50 37 ° C에서 하룻밤 배양
2. 피펫 20 시드되고 NGM 플레이트의 중앙 위에 OP50 문화의 μL 및 시드 플레이트 하룻밤 실온에서 건조 할 수 있습니다.

벌레 분석 11) 계란

1. 15을 선택 - 20 개최 - L4 C. 준비된 BHI-연쇄상 - E.에서 박테리아의 잔디밭의 중앙 위에 엘레 간스 (그림 1) faecalis 플레이트. BHI 판에 OP50을 많이 전송하지 않도록주의해야합니다. NGM-OP50 플레이트 컨트롤에 L4S의 같은 번호를 선택합니다.
2. 20 ℃에서 40 시간 동안 번호판을 품어
3. 20 % 표백제 솔루션을 준비합니다. 증류수의 적절한 볼륨 상업용 표백제 (6.0 % 차아 염소산 나트륨)을 섞는다.
4. 플라스틱 뚜껑에 열 별개의 위치 (웜이나 세균 판)에 표백제 용액 10 μL 방울을 추가합니다.
5. 웜 픽을 사용하여 각 표백제 드롭으로 한 웜을 전송합니다. 의 부드럽게 소용돌이 팁웜은 선택의 끝을 (해부 현미경 물방울을보고 확인) 씻어 않았는지 확인하기 위해 표백 액에 선택합니다.
6. 벌레가 알을 (그림 2) 추방 오픈 버스트 때까지 표피 약 10 분 또는 분해 할 수 있습니다. 판에서 계란을 전송하지 않도록주의하십시오.
7. 해부 현미경 사용, 표백제의 각 드롭 계란을 계산합니다.

이 분석은 하나의 C. 내에서 유지 계란의 수를 정량화 할 수 E.에 노출 된 후 엘레 faecalis. L4 벌레가 (자신의 외음부, 그림 1 위의 투명한 열린 공간이 특징) E.에 노출 된 연출 성인을 통해 faecalis. E.에 노출 마흔 시간 후 faecalis는 표백을 수행 하였다. 표피가 표백 액의 붕괴로, 계란 (그림 2) 더 명백하게되었다. 유지 계란의 수는 쉽게 현미경을 해부에서 보는 동안 계산하여 정량 하였다.

더 많은 달걀 E.의 면전에서 유지되었다 E.에 비해 faecalis 균주는 시험 대장균 OP50 컨트롤 (그림 3). 일부 변형 E. 중 하나 변형의 효과가있다 개별 웜에 faecalis는 같은 오차 막대에서 본. 그러나 E. 균주의 효과 계란 유지 내에서 faecalis벌레의 인구는 컨트롤에서 크게 달라질 않습니다. 계란 유지의 정도는 E. 다른 균주에 의해 이끌어 faecalis 테스트는 다를 수 있습니다. 이 다양한 효과는 각 균주 다른 독성 인자의 발현으로 인해 수 있습니다.

그림 1. 식별 정보 L4는 C를 개최 엘레 간스.. L4 단계 C. 엘레 애벌레는 어른 벌레보다 길이 플레이트 - 약간 짧은에 가장 큰 애벌레 존재한다. L4S은 유지 계란 (어른 벌레가 약간 넓게 만든다)입니다. B의 부재로 인해뿐만 아니라 성인,보다 얇은입니다. 성인보다 약간 짧은 그 유충을 식별 한 후, C.를 L4는 상연 엘레은 더에있는 밝은 반달 자리로 식별됩니다자신의 신체의 중간 (블랙 화살촉). 이 지점은 작은 유충 (L2 및 L3 단계)에서 볼 수 있지만, 어른의 부재이다. 모든 이미지는 해부 현미경 (A와 B 각각에 대한 40X 및 50X 배율)에 장착 된 카메라로, NGM 접시에 벌레 촬영했다. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2. 표백제 솔루션은 C를 용해 시간이 지남에 엘레은 표피. 무대 어른 벌레는 (A) 표백 용액의 액적에 배치됩니다. 5~10분을 통해, 웜의 표피 (BF) 분해하기 시작합니다. 표피의 대부분이 용해되는, 달걀 (F 검정 화살표) 표시됩니다. 웜 루게릭 병 안쪽에 지방 저장 표백제 천천히 녹여 (F, 회색 화살표) 계속 표시 O를. 모든 이미지는 해부 현미경 (40X)에 장착 된 카메라로, NGM 접시에 벌레 촬영했다. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3. 어떤 E. faecalis 균주 노출 40 시간 후 증가 계란 보존의 원인이됩니다. 여섯 E. 두에 노출 된 웜은 faecalis 균주 (주황색 막대) 웜 공급 E.에 비해 계란 보존의 증가 수준을 보여 주었다 대장균 (OP50) 제어 변형 (파란색 막대). 열 웜은 각 시험에서 각 균주를 공급 하였다. 시험은 다른 일에 세중의에서 수행 하였다. * 표시 p <0.05 (학생의 T - 테스트)."> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

성공적으로이 분석을 수행에서 가장 중요한 단계는 1) C. 잘 자란 주식을 사용하여 분석 플레이트, 3 엘레, 2) 배양 세균의 한 종류)를 정확하게 식별은 E.에 노출 L4 벌레를 개최 faecalis, 4) E.에 노출 시간을 유지 시간을 표백 모든 시련과 5 일관성 faecalis)는 계란 붕괴를 방지하기 위해 10 분 초과하지 않아야합니다.

이 분석을 위해 건강하고 잘 자란 벌레를 선택하는 것이 중요합니다. 산모 기아는 다산과 자손 ^19,20의 성장에 영향을 미칠 수있는, 따라서 웜이 잘이 분석을 수행하기 전에 여러 세대에 공급 된 것이 중요합니다. 벌레의 잘 자란 주식은 간단히 새 시드 NGM 플레이트 2 ~ 3 일 몇 성인 웜을 전송하여 유지됩니다. 분석하기 전에 두 가지 일, 어른 벌레는 분석을위한 충분한 L4 자손을 위하여 OP50의 신선한 잔디밭에 배치해야합니다.

그것은 EIW 분석 플레이트는 박테리아의 단일 유형의 성장을 촉진하는 것도 중요합니다. E. faecalis 균주를 BHI 판에서 성장했다. 스트렙토 마이신은 E.에 선택하는 판에 추가 그들이 분석 플레이트에 유지 보수 NGM 플레이트에서 전송 될 때 L4 벌레로 전송됩니다 대장균 OP50. OP50은 BHI 접시에 성장. , C.에 선택하지 않으면 엘레은 BHI의 접시에있는 동안 박테리아의 두 가지 유형 (대장균 E. faecalis)에 공급된다. E.의 변종 이 분석에 사용 faecalis는 스트렙토 마이신에 내성이다. 박테리아의 다른 유형이 분석, 다른 항생제, 그리고 아마도 다른 문화 매체에 사용 된 경우, 선택의 박테리아를 선택하는 데 사용 E.에해야한다 대장균 OP50.

정확하게이 분석을 위해 벌레를 상연 선택하면 여러 가지 이유로 중요합니다. 첫째, t 동안 계란 유지를 계산하는 것이 중요합니다 그는 계란 생산 시간 / 자기 비옥 C.에 누워 엘레 간스. 계란 생산 C. 처음 5 일 동안 만 발생 엘레 성인 (40시간 후 L4 주위 피킹) 빠르게 그 이후 ^{4,21 거절합니다.} 유정란을 생산하지하면서 어른 벌레 2 ~ 3 주 평균을 위해 살고, 많은 성인 웜은 적어도 일주일 동안 살고 있습니다. 따라서 EIW 분석이 알 수없는 시대의 unstaged 성인 벌레 수행되지 않았는지 확인하는 것이 중요합니다.

그것은 사용하는 것이 중요하다 두 번째 이유는 EIW 분석의 동물 벌레가 박테리아에 노출 된되는 개발 시간이, 독소 또는 약물이 엄격히 통제 될 수 있도록합니다 개최. C.의 문화 엘레은 일반적으로 계란, L1 또는 L4 단계에서 동기화됩니다. L4 단계 때문에 관심이 분석에 사용되었다 E.에 오래 노출 벌레가 임신하는 성인되기 전에 faecalis는 치사의 원인이됩니다.

계란 보존 계란 생산과 달걀 누워 사이의 균형을 반영한다. 혼자 EIW 분석은 자궁에 남아 계란의 수는 계란 생산 또는 달걀 누워의 변화로 인해 여부를 구분하지 않습니다. 이 균주 또는 독소로 치료 벌레가 대조군에 비해 적은 계란을 유지하는 경우 특히 관심사입니다. 특히이 경우, 후속 골똘히 크기 분석을 수행해야합니다. 브루드 크기 분석은 벌레의 생식 수명 ⁴ 위에 누워 계란의 수를 정량화 . 실험 및 제어 그룹 웜의 종족 크기가 동일한 경우, 다음 계란 보존의 차이는 계란을 낳는 행동의 차이에 기인 할 수 있습니다. 그것은 가능성이 있기 때문 E.처럼 약간 병원성 균주 faecalis가 계란 생산을 증가하는 역할을 할, 그것을 가정하는 것이 합리적이다 E.에 노출 된 후 달걀 유지의 증가 faecalis는 (그림 3 본) 감소 달걀 누워 행동의 결과입니다.

EIW 분석은 또한 박테리아가 계란 유지를 변경할 수있는 메커니즘을 결정하지 않습니다. 그것은 가능하다는 것을 C. 그것은 빈약 한 음식 소스이기 때문에 병원성 박테리아의 정착과 입 구멍을 막거나하여 수유에 영향을주기 때문에 엘레 계란을 유지 할 수 있습니다. 그것은 박테리아가 정착하고 외음부 개구부를 차단하거나 알을 낳는 시스템에서 세포의 기능에 영향을 미칠 수있는 가능성도 있습니다. 추가 분석은 WHI에 의해 메커니즘을 결정하기 위해 필요합니다채널 계란 보존이 변경됩니다.

이 EIW 분석을 쉽게 계란 보존에 대한 화합물의 많은 종류의 효과를 결정하기 위해 수정할 수 있습니다. 또한이 분석은이 병원체의 영향에 필요한 하나의 호스트 (C. elegans의) 또는 (E. faecalis) 병원체에 유전자를 확인하는 화면에 통합 할 수있을만큼 간단합니다. EIW 분석은 - 계란을 누워 규제 자체에 필요한 유전자 화면으로도 사용할 수 있습니다. C.는 엘레 달걀 누워 행동은 세로토닌과 아세틸 콜린 ^5-9과 같은 신경 전달 물질에 의해 조절하고, 여러 신경 및 근육 그룹 ^12의 조정 작업이 필요합니다. EIW의 분석이 있었고, 신경 전달 물질의 신호 및 / 또는 근육 활동에 중요한 유전자를 식별하는 데 사용되는 것을 계속했다. EIW의 분석은 양적보다는 질적, 중요한 C.의 분석을 제공 엘레 행동.

저자는 E를 공급 6 월의 미들 감사드립니다 faecalis 균주 및 지침 박테리아 문화. C. 엘레은 연구 기반 프로그램의 NIH 사무소 (P40 OD010440)에 의해 자금 지원 CGC에 의해 제공되었다.