Конфокальной микроскопии одиноких митохондриальных супероксид вспышек в интактных Сердце или

Конфокальной сканирующей микроскопии применяется для работы с изображениями одиночных митохондриальные события в перфузии сердца или скелетных мышц в живого животного. Мониторинг в реальном времени отдельных митохондриальных процессов, таких как супероксид вспышек и мембранных возможных колебаний позволяет оценку функции митохондрий в физиологически соответствующем контексте и при патологических возмущений.

Митохондрия является одним из важнейших внутриклеточных органелл отвечает за производство энергии и внутриклеточной сигнализации в эукариотических системах. Митохондриальная дисфункция часто сопровождает и способствует болезни человека. Большинство из подходов, которые были разработаны для оценки функции митохондрий и дисфункции основаны на в пробирке или бывших естественных условиях измерений. Результаты этих экспериментов имеют ограниченные возможности в определении функции митохондрий в естественных условиях. Здесь мы описываем новый подход, который использует конфокальной сканирующей микроскопии для визуализации здоровых тканей в живых Aminals, что позволяет оценить одной функции митохондрий в режиме реального времени образом в естественных условиях. Во-первых, мы создаем трансгенных мышей, экспрессирующих митохондриальную целевой показатель супероксид, циркулярно переставленную желтый флуоресцентный белок (т-cpYFP). Наркозом т-cpYFP мыши фиксируется на заказ адаптера стадии и покадровой изображения взяты ером открытые скелетные мышцы задних конечностей. Мышь впоследствии пожертвовал и сердце настроен на Лангендорфа перфузии с физиологическими решений при 37 ° С Перфузии сердца позиционируется в специальной камере на конфокальной столик микроскопа и нежный давление применяется для иммобилизации сердце и подавлять сердцебиение индуцированной артефакт движения. Супероксидного вспышки обнаруживаются в реальном времени 2D конфокальной микроскопии на частоте одного кадра в секунду. Решение перфузии можно модифицировать, чтобы содержать различные субстраты дыхания или других флуоресцентных индикаторов. Перфузии также может быть скорректирована, чтобы произвести модели заболеваний, таких как ишемии и реперфузии. Эта техника является уникальный подход для определения функции одной митохондрии в здоровых тканей и в естественных условиях.

Митохондрии играют центральную роль в клеточных биоэнергетики, бесплатный сигнализации радикал, окислительно-восстановительного гомеостаза, регулирование ионного и клеточных судеб определения ^1,2. Митохондрии дисфункция часто сопровождает и лежит в основе патогенеза заболеваний ^3-6. Особенно в системах мышц, таких как сердце и скелетных мышц, дыхание митохондрий обеспечивает большую часть АТФ, чтобы поддержать своевременное регулирование внутриклеточного кальция и надежный ^7,8 развития силы. Эти мышцы обладают большое количество митохондрий, которые часто занимают до 20-40% от общего объема клеток и "фиксированных" между миофиламентов ^2.

Несмотря на многочисленные исследования, наше понимание регуляции митохондриальной функции, в частности, в естественных условиях и под физиологически соответствующих условиях, ограничен. Одной из причин является то, что большинство методов, разработанных для оценки функции митохондрий положиться в ВИТРо или Экс Vivo подходы, такие как мониторинг потребления кислорода изолированными митохондриями с добавлением искусственных субстратах, а также косвенное определение митохондриальной функции через морфологии (например, электронной микроскопии), активность фермента (например аконитаза деятельность), или внутриклеточные АТФ уровни ^9-11 .

В последнее время низкомолекулярные люминесцентные индикаторы с относительной митохондриальной обогащения были применены, чтобы обеспечить представление о митохондриальных сигналов, в том числе мембранного потенциала, кальция и активных форм кислорода (АФК), в неповрежденных клеток ^11-13. Кроме того, некоторые зеленый флуоресцентный белок (GFP) на основе окислительно-восстановительного потенциала и показатели ROS были разработаны для достижения более конкретную оценку на секции внутриклеточного редокс или ROS сигналов ^14-16. Среди этого, мы разработали генетически закодированного индикатор супероксид, круговой переставляются желтый флуоресцентный белок, и targeteг он в митохондрии (мт-cpYFP) ^17. м-cpYFP могут возбуждаться при 405 или 488 нм с обоих пиков выбросов на 515 нм. Излучение при возбуждении 488 нм именно реагировать на супероксид, на основании предыдущих в пробирке и в естественных калибровок ^17,18. Излучение при возбуждении 405 нм используется в качестве внутреннего контроля (см. Рисунок 1 из Реф 17 для подробной информации о выбросах и возбуждения спектров MT-cpYFP в различных условиях). С конфокальной микроскопии покадровой, этот показатель обнаруживает разрыва производственных события супероксид, названные супероксид мигает, в отдельных митохондриях интактных клеток. Супероксид флэш служит сложной функции митохондрий дыхания, сопровождающего переходного митохондриальной деполяризации мембраны и продукции АФК ^17-20. В последнее время мы сгенерировали пан-ткани т-cpYFP трансгенных мышей, используя вектор PUC-CAGGS-т-cpYFP ^17,19 на C57/BL6 фоне и проверены сильные выраобсуждение этого показателя в сердце, скелетных мышцах и других тканях (рис. 2). Трансгенных мышей будут доступны для заинтересованных академических исследователей по запросу и утверждения MTA по Университете Вашингтона.

В этом исследовании мы описываем на месте изображений супероксидных вспышек в Лангендорфа перфузии сердца, а также в естественных изображений флэш событий в скелетных мышцах наркозом т-cpYFP трансгенных мышей ^17,19. Эта технология позволяет осуществлять мониторинг в режиме реального времени отдельных митохондриальных производственных РОС событий в физиологически соответствующего условия или в естественных условиях ^21,22. Возможно также использовать систему для мониторинга других одиночных митохондриальные такие параметры, как мембранного потенциала и кальция с соответствующими люминесцентных индикаторов. Кроме того, одновременно или параллельно оценка функции митохондрий с внутриклеточных событий (например, переходных кальция) или функции сердца (например,. Фракция выброса) может быть достигнута. Патологические возмущения, такие как ишемии и реперфузии, могут быть применены к перфузии сердца, чтобы оценить воздействие стресса на одной митохондриальной функции в интактном миокарде.

1. Эксперимент Подготовка

1. Подготовьте изотонический сбалансированный солевой раствор (50 мл), содержащий: 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2,5 мМ CaCl _2, 2 мМ MgCl ₂ и 10 мМ HEPES (рН 7,2) для скелетных мышц визуализации в естественных условиях.
2. Подготовить 1 л Кребса-Хенселейта буфера (КАХАБ), содержащий: 118 мм NaCl, 5,3 мМ KCl, 1,2 мм MgSO _4, 0,5 мМ ЭДТА и 25 мМ NaHCO _3.
3. Пузырь KHB с газом, содержащим 95% O _2/5% CO ₂ в течение 10-15 мин перед добавлением 2 мМ CaCl _2. Добавить метаболические субстраты (например, 10 мМ глюкозы и 0,5 мМ пирувата).
4. Подготовьте хирургических инструментов путем стерилизации зажимные, ножницы, и щипцы в 70% этаноле, а затем полоскать в стерилизованной DDH ₂ O.
5. Включите систему перфузии сердца, регулировать температуру на водяной бане и циркуляционным насосом, установить скорость перистальтического насоса до 6 мл / мин.
6. Пузырь KHB с 95% O ₂/ 5% СО ₂ газ, и контролировать расход и температуру (37 ° С, по температурным датчиком волоконно-оптической) из сточных вод. Система должна около 20 минут для газа и уравновешивания температуры.

2. Конфокальной микроскопии скелетных мышц в естественных условиях

1. Обезболить мышь с фенобарбиталом (80 мг / кг, внутрибрюшинно). Животное достигнет хирургической анестезии (не реагирует на носок щепотку) в течение 10-15 мин и остаются в этом состоянии в течение 1-1,5 ч, достаточного для того, в естественных изображений скелетных мышц.
2. Удаление волос на одной из задних конечностей и стерилизации кожи с 70% этанола.
3. Сделать надрез на коже вдоль внешней стороне конечности подвергать икроножных мышц.
4. Поднимите epimysium осторожно острым пинцетом и сделать надрез через него с ножницами. Далее рассекают удалить epimysium и разоблачить мышечные волокна под ней.
5. Для погрузки в естественных условиях TMRM в скелетныхмышц, включают TMRM (500 нм) в изотоническом сбалансированном солевом растворе погрузить мышцы в течение 30 мин, а затем промыть индикатором свободного раствора.
6. Поместите курсор на боку на конфокальной микроскопии (Zeiss LSM 510) ступени и сдерживать заднюю конечность в положении, которое подвергается скелетных мышц обращена против покровного стекла, которое образует дно камеры. Покровное находится между мышечной ткани и перевернутом цели (40X масло).
7. Нажмите ногу мягко, чтобы сделать плотный контакт между тканью и покровного стекла. Погрузитесь открытые мышцы в изотоническом сбалансированного солевого раствора.
8. Запись двумерные (2D, ху) конфокальные изображения при частоте дискретизации в одну секунду на кадр. Интенсивность каждого пикселя в цифровую на глубине 8-битовой. Как правило, последовательный сканирования содержит 100 кадров.
9. Сбор последовательных изображений от первого возбуждающего при 405 нм и сбора на> 505 нм, то при 488 нм, собирая на> 505 нм для двойного возбуждениями длин волнн визуализации MT-cpYFP. Используйте последовательный возбуждение в 405, 488 и 543 нм, и собирать излучение на 505-545, 505-545, и> 560 нм, соответственно, для тройной длин волн изображений возбуждения MT-cpYFP и TMRM.

3. Конфокальной микроскопии из перфузии мыши Сердце

1. Сразу же после в естественных изображений скелетных мышц, вводят мыши с 200 единиц гепарина (IP). Десять минут спустя, усыпить мышь, торакотомии и быстро удалить сердце легких и тимуса, прикрепленных к нему.
2. Быстро снять легкое в ледяной буфера. Определить доли тимуса и аккуратно отогните, чтобы разоблачить восходящей аорты.
3. Снимите тимус и изолировать аорту, тщательно удаляя окружающие ткани.
4. Сделайте надрез на верхнем конце восходящей аорты до первого филиала дуги аорты.
5. Держите стенку аорты осторожно с двумя микро сшивания щипцов, чтобы разоблачить просвет и осторожно поместите аорты на окnnula (РЕ50 трубка). Аорта удерживается на месте с микро зажима судна в то время как швы быстро связали вокруг аорты.
6. Снимите зажим, тщательно проверить канюли щипцами, чтобы убедиться, конец канюли выше корня аорты. Дополнительные связи добавляются по мере необходимости, чтобы держать сердце на месте.
7. Включите перистальтического насоса и заливать сердце со скоростью 1 мл / мин. Сердце возобновит бить по перфузии.
8. Отрегулируйте положение системы перфузии и положил сердце на столик микроскопа. Сцена имеет адаптер, который позволяет нагрев камеры, которая держит сердце.
9. Добавить 1 мл КАХАБ перфузии раствора в камере, чтобы частично погрузить сердце. Монитор температуры камеры при 37 ° С Удалить эффлюента из камеры с помощью перистальтического насоса.
10. Увеличение скорости перистальтического насоса постепенно, чтобы обеспечить достаточный поток (около 2 мл / мин) к сердцу.
11. Через 10 мин стабилизации, заливать УВОRT с 10 мкМ blebbistatin и 100-500 нМ TMRM. Сердцебиение замедляется после 10 мин.
12. Нежный давление на сердце, чтобы обеспечить плотный контакт сердца с покровным в нижней части камеры и дальнейшего подавления сердцебиение.
13. Выполните ту же процедуру для конфокальной микроскопии интактного миокарда как описано в стадии 2,8 выше. Тщательно отрегулируйте фокальной плоскости выявить возможно более ясное изображение.

4. Обработка изображений и анализ данных

1. Используйте инструменты, предоставляемые с помощью модуля "физиологический анализ" конфокальной программного обеспечения для анализа одиночных митохондриальные Вспышки и изменений мембранного потенциала. Этот модуль часто включается в изображении приобретения программного обеспечения конфокальной системы и позволяет определить некоторые области изображения, а также выход интенсивности флуоресценции с временных меток.
2. Откройте базу данных, а затем серийный 2D файл изображения, которые необходимо проанализировать.
3. Нажмите кнопку "РегионИнтересное (ROI) означает "для переключения в" среднем трансформирования "режиме. Нажмите кнопку" области интереса (ROI) в виду "для переключения в" среднем трансформирования режиме ".
4. Выключите отображение других каналов, кроме канала cpYFP 488 нм для выбора вспышки.
5. Увеличение изображения и вручную переместить ползунок играть серийные 2D-изображений.
6. Определить одиночные митохондриальные супероксид вспышки за счет размещения на сайте, где используются люминесцентные сигнал увеличивается кратковременно. Используйте соответствующий инструмент ROI, чтобы отметить мигает. След показывая, зависящих от времени изменение флуоресценции каждого ROI будет отображаться рядом с изображением.
7. После выбора всех мигает, включить отображение других каналов. Выберите ROI на изображение вне клетки для вычитания сигнала фона. Выход среднюю флуоресценцию каждого ROI вместе с временными метками.
8. Запишите количество вспышек в каждой из файла образа серийный сканирования вместе со временем сканирования и областиклетка. Использование Excel для расчета частоты вспышки как количество вспышек в 100 сек / 1000 мкм ² ячеек.
9. Использовать пользовательский развитая программа, написанная на Interactive Data Language (IDL, ResearchSystems), чтобы рассчитать параметры каждой вспышки (амплитуды, время пиковой и времени затухания). Программное обеспечение IDL является коммерчески доступным и специально разработаны программа для анализа параметров флэш могут быть получены у автора по запросу.

В соответствии с этим протоколом, в естественных изображений отдельных митохондриальных событий может быть сделано в скелетных мышцах анестезированных мышей после чего на месте изображений в перфузии сердца (рис. 1). Оптимальная настройка условий обработки изображений обеспечит четкие изображения здоровых тканей мышц и с одной резолюции митохондрий (рис. 2). TMRM часто используется для проверки расположение MT-cpYFP и должны показать полную перекрытия модель с сигналом т-cpYFP (рис. 2). TMRM является коммерчески доступным индикатор для митохондриального мембранного потенциала измерений в интактных клетках ^23. Его спектры отличаются от, что из cpYFP. Кроме того, с помощью метода последовательного возбуждения, сигналы выбросов TMRM и MT-cpYFP не мешать друг другу ^17. Представитель изображения, показанные на рисунке 3, показывают, что один митохондриальная супероксид флэш АККОmpanied по деполяризации мембраны могут быть определены в последовательных изображений 2D сканирования, с переходным увеличением флуоресценции в течение фоновых сигналов в обоих скелетных мышечных тканей миокарда и (рис. 3). Кроме высокого разрешения, адекватной интенсивность флуоресценции также требуется. Это может быть достигнуто путем модуляции интенсивности лазерного излучения, а коэффициент усиления в сборном каналов. В общем, базально-сигнал флуоресценции от ячейки установлен на одной трети до одной четверти от максимальной интенсивности канала. Поскольку уровень экспрессии МТ-cpYFP и погрузке TMRM может варьироваться среди животных, тонкой настройки из условий обработки изображений должно быть сделано для каждого эксперимента. Оба физиологических и патологических возмущения, такие как метаболических субстратов ^17,19, электростимуляция (рис. 4), ²⁰ ишемической реперфузии ^17, были использованы, чтобы показать, что супероксид флэш активность реагирует на изменения в клеточном метаболического статуса.

Рисунок 1. Схематическое изображение конфокальной микроскопии скелетных мышц и Лангендорфа перфузии сердца. Трансгенной мыши выражая MT-cpYFP под наркозом и скелетные мышцы на одной из задних конечностей подвергаются для конфокальной микроскопии. Сердце затем вливают в режиме Лангендорфа и конфокальной изображение ведется. Обработка изображений и анализ данных использовали конфокальной программное обеспечение и пользовательский развитая программу.

Рисунок 2. Конфокальной визуализации скелетных мышечных волокон в естественных условиях и миокарда в перфузии сердца. А. Характерные изображения, показывающие скелетные мышцы нетрансгенных (NTG) и т-cpYFP трансгенных (мт-cpYFP) мышь загружен митохондриального мембранного потенциала индикатора, TMRM. Б. Представитель изображения, показывающие МиоCardium из NTG и т-cpYFP мышей в Лангендорфа перфузии сердце. Пример: Длина волны возбуждения. м-cpYFP возбуждается при 405 и 488 нм с выбросами, собранных на 505-530 нм (синий) и 505-530 нм (зеленый), соответственно. TMRM возбуждается на 543 нм с испусканием собранной в> 560 нм (красный). Масштабные бары = 50 мкм.

Рисунок 3. Холост митохондриальные супероксид мигает обнаружен в скелетных мышцах в естественных условиях и в перфузии сердца. А. Представитель изображения (верхняя панель) и следы зависящим от времени изменения флуоресценции (мт-cpYFP на 405 и 488 нм возбуждения и TMRM при возбуждении 543 нм, нижней панели), показывая один митохондриальную супероксид вспышку (выделено оранжевыми стрелками в увеличенном часть изображений) в скелетных мышечных волокон. Обратите внимание на повышенный сигнал т-cpYFP (при возбуждении 488 нм) сопровождается снижением сигнал TMRM. B. Репрезентативная ИМАГэс (верхняя панель) и следы зависящим от времени изменения флуоресценции (нижняя панель) во время одного митохондриального вспышкой супероксид в перфузии миокарда. Масштабные бары = 50 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 4. Увеличение супероксид частоту вспышки в перфузии сердца электрической стимуляцией. Сердце электрической стимуляции (Шагая, 4 V и 2 Гц) в течение 2 мин. Данные представляют собой среднее ± SEM, N = 8 клеток. *:. Р <0,05 в сравнении с Отдыхая Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Визуализация одиночных митохондриальные события в живого животного или перфузированных органов имеет существенное преимущество по сравнению с традиционными методами митохондриальной ^{17,19,21,22,24,25} оценки функции. Техника, описанная здесь можно добиться реального времени в определении месте митохондриальной функции в реальной физиологического состояния на субклеточном резолюции. Это особенно полезно в сочетании с другими измерениями, чтобы системно изучить роль митохондрий в нормальной функции того или иного органа или типа клеток в естественных условиях. Это сложная техника, которая сочетает в себе конфокальной микроскопии и сложную систему перфузии с контролем различных параметров. Тем не менее, этот метод был использован для связи весь метаболизм глюкозы тела с мышечной функции митохондрий ^17,19,20 и в настоящее время работают на нас, чтобы изучить митохондриальной дисфункции при болезни сердца.

Сердце perfusio Langendorffн система совместима с оценкой функции сердца через мониторинг левую давление желудочка и отображения внутриклеточного Са ^{2 +} переходных во время каждого такта. С другой стороны, другие флуоресцентные показатели, такие как MitoSOX или DCF можно перфузии для облегчения на месте визуализации уровнях стационарных АФК в миокарде. Langendorff перфузии сердце было широко используется для оценки реакции сердца к физиологической (например β-адренергической стимуляции добутамина) или патологического (например ишемии реперфузии) возмущений ^26-28. Такие обработки могут быть включены в конфокальной системы визуализации для оценки одного митохондриальную функцию в ответ на напряжений.

Ограничения этого метода включают выбор тканей / органов, которые возможно для получения изображений живых животных. Поверхностные ткани, такие как скелетных мышц, подкожной структур и поверхностных нервов идеально подходят для конфокальной микроскопии в живом Анимал. Внутренние органы технически не подходит для получения изображений живых животных в связи с большой ущерб мыши разоблачая орган. Тем не менее, внутренние органы могут быть установлены для перфузии органов / культуры, такие как Лангендорфу перфузии сердца или головного мозга срез культуры, если физиологический миметическая среда может быть сохранен. Кроме того, конфокальной микроскопии имеет эффективную глубины визуализации 30-50 мкм, что позволяет визуализации нескольких слоев клеток под поверхностью органа. Вполне возможно, что эта система может быть объединена с многофотонной микроскопа, который имеет значительно более высокую глубину проникновения (например, до 1 мм) и был использован для оценки функции митохондрий в интактном сердце ^29. Движение артефакт является еще одним важным вопросом, который следует учитывать. Митохондрии в скелетных мышцах и кардиомиоцитов показал минимальное движение во время сканирования. Кроме того, сердцебиение, вызванной артефакт движения может быть подавлена ​​или ликвидирована путем перфузии с blebbistatin ай применение легким нажимом на сердце. В других типах клеток, таких как нейроны и фибробласты, митохондрии могут претерпевать постоянные и значительные движения. В процессе обработки и анализа изображений, любые изменения сигнала из-за артефактов движения должны быть тщательно определены и исключены.

Дополнительные проблемы этого метода включают поддержание соответствующее условие в течение всего эксперимента, положительные контроли и интерпретацию данных. Для скелетных мышц изображений в наркозом мышей, открытая поверхность мышцы должны быть погружены в физиологических буферов в любое время. Vital признаки мыши, такие как дыхание должны контролироваться в течение всего эксперимента. Для перфузированных исследований сердца, целесообразно оксигенации, контроль температуры и питания субстрат не требуется. Положительные контроли рекомендуется проверить состояние и отзывчивость тканях. Для этого мышей может быть введен с инсулином или глюкозы и сердца, перфузированного могут быть электрически стимулировалlated или озарен изопротеренолом. Увеличение супероксид мигает следует соблюдать после этих методов лечения (рис. 4) ^19,20. Кроме того, покадровой изображения взяты, когда артефакт движения подавляется через ингибирующих сердцебиение, которая производит суб-физиологические условия за счет уменьшения рабочей нагрузки. Таким образом, перфузии сердца эксперимент следует рассматривать как близкий миметического ситуации в естественных условиях.

Наконец, метод был разработан с использованием Zeiss конфокальной (LSM 510). Другие системы конфокальной (например Nikon, Olympus или Leica) могут быть использованы, если система отвечает следующим требованиям: (1) имеет режим кадра сканирования покадровой, (2) имеет частоту дискретизации 1 сек / кадр, и (3) может достигать одной резолюции митохондрии (например, 1 мкм х 2 мкм). Программное обеспечение конфокальной системы обычно позволяет обрабатывать простые изображения и анализ, например, определяя выход Rois и интенсивность флуоресценции с тIME этикетки. Кроме того, изображения J программное обеспечение может использоваться как для анализа изображений и расчета параметров вспышки.

Таким образом, отображение отдельных митохондриальных событий, таких как супероксид вспышек в скелетных мышцах в естественных условиях или в перфузии сердца является уникальным подходом для определения в реальном времени митохондриальной функции. Этот метод является значительным усовершенствованием по сравнению измерений традиционных в пробирке и обеспечит более точную оценку функции митохондрий и его связь с сотовой процессов / функций в реальных физиологических условиях.

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра. Хэпин Ченг, Huiliang Чжан и Стивен Kolwicz за их полезные комментарии и техническую поддержку в разработке этого метода. Работа выполнена при поддержке грантов НИЗ и ученый развития Грант от Американской ассоциации сердца к WW.