シングルミトコンドリアスーパーオキシド無傷ハートや点滅の共焦点イメージング

共焦点走査顕微鏡は、生きた動物における灌流心臓または骨格筋​​におけるミトコンドリアの単一のイベントを画像化するために適用される。スーパーオキシドが点滅し、膜電位の変動などの単一ミトコンドリアのプロセスのリアルタイム監視は、生理学的に関連するコンテキストでかつ病理学的摂動の間、ミトコンドリア機能の評価が可能。

ミトコンドリアは、真核生物系でのエネルギー生産と細胞内シグナル伝達を担う重要な細胞内小器官である。ミトコンドリア機能障害は、多くの場合、付属の、人間の病気に貢献しています。ミトコンドリア機能および機能不全を評価するために開発されてきたアプローチの大部分は、in vitroまたはex vivoで測定に基づいている。これらの実験からの結果は、in vivoでのミトコンドリア機能を決定する上での能力が限られている。ここでは、 インビボでリアルタイムに単一ミトコンドリア機能の評価を可能にするライブアミナール中の無傷の組織のイメージング、共焦点走査顕微鏡法を用いた、新たなアプローチを記載する。まず、ミトコンドリアの対象とスーパーオキシドインジケータ、円順列黄色蛍光タンパク質（MT-cpYFP）を発現するトランスジェニックマウスを作製。麻酔をかけたMT-cpYFPマウスがカスタムメイドステージアダプタに固定され、タイムラプス画像は、Fをとっている後肢の露出骨格筋ROMをマウスはその後、犠牲にされ、心臓は37℃で、生理的なソリューションをランゲンドルフ灌流用に設定されている灌流心臓を共焦点顕微鏡ステージ上に特殊なチャンバ内に配置され、穏やかな圧力は、心臓を固定し、心拍誘導運動アーチファクトを抑制するために適用される。スーパーオキシド点滅毎秒1フレームの周波数でのリアルタイム二次元共焦点イメージングにより検出される。灌流溶液は、異なる呼吸基質または他の蛍光指示薬を含有するように修飾することができる。灌流はまた、虚血および再灌流などの疾患モデルを生成するように調整することができる。この技術は、無傷の組織およびインビボでの単一ミトコンドリアの機能を決定するためのユニークなアプローチである。

ミトコンドリアは、細胞の生体エネルギー、フリーラジカルシグナル伝達、酸化還元ホメオスタシス、イオン調節、および細胞運命決定^の1,2において中心的な役割を果たす。ミトコンドリア機能障害は、多くの場合、付属のと病気^3-6の病因の基礎となる。特に、心臓や骨格筋などの筋肉のシステムでは、ミトコンドリアの呼吸は、細胞内カルシウム、堅牢な力開発^7,8のタイムリーな調整を支援するために、ATPの大部分を提供します。これらの筋肉は、多くの場合、全細胞容積20〜40％まで占め、筋フィラメント²間に「固定」されたミトコンドリアの多数を持っている。

多くの研究にもかかわらず、ミトコンドリア機能調節の我々の理解は、特に生体内および生理学的に関連する条件下では、限られている。理由の一つは、ミトコンドリア機能を評価するために開発された方法の大部分はvitrに頼るあるこのような人工基質を補充した単離ミトコンドリアの酸素消費量、および間接形態学を通じてミトコンドリア機能の決定（ 例えば電子顕微鏡）、酵素活性（ 例えばアコニターゼ活性）、または細胞内ATPレベル^9から11の監視などoまたはex vivoでのアプローチ、 。

最近では、相対的なミトコンドリア富化を有する小分子蛍光指示薬は、無傷の細胞における膜電位、カルシウムおよび活性酸素種^{（ROS）、11-13}を含むミトコンドリアシグナルの姿を提供するために適用されている。さらに、いくつかの緑色蛍光タンパク質（GFP）をレドックス系、ROS指標区画化、細胞内の酸化還元またはROS ^14-16信号のより具体的な評価を達成するために開発されてきた。この中でも、我々は、遺伝的にコード化されたスーパーオキシドインジケーター、円形の順列黄色蛍光タンパク質、およびtargeteを開発Dそれミトコンドリア^{（MT-cpYFP）17}に変換する。 MT-cpYFPは、515 nmでの発光ピークの両方で405又は488nmで励起することができる。 488nm励起での発光は、 インビトロおよびインビボ較正 ^17,18 内の前で示すように、スーパーオキシドに特異的に応答する。 405 nm励起の発光は、（様々な条件の下で、MT-cpYFPの発光および励起スペクトルの詳細については文献[17の図1をご参照ください）​​内部コントロールとして使用されます。タイムラプス共焦点イメージングでは、この指標は、無傷の細胞の単一ミトコンドリア内スーパーオキシド産生のイベント、というスーパーが点滅し、破裂を検出。スーパーフラッシュは、ミトコンドリア呼吸、添付過渡ミトコンドリア膜脱分極およびROS産^17〜20の合成関数として機能します。最近では、C57/BL6の背景をpUC-CAGGS-MT-cpYFPベクトル^17,19を使用したパン-組織MT-cpYFPトランスジェニックマウスを作製し、強力なEXPRESを確認しました心臓、骨格筋および他の組織（ 図2）で、この指標のシオン。トランスジェニックマウスは、要求とワシントン大学のMTAの承認を得て興味を持って、学術研究者のために利用できるようになります。

本研究では、 その場でのランゲンドルフ灌流し、心臓内のスーパーオキシドが点滅の撮影だけでなく、麻酔MT-cpYFPトランスジェニックマウス^17,19の骨格筋におけるFlashイベントのin vivoイメージングに説明します。この技術は、生理学的に関連する状態またはin vivo ^21,22の単一ミトコンドリアのROS産生のイベントのリアルタイム監視が可能になります。このような適切な蛍光指示薬を有する膜電位およびカルシウムなどの他の単一ミトコンドリアのパラメータを監視するシステムを使用することも可能である。細胞内のイベント（ 例えば 、カルシウムトランジェント）や心臓の機能（ 例えばとミトコンドリア機能の更なる、同時またはパラレル評価。駆出率）を達成することができる。例えば、虚血および再灌流のような病理学的摂動は、無傷心筋の単一ミトコンドリア機能に対するストレスの影響を評価するために灌流心臓に適用することができる。

1。実験の準備

1. 140mMのNaCl、5mMのKCl、2.5mMのCaCl _2、2mMのMgCl ₂および10mM HEPES インビボでの骨格筋イメージング用液（pH 7.2）を含有する等張平衡塩類溶液（50ml）に調製する。
2. 118のNaCl、5.3のKCl、1.2のMgSO _4、0.5mMのEDTAおよび25mMの_炭酸水素ナトリウム_を ：含むクレブス-ヘンゼライト緩衝液（KHB）を1リットル調製。
3. 従来2mMのCaCl _2を添加する10〜15分間、95％O _{2/5％CO 2を}含むガスと気泡KHB。代謝基質（ 例えば 、10 mMグルコースおよび0.5mMのピルビン酸）を追加します。
4. 70％エタノールでクランプ、はさみ、鉗子を滅菌した後、滅菌蒸留H ₂ Oにすすぐことにより手術器具を準備します
5. 、心臓の灌流システムの電源を入れ、水浴、サーキュレータの温度を調整し、6ミリリットル/分に蠕動ポンプの速度を設定します。
6. 95％O ₂と気泡KHB流出物/ 5％CO ₂ガス、および（光ファイバ温度プローブによって37℃）、流速および温度を監視する。システムは、ガスと温度平衡化のために約20分を必要とします。

2。 in vivoでの骨格筋の共焦点イメージング

1. ペントバルビタール（80 mg / kgで、腹腔内）でマウスを麻酔。動物は、10〜15分以内に、手術の麻酔（つま先のピンチに応答なし）に到達し、骨格筋のin vivoイメージングのために十分な1〜1.5時間、この状態のままになります。
2. 後肢の1に毛を削除し、70％エタノールで皮膚を消毒する。
3. 腓腹筋を露出させ、肢の外側に沿って皮膚に切開する。
4. 鋭いピンセットで軽く筋外膜をピックアップし、ハサミでそれを介して切開する。さらに筋外膜を取り外し、その下の筋線維を露出するために解剖。
5. 骨格へのTMRM のin vivoロード用筋肉は、30分間の筋肉を浸した後、指示薬を含まない溶液で洗い流すこと等張平衡塩類溶液中のTMRM（500 nM）を含める。
6. 共焦点顕微鏡（Zeiss LSM 510）ステージ上で横にマウスを置くと、公開される骨格筋は、チャンバーの底部を形成するカバーガラスに対向する位置に、リア手足を拘束。カバースリップは、筋肉組織および反転対物レンズ（40X油）との間にある。
7. 組織とカバーガラスの間に密着させるようにそっと足を押してください。等張平衡塩溶液中で公開される筋肉を浸す。
8. フレームあたり1秒のサンプリングレートで録音する2次元（2D、 メトキシ）共焦点画像。各画素の強度は、8ビットの深度でデジタル化される。通常、シリアルスキャンは100フレームが含まれています。
9. > 505 nmで最初の405 nmでのエキサイティングで収集することにより連続した画像を収集し、488 nmの二波長excitatio用> 505 nmで収集しながら、MT-cpYFPのNイメージング。 MT-cpYFPとTMRMの三波長励起イメージングのために、それぞれ、405、488および543 nmで連続励起を使用し、505から545の発光を収集し、505から545、および> 560 nmの。

3。灌流マウス心臓の共焦点イメージング

1. すぐに骨格筋のin vivoイメージングの後、ヘパリン200単位（IP）でマウスを注入します。 10分後、開胸術により、マウスを安楽死させるとすぐにそれに接続されている肺や胸腺で心を取り除く。
2. すぐに氷冷緩衝液で肺を削除します。胸腺の葉を識別し、ゆっくりと上行大動脈を露出するために戻ってはがします。
3. 胸腺を取り外し、慎重に周囲の組織を除去することにより、大動脈を隔離。
4. 大動脈弓の最初の分岐の前に、上行大動脈の上端の切断を行う。
5. ルーメンを露出するために2マイクロ縫合鉗子で穏やかに大動脈の壁を持って、慎重にCAに大動脈を配置nnula（PE50チューブ）。縫合糸が迅速に大動脈の周りに縛られている間は、マイクロ大動脈血管クランプで所定位置に保持される。
6. カニューレの先端が大動脈基部より上であることを確認するために鉗子でカニューレをチェックし、慎重に、クランプを取り外します。追加の関係を所定の位置に心臓を保持するために必要に応じて添加される。
7. 蠕動ポンプの電源を入れ、1ミリリットル/分で心臓を灌流。心臓は、灌流の際に暴行を再開します。
8. 灌流システムの位置を調整し、顕微鏡ステージ上で心を置く。ステージは、心を保持しているチャンバーの加熱を可能にするアダプタを持っています。
9. 部分的に心を沈めるためにチャンバー内KHB灌流溶液1mlを加える。 37℃のチャンバーの温度を監視する蠕動ポンプを使用することにより、チャンバからの流出物を除去します。
10. 心臓への十分な流量（約2ミリリットル/分）を提供するために、徐々に蠕動ポンプの速度を増加させる。
11. 安定化の10分後、ょんを潅流10μMのブレビスタチンおよび100〜500nmのTMRMとRT。ハートビートは10分後に遅くなります。
12. チャンバーの下部にあるカバーガラスで心​​の緊密な接触を確実にするために、さらにハートビートを抑制するために心に静かに押し込みます。
13. 上記のステップ2.8で説明したように完全な心筋の共焦点イメージングのためのと同じ手順に従ってください。慎重に可能な鮮明な画像を明らかにするために、焦点面を調整します。

4。画像処理およびデータ分析

1. シングルミトコンドリアが点滅し、膜電位変化を分析するために、共焦点ソフトウェアの「生理的分析」モジュールによって提供されるツールを使用してください。このモジュールは、多くの場合、共焦点システムの画像取得ソフトウェアに含まれる画像の中の特定の領域の決定だけでなく、時間ラベルとの蛍光強度の出力を可能にする。
2. データベースと分析しようとする、シリアル2D画像ファイルを開きます。
3. 「地域をクリックしてください関心領域（ROI）は、平均ROIの "に切り替える」という意味の平均ROIの「モード」に切り替え、「関心領域（ROI）は、平均"モード。をクリックして "。
4. 点滅を選択するためのcpYFP 488nmのチャンネルを除く他のチャンネルの表示をオフにします。
5. ズーム画像と手動シリアル2D画像を再生するために、スライドバーを移動します。
6. 蛍光シグナルが一過性に増加し、サイトを配置することにより、単一のミトコンドリアのスーパーオキシドが点滅を識別します。点滅をマークするために、適切なROIツールを使用します。各ROIの時間依存蛍光変化を示すトレースは、画像の横に表示されます。
7. すべての点滅を選択した後、他のチャンネルの表示をオン。バックグラウンド信号の減算の​​ための細胞の外側で画像にROIを選択します。一緒に時間ラベルで出力各ROIの平均蛍光を。
8. のスキャン時間と面積と一緒にシリアルスキャンされた画像ファイルのそれぞれに点滅回数を記録しますセル。 Excelを使用して100秒/ ^1,000μm2のセル面積あたりの点滅回数などのフラッシュ頻度を計算する。
9. 各フラッシュ（振幅、ピークまでの時間と減衰時間）のパラメータを計算するために対話型のデータ言語（IDL、ResearchSystems）で記述されたカスタム開発されたプログラムを使用してください。 IDLのソフトウェアは市販されており、フラッシュパラメータ解析用のカスタム開発されたプログラムは、要求に応じて作成者から得ることができます。

このプロトコルによると、単一のミトコンドリアのイベントのin vivoイメージングは、麻酔したマウスの骨格筋で行うことができますが灌流し、心臓内のその場での画像（ 図1） に続く。撮影条件の最適な設定は、そのまま筋肉組織の鮮明な画像を確保し、単一ミトコンドリアの解像度（ 図2）となります。 TMRMは、多くの場合、MT-cpYFPの場所を確認するために使用され、MT-cpYFP信号との完全な重複パターン（ 図2）が表示されるはずです。 TMRMは無傷の細胞²³内のミトコンドリア膜電位測定用の市販の指標である。そのスペクトルはcpYFPのものとは区別される。また、連続励起法を用いて、TMRMとのmt-cpYFPの発光信号は、互いに¹⁷に干渉しない。 図3に示す代表的な画像を示していることを、単一のミトコンドリアのスーパーオキシドのフラッシュアコ膜脱分極によってmpaniedは、両方の骨格筋組織におけるバックグラウンドシグナル上の一過性蛍光増加と心筋（ 図3）と、シリアルの2次元走査画像において同定することができる。高解像度に加えて、十分な蛍光強度も必要です。これは、レーザ強度​​及び収集チャネルのゲインを調節することによって達成することができる。一般に、細胞からの基底蛍光信号は、チャネルの最大強度の3分の1〜4分の1に設定される。 MT-cpYFPとTMRMのロードの発現レベルは、動物によって異なる場合がありますので、撮影条件の微調整は、各実験のために行われるべきである。このような代謝基質^17,19、電気刺激（ 図^4）20、虚血-再灌流^17、両方の生理学的および病理学的摂動は、そのスーパーフラッシュ活性は細胞の代謝状態の変化に応答を示すために使用されてきた。

図1。骨格筋およびランゲンドルフ灌流し、心臓の共焦点イメージングの概略図。MT-cpYFPを発現するトランスジェニックマウスを麻酔し、後肢の1に骨格筋は、共焦点イメージングのために公開されています。次いで、心臓をランゲンドルフ·モードで灌流し、共焦点画像が行われる。画像処理およびデータ分析は、共焦点ソフトウェアおよびカスタム開発されたプログラムを使用した。

図2。灌流し、心臓の生体内や心筋、 骨格筋線維の共焦点イメージング。 A.代表非トランスジェニック（NTG）の骨格筋を示す画像およびMT-cpYFPトランスジェニックミトコンドリア膜電位インジケーターを搭載（MT-cpYFP）マウス、ミオを示すTMRM。B.代表画像ランゲンドルフ灌流し、心臓内のNTGとMT-cpYFPマウスのCardiumの。例：励起波長。 MT-cpYFPは、それぞれ505〜波長（青）と505〜ナノメートル（緑）において収集排出物405および488nmで励起される。 TMRMは> 560 nmの（赤）で収集された放射と543 nmで励起される。スケールバー=50μmである。

図3。 生体内で灌流心に骨格筋で検出された単一のミトコンドリアのスーパーオキシドが点滅します。 A.代表的な画像（上図）と拡大した中で、オレンジ色の矢印で強調し、単一のミトコンドリアのスーパーオキシドのフラッシュを（表示時間依存（405 MT-cpYFPと543 nmの励起で488nmの励起とTMRM、下のパネル）蛍光変化の痕跡骨格筋線維における画像の部分）。 （488nm励起での）増加したMT-cpYFP信号が減少したTMRM信号が伴うことに注意してください。B.代表IMAGES（上パネル）および灌流、心筋の単一ミトコンドリアのスーパーオキシドのフラッシュ時の時間依存蛍光変化（下のパネル）の痕跡。スケールバー=50μmである。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。

図4。電気刺激により灌流心におけるスーパーオキシドのフラッシュ頻度を増加させた。心臓が電気的に2分間（ペーシング、4 Vと2 Hz）を刺激した。データは、平均±SEMである、N = 8セル。 *：P <休憩0.05対。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。

生きた動物または灌流さの臓器の単一ミトコンドリアのイベントを画像化することは、ミトコンドリア機能評価^{17,19,21,22,24,25}のための従来の方法に比べて大きな利点があります。ここに記載された技術は、細胞内の解像度で、実際の生理学的状態にあるミトコンドリア機能のその場での決定に 、リアルタイムを実現することができます。全身的にインビボで特定の器官または細胞型の正常な機能におけるミトコンドリアの役割を研究するために、他の測定と組み合わせた場合に、特に有用である。これは様々なパラメータの制御に焦点顕微鏡で洗練された灌流システムを組み合わせた複雑な手法である。それにもかかわらず、この技術は、筋ミトコンドリア機能^17,19,20に全身グルコース代謝をリンクするために使用されており、現在心臓疾患におけるミトコンドリア機能障害を研究するために我々が使用される。

ランゲンドルフ心perfusion個のシステムは、左心室の圧力を監視し、各拍動の間、細胞内Ca ^{2 +}トランジェントを撮像介して心機能の評価に対応している。あるいは、そのようなMitoSOXや、DCFなどの他の蛍光指示薬は、心筋における定常状態のROSレベルのその場での画像化に容易にするために灌流することができます。ランゲンドルフ灌流し心が広く、生理的（ドブタミンによる例えば 、β-アドレナリン刺激）または病理学（ 例えば 、虚血再灌流）摂動^26〜28に対する心臓の応答を評価するために使用されています。そのような治療は、ストレスに応答して単一のミトコンドリア機能を評価するために、共焦点画像化システムに組み込むことができる。

この方法の限界は、生きた動物のイメージングのための実現可能である組織/臓器の選択を含む。このような骨格筋、皮下構造や表面的な神経などの表面的な組織は、ライブANIに共焦点イメージングに最適ですMAL。臓器を露出させながら、内臓は、マウスへの広範な損傷による生きた動物のイメージングのための技術的に不適切である。生理的な模倣の環境を維持することができる場合は、内臓は、ランゲンドルフ灌流し、心臓や脳スライス培養として、臓器灌流/培養のために設定することができます。さらに、共焦点顕微鏡は、臓器表面の下の細胞の数層の撮像を可能にする30〜50ミクロンの有効撮像深さを有する。なお、このシステムは非常に高い侵入深さ（ 例えば、最大1mmまで）を有し、無傷の心臓²⁹内のミトコンドリア機能を評価するために使用されている多光子顕微鏡と組み合わせることができることが可能である。モーションアーチファクトを考慮しなければならないもう一つの重要な問題である。骨格筋と心筋細胞におけるミトコンドリアは、スキャン中に、最小限の動きを示した。さらに、ハートビートによって誘発されるモーションアーチファクトは、ブレビスタチンAとの灌流によって抑制または排除することができますND心臓に穏やかな圧力を適用する。このようなニューロンおよび線維芽細胞などの他の細胞型において、ミトコンドリアは一定で劇的な動きを受けることができる。撮像処理及び分析の間、モーションアーチファクトに起因する任意の信号変化を慎重に特定され、排除されるべきである。

この技術の新たな課題は、実験を通して、適切な条件、ポジティブコントロールとデータの解釈を維持することがあります。麻酔したマウスにおける骨格筋イメージングのために、公開される筋肉の表面には、すべての時点で生理的緩衝液中に浸漬されるべきである。このような呼吸のようなマウスのバイタルサインは、実験を通して監視する必要があります。灌流心臓研究のために、適切な酸素供給、温度制御および基質供給が必要とされる。ポジティブコントロールは、組織の状態と応答性を確認することをお勧めします。そのためには、マウスはインスリンまたはグルコースと灌流した心臓に注入することができることは、電気的にSTIMUすることができますlatedまたはイソプロテレノールで灌流。増加のスーパーオキシドが点滅し、これらの処理（ 図^4）19,20後に観察する必要があります。モーションアーチファクトが減少し、作業負荷のためにサブの生理学的条件を生成阻害ハートビートを通じて抑制されたときに加えて、タイムラプス画像が取得されます。このように、灌流し、心臓の実験は、 生体内の状況の近い模倣として考慮されるべきである。

最後に、技術はツァイス共焦点（LSM 510）を使用して開発されました。他の共焦点システム（ 例えば 、ニコン、オリンパス又はライカ）は、システムが次の要件を満たしている場合に使用することができる：（1）経時フレームスキャンモードを有し、（2）1秒/フレームのサンプリングレートを有し、（3）シングルミトコンドリアの分解能（ 例えば 1ミクロン×2μm）を到達することができます。共焦点システムのソフトウェアは、通常、例えばtでのROIと蛍光強度出力を規定するように、簡単な画像処理および分析を可能にするIMEのラベル。あるいは、イメージJソフトウェアは、画像解析及びフラッシュパラメータ算出の両方に使用することができる。

要約すると、このようなインビボまたは灌流し、心臓、骨格筋のスーパーオキシドが点滅し、単一のミトコンドリアのイベントの画像化は、ミトコンドリア機能のリアルタイム測定のためのユニークなアプローチである。この手法は、従来のin vitroでの測定値に対して重要な進歩であるとミトコンドリア機能と実際の生理的条件下で細胞プロセス/機能との関係をより正確に評価を提供します。

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

著者は、博士に感謝したいと思います。和平チェン、Huiliang張とスティーブンKolwiczこの方法を開発する上で有益なコメントや技術的なサポートのため。この研究は、NIHの助成金や米国心臓協会からWWに科学者開発助成金によって支えられている。