Imagen confocal de Soltero mitocondriales superóxido Parpadea en corazón intacto o

La microscopía confocal de barrido se aplica para obtener imágenes de los eventos mitocondriales individuales en el corazón perfundido o los músculos esqueléticos en animales vivos. Monitoreo en tiempo real de los procesos mitocondriales individuales, como accesos repentinos superóxido y potencial de membrana fluctuaciones permite la evaluación de la función mitocondrial en un contexto fisiológicamente relevante y durante perturbaciones patológicas.

Mitocondria es un orgánulo intracelular crítico responsable de la producción de energía y la señalización intracelular en sistemas eucarióticos. La disfunción mitocondrial a menudo acompaña y contribuye a la enfermedad humana. La mayoría de los enfoques que se han desarrollado para evaluar la función mitocondrial y la disfunción se basa en in vitro o in vivo mediciones ex. Los resultados de estos experimentos han capacidad en la determinación de la función mitocondrial in vivo limitado. Aquí se describe un nuevo método que utiliza la microscopía confocal de barrido para la obtención de imágenes de los tejidos intactos en aminales en vivo, lo que permite la evaluación de la función mitocondrial solo de una manera en tiempo real en vivo. Primero, generamos ratones transgénicos que expresan el indicador dismutasa mitocondrial específica, la proteína fluorescente amarilla permutado circularmente (mt-cpYFP). Mt-cpYFP anestesiado ratón se fija en un adaptador de fase a medida y las imágenes con lapso de tiempo se toman fesde los músculos esqueléticos expuestas de la extremidad posterior. El ratón se sacrificó y posteriormente el corazón está configurado para perfusión Langendorff con soluciones fisiológicas a 37 ° C. El corazón perfundido se coloca en una cámara especial en la platina del microscopio confocal y se aplica una presión suave para inmovilizar el corazón y suprimir los latidos del corazón inducida artefactos de movimiento. Parpadea superóxido se detectan en tiempo real de imagen confocal en 2D a una frecuencia de un fotograma por segundo. La solución de perfusión puede ser modificado para contener diferentes sustratos de respiración u otros indicadores fluorescentes. La perfusión también se puede ajustar para producir modelos de enfermedades como la isquemia y la reperfusión. Esta técnica es un enfoque único para la determinación de la función de único mitocondria en tejidos intactos e in vivo.

Las mitocondrias juegan un papel central en la bioenergética celular, la señalización de los radicales libres, la homeostasis redox, la regulación de iones, y la determinación del destino celular ^1,2. Las mitocondrias a menudo acompaña a la disfunción y la base de la patogénesis de las enfermedades ^3-6. Especialmente en los sistemas musculares tales como el corazón y los músculos esqueléticos, la respiración mitocondrial proporciona la mayoría de ATP para apoyar la regulación oportuna de calcio intracelular y robusto ^7,8 desarrollo de la fuerza. Estos músculos poseen un gran número de mitocondrias, que a menudo ocupan hasta un 20-40% del volumen total de células y son "fijos" entre miofilamentos ^2.

A pesar de numerosos estudios, nuestra comprensión de la regulación de la función mitocondrial, específicamente in vivo y bajo condiciones fisiológicamente pertinentes, es limitada. Una de las razones es que la mayoría de los métodos desarrollados para la evaluación de la función mitocondrial depende de en VITRO o ex enfoques in vivo, tales como el control de la consumo de oxígeno de mitocondrias aisladas suplementado con sustratos artificiales, y la determinación indirecta de la función mitocondrial a través de la morfología (microscopía de electrones por ejemplo), actividad enzimática (por ejemplo, actividad de la aconitasa), o los niveles de ATP intracelulares ^9-11 .

Recientemente, los pequeños indicadores fluorescentes de moléculas con un enriquecimiento relativo mitocondrial se han aplicado para proporcionar una visión de las señales mitocondriales, incluyendo el potencial de membrana, calcio y especies reactivas de oxígeno (ROS), en células intactas ^11-13. Por otra parte, varios proteína fluorescente verde (GFP) y redox basado en indicadores de ROS se han desarrollado para lograr una evaluación más específica de la redox intracelular de ROS compartimentada o señales de ^14-16. Entre esto, hemos desarrollado un indicador codificado genéticamente dismutasa, la proteína amarilla fluorescente circular permutada y targeted en las mitocondrias (mt-cpYFP) ^17. mt-cpYFP puede ser excitado a 405 o 488 nm con dos picos de emisión a 515 nm. La emisión a 488 nm de excitación es específicamente sensible a superóxido como se muestra por el anterior in vitro e in vivo calibraciones ^17,18. La emisión a 405 nm de excitación se utilizó como control interno (por favor refiérase a la Figura 1 de la Ref. 17 para obtener información detallada sobre la emisión y excitación espectros de mt-cpYFP en diversas condiciones). Con la imagen confocal de lapso de tiempo, este indicador detecta reventar eventos de producción de superóxido, llamados destellos superóxido, en las mitocondrias individuales de células intactas. Flash superóxido sirve como una función compuesta de la respiración mitocondrial, acompañamiento transitoria despolarización de la membrana mitocondrial y la producción de ROS ^17-20. Recientemente, hemos generado las pan-tejido mt-cpYFP ratones transgénicos utilizando el vector pUC-CAGGS-mt-cpYFP ^17,19 en C57/BL6 fondo y verificado las expresiones fuertessión de este indicador en el corazón, los músculos esqueléticos y otros tejidos (Figura 2). Los ratones transgénicos estará disponible para los investigadores académicos interesados ​​previa solicitud y aprobación MTA por la Universidad de Washington.

En este estudio, se describe en la formación de imágenes in situ de destellos superóxido en corazón Langendorff perfundidos, así como formación de imágenes in vivo de eventos de flash en los músculos esqueléticos de MT-cpYFP ratones transgénicos anestesiados ^17,19. Esta tecnología permite la monitorización en tiempo real de eventos de producción de ROS mitocondriales individuales en un estado fisiológicamente relevante o in vivo ^21,22. También es factible utilizar el sistema para controlar otros parámetros mitocondriales individuales tales como el potencial de membrana y de calcio con indicadores fluorescentes apropiados. Evaluación Además, simultánea o paralela de la función mitocondrial con eventos intracelulares (por ejemplo, los transitorios de calcio) o la función del corazón (por ejemplo,. Fracción de eyección) se puede lograr. Perturbaciones patológicas, tales como la isquemia y la reperfusión, se pueden aplicar al corazón perfundido para evaluar el impacto del estrés sobre la función mitocondrial solo en el miocardio intacto.

1. Preparación experimental

1. Preparar la solución isotónica salina equilibrada (50 ml) que contenía: NaCl 140 mM, KCl 5 mM, 2,5 mM de _CaCl2, 2 mM de MgCl ₂ y 10 mM de HEPES (pH 7,2) para obtener imágenes de músculo esquelético in vivo.
2. Preparar 1 L de tampón de Krebs-Henseleit (KHB) que contiene: NaCl 118 mM, 5,3 mM de KCl, 1,2 mM de _MgSO4, 0,5 mM de EDTA y 25 mM de _NaHCO3.
3. Burbuja la KHB con gas que contiene 95% de _O2 / 5% de CO ₂ durante 10-15 min antes de la adición de 2 mM de _CaCl2. Añadir sustratos metabólicos (por ejemplo, 10 mM de glucosa y piruvato 0,5 mM).
4. Preparar los instrumentos quirúrgicos mediante la esterilización de la abrazadera, tijeras, fórceps y en etanol al 70% y luego enjuagar en esterilizada ddH ₂ O.
5. Encienda el sistema de perfusión cardíaca, ajuste la temperatura del baño de agua y bomba de circulación, ajuste la velocidad de la bomba peristáltica a 6 ml / min.
6. Burbuja del KHB con 95% de _O2/ 5% de CO ₂ de gas, y controlar la velocidad de flujo y la temperatura (37 ° C, por una sonda de temperatura de fibra óptica) del efluente. El sistema necesita unos 20 minutos para el gas y la temperatura de equilibrio.

2. Imagen confocal de los músculos esqueléticos en Vivo

1. Anestesie ratón con pentobarbital (80 mg / kg, ip). El animal llegará a la anestesia quirúrgica (sin respuesta a la pizca dedo del pie) dentro de 10 a 15 min y permanecer en este estado durante 1 a 1,5 horas, suficiente para la formación de imágenes in vivo de los músculos esqueléticos.
2. Eliminar los pelos en una de las extremidades posteriores y esterilizar la piel con etanol al 70%.
3. Hacer una incisión en la piel a lo largo del lado exterior de la extremidad para exponer los músculos gastrocnemio.
4. Levante el epimisio suavemente con un fuerte fórceps y hacer una incisión a través de él con unas tijeras. Además diseccionar para eliminar el epimisio y exponer las fibras musculares debajo de ella.
5. Para la carga in vivo de TMRM en el esqueletomuscular, incluyen TMRM (500 nM) en la solución salina balanceada isotónica para sumergir el músculo durante 30 minutos y luego lavar a cabo por la solución de indicador libre.
6. Ponga el ratón en su lado en el microscopio confocal (Zeiss LSM 510) escenario y sujetar la extremidad trasera en una posición que el músculo esquelético expuesto se enfrenta contra el cubreobjetos que forma el fondo de la cámara. El cubreobjetos está en entre el tejido muscular y el objetivo invertida (aceite de 40X).
7. Pulse la pierna hacia abajo suavemente para hacer contacto estrecho entre el tejido y el cubreobjetos. Sumerja los músculos expuestos en solución salina balanceada isotónica.
8. Graba dos (2D, xy) confocal de imágenes tridimensionales en una frecuencia de muestreo de un segundo por fotograma. La intensidad de cada píxel se digitaliza a una profundidad de 8 bits. Por lo general, una exploración de serie contiene 100 marcos.
9. Recoge imágenes secuenciales por primera excitante a 405 nm y recogiendo a> 505 nm entonces a 488 nm mientras que la recogida de> 505 nm de longitud de onda dual excitation de imagen de mt-cpYFP. Utilice la excitación secuencial a 405, 488 y 543 nm, y recoger emisión a 505-545, 505-545, y> 560 nm, respectivamente, para el triple longitud de onda de excitación de formación de imágenes de MT-cpYFP y TMRM.

3. Imagen confocal de corazón perfundido Ratón

1. Inmediatamente después de la formación de imágenes in vivo de los músculos esqueléticos, inyectar el ratón con 200 unidades de heparina (IP). Diez minutos más tarde, la eutanasia el ratón por toracotomía y rápidamente quitar el corazón con los pulmones y el timo se le atribuye.
2. Quite rápidamente el pulmón en tampón enfriado con hielo. Identificar los lóbulos del timo y pelar suavemente hacia atrás para exponer la aorta ascendente.
3. Retire el timo y aislar la aorta quitando cuidadosamente cualquier tejido circundante.
4. Haga un corte en el extremo superior de la aorta ascendente antes de la primera rama del arco aórtico.
5. Sostenga la pared de la aorta suavemente con dos pinzas de micro de sutura para exponer la luz y coloque cuidadosamente la aorta en la cannula (PE50 tubo). La aorta se mantiene en su lugar con una abrazadera micro buque mientras las suturas se atan rápidamente alrededor de la aorta.
6. Retire la abrazadera, comprobar cuidadosamente la cánula con una pinza para asegurarse de que la punta de la cánula se encuentra por encima de la raíz aórtica. Lazos adicionales se añaden según sea necesario para mantener el corazón en el lugar.
7. Encienda la bomba peristáltica y perfundir el corazón a 1 ml / min. El corazón se reanudará superando a la perfusión.
8. Ajuste la posición del sistema de perfusión y poner el corazón en la platina del microscopio. La etapa tiene un adaptador que permite el calentamiento de la cámara que contiene el corazón.
9. Añadir 1 ml de solución de perfusión KHB en la cámara para sumergir parcialmente el corazón. Controle la temperatura de la cámara a 37 ° C. Eliminar efluente de la cámara de mediante el uso de una bomba peristáltica.
10. Aumentar la velocidad de la bomba peristáltica gradualmente para proporcionar un caudal suficiente (aproximadamente 2 ml / min) para el corazón.
11. Después de 10 min de estabilización, perfundir el heaRT con 10 blebbistatin M y 100-500 nM TMRM. Los latidos del corazón se ralentizará después de 10 min.
12. Aplicar una suave presión sobre el corazón para asegurar el contacto hermético de la corazón con el cubreobjetos en la parte inferior de la cámara y para suprimir aún más los latidos del corazón.
13. Siga el mismo procedimiento con la imagen confocal de miocardio intacto tal como se describe en el paso 2.8 anterior. Ajuste con cuidado el plano focal para mostrar la imagen más clara posible.

4. Procesamiento de imágenes y análisis de datos

1. Utilice las herramientas proporcionadas por el módulo "Análisis fisiológico" del software confocal para analizar los flashes y los cambios potenciales de membrana mitocondrial individuales. Este módulo se incluye a menudo en el software de adquisición de imágenes del sistema confocal y permite la determinación de ciertas áreas de la imagen, así como la salida de intensidad de fluorescencia con etiquetas de tiempo.
2. Abra la base de datos y, a continuación el archivo de imagen 2D en serie para ser analizados.
3. Haga clic en la "Regiónde interés (ROI) significa "para cambiar a la" media de rendimiento de la inversión "de modo. Haga clic en la" zona de interés (ROI) significa "cambiar a" modo de media de rendimiento de la inversión ".
4. Apagar la pantalla de otros canales excepto el canal de cpYFP 488 nm para la selección de los flashes.
5. Zoom en la imagen y mover manualmente barra deslizante para reproducir las imágenes en 2D de serie.
6. Identificar flashes superóxido mitocondriales individuales localizando el lugar donde la señal aumenta transitoriamente fluorescentes. Utilice la herramienta de ROI adecuado para marcar los flashes. La traza que muestra el cambio de fluorescencia en función del tiempo de cada ROI se mostrará junto a la imagen.
7. Después de seleccionar todos los flashes, encienda la pantalla de otros canales. Seleccione un retorno de la inversión en la imagen exterior de la célula para el fondo de la señal de resta. Salida de la fluorescencia media de cada retorno de la inversión junto con las etiquetas de tiempo.
8. Anote el número de flashes en cada uno de los archivos de imagen de escaneo de serie junto con el tiempo de ciclo y el área dela célula. Uso de Excel para calcular la frecuencia de flash como el número de destellos por 100 seg área de la celda / 1000 m ^2.
9. Utilice un programa personalizado-desarrollado escrito en lenguaje de datos interactivo (IDL, ResearchSystems) para calcular los parámetros de cada destello (amplitud, tiempo hasta el pico y el tiempo de decaimiento). Software IDL está disponible comercialmente y el programa personalizado-desarrollado para el análisis de parámetros de flash se puede obtener de autor a petición.

De acuerdo con este protocolo, formación de imágenes in vivo de eventos mitocondriales individuales se puede hacer en los músculos esqueléticos de ratones anestesiados, seguido de formación de imágenes en situ en el corazón perfundido (Figura 1). El ajuste óptimo de las condiciones de formación de imágenes se asegurará de imágenes claras de los tejidos musculares intactas y con resolución única mitocondria (Figura 2). TMRM se utiliza a menudo para verificar la ubicación de mt-cpYFP y debe mostrar un patrón de superposición completa con la señal mt-cpYFP (Figura 2). TMRM es un indicador disponible en el mercado para la medición del potencial de membrana mitocondrial en células intactas ^23. Sus espectros se distinguen de la de cpYFP. Además, usando el método de excitación secuencial, las señales de emisión de TMRM y mt-cpYFP serán no interfieran entre sí ^17. Imágenes representativas se muestran en la Figura 3 indican que solo Acco flash de superóxido mitocondrialmpanied por despolarización de la membrana se puede identificar en las imágenes de exploración 2D en serie, con un aumento transitorio de fluorescencia sobre las señales de fondo en ambos tejidos de músculo esquelético y el miocardio (Figura 3). Además de alta resolución, se requiere también la intensidad de fluorescencia adecuado. Esto puede lograrse mediante la modulación de la intensidad del láser y la ganancia en los canales de recogida. En general, la señal de fluorescencia basal de la célula se fija en un tercio a un cuarto de la intensidad máxima de la canal. Dado que el nivel de expresión de mt-cpYFP y la carga de TMRM puede variar entre los animales, puesta a punto de las condiciones de formación de imágenes se debe hacer para cada experimento. Ambas perturbaciones fisiológicas y patológicas, tales como sustratos metabólicos ^17,19, estimulación eléctrica (Figura 4), ^{​​20-reperfusión} isquémica ^17, se han utilizado para demostrar que la actividad de flash superóxido responde a los cambios en el estado metabólico celular.

Figura 1. Ilustración esquemática de la imagen confocal de los músculos esqueléticos y de Langendorff corazón perfundido. El ratón transgénico que expresa MT-cpYFP se anestesia y los músculos esqueléticos en una de las extremidades posteriores están expuestos para formación de imágenes confocal. El corazón se perfunde a continuación, en el modo de Langendorff y la imagen confocal se llevó a cabo. El procesamiento de imágenes y análisis de datos con el software confocal y un programa a medida desarrollado.

Figura 2. Confocal de imágenes de las fibras musculares esqueléticas in vivo y el miocardio en el corazón perfundido. A. Imágenes representativas que muestran los músculos esqueléticos de no transgénicos (NTG) y mt-cpYFP transgénico (mt-cpYFP) ratón cargado con membrana mitocondrial indicador potencial, imágenes TMRM. B. representativas que muestran la myocardium de Ntg y mt-cpYFP ratones en Langendorff perfundidos corazón. Ex: longitud de onda de excitación. mt-cpYFP se excita a 405 y 488 nm con emisiones recogidas a 505-530 nm (azul) y de 505 a 530 nm (verde), respectivamente. TMRM se excita a 543 nm con emisiones recogidas en> 560 nm (rojo). Las barras de escala = 50 m.

Figura 3. Individuales parpadea superóxido mitocondriales detectados en los músculos esqueléticos in vivo y en el corazón perfundido. A. Imágenes representativas (panel superior) y trazas de cambio en función del tiempo de fluorescencia (mt-cpYFP a 405 y 488 nm de excitación y TMRM a 543 nm de excitación, panel inferior) muestra un solo destello dismutasa mitocondrial (resaltado por flechas de color naranja en el agrandamiento parte de las imágenes) en las fibras musculares esqueléticas. Tenga en cuenta la señal de mt-cpYFP aumentado (a 488 nm de excitación) se acompaña de una disminución de la señal TMRM. Imag B. Representantees (panel superior) y trazas de cambio de fluorescencia en función del tiempo (panel inferior) durante un solo flash de superóxido mitocondrial del miocardio perfundido. Las barras de escala = 50 micras. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 4. El aumento de superóxido frecuencia de destello en el corazón perfundido por la estimulación eléctrica. El corazón se estimuló eléctricamente (de estimulación, 4 V y 2 Hz) durante 2 min. Los datos son la media ± SEM, n = 8 células. *:. P <0,05 frente Descansar Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Imaging eventos mitocondriales individuales en animales vivos o en los órganos perfundidos tiene ventaja significativa sobre los métodos tradicionales de evaluación de la función mitocondrial ^{17,19,21,22,24,25.} La técnica descrita aquí puede lograr en tiempo real en la determinación in situ de la función mitocondrial en una condición fisiológica real en la resolución subcelular. Esto es particularmente útil, cuando se combina con otras mediciones, para estudiar sistémicamente el papel de las mitocondrias en la función normal de un órgano o tipo de célula in vivo. Esta es una técnica complicada que combina la microscopía confocal y sofisticado sistema de perfusión con el control de varios parámetros. Sin embargo, esta técnica se ha utilizado para vincular el metabolismo de la glucosa todo el cuerpo con la función mitocondrial muscular ^17,19,20 y actualmente está empleado por nosotros para estudiar la disfunción mitocondrial en las enfermedades del corazón.

El perfusio corazón Langendorffn sistema es compatible con la evaluación de la función cardíaca a través de la vigilancia de la presión del ventrículo izquierdo y la formación de imágenes intracelulares de Ca ^{2 +} transitorios durante cada latido. Por otra parte, otros indicadores fluorescentes como MitoSOX o DCF pueden ser perfundidos para facilitar en las imágenes in situ de los niveles de ROS en el estado estacionario en el miocardio. Langendorff perfundidos corazón ha sido ampliamente utilizado para evaluar la respuesta del corazón a fisiológica (por ejemplo, estimulación β-adrenérgico por dobutamina) o patológica (por ejemplo, isquemia reperfusión) perturbaciones ^26-28. Tales tratamientos pueden ser incorporados en el sistema de imagen confocal para evaluar la función mitocondrial solo en respuesta a las tensiones.

Las limitaciones de este método incluyen la selección de los tejidos / órganos que sean factibles para obtener imágenes de animales vivos. Tejidos superficiales tales como los músculos esqueléticos, estructuras subcutáneas y nervios superficiales son ideales para imagen confocal en vivo animal. Los órganos internos son técnicamente apropiado para imágenes de animales vivos, debido a los grandes daños al ratón mientras se expone el órgano. Sin embargo, los órganos internos se pueden configurar para la perfusión de órganos / cultura, tales como el corazón Langendorff perfundidos o cultivo de cortes de cerebro, si un entorno fisiológico mimético se puede mantener. Además, microscopio confocal de formación de imágenes tiene una profundidad efectiva de 30-50 micras, lo que permite la formación de imágenes de unas pocas capas de células debajo de la superficie del órgano. Es posible que este sistema se puede combinar con un microscopio de múltiples fotones, que tiene una profundidad de penetración mucho más alto (por ejemplo, hasta 1 mm) y se ha utilizado para evaluar la función mitocondrial en el corazón intacto ^29. Movimiento artefacto es otro tema fundamental que debe ser considerado. Las mitocondrias en los músculos esqueléticos y miocitos cardíacos mostraron un mínimo movimiento durante la exploración. Por otra parte, inducida por los latidos del corazón-un artefacto de movimiento puede ser suprimida o eliminada por perfusión con blebbistatin unND aplicación de una suave presión sobre el corazón. En otros tipos de células, tales como las neuronas y los fibroblastos, las mitocondrias pueden sufrir movimientos constantes y dramáticos. Durante el procesamiento y análisis de imágenes, cualquier cambio de señal debido a artefactos de movimiento deben ser cuidadosamente identificadas y excluidas.

Desafíos adicionales de esta técnica incluyen el mantenimiento de la condición adecuada durante todo el experimento, los controles positivo y la interpretación de datos. Para imágenes músculo esquelético en ratones anestesiados, la superficie muscular expuesta sumergir en tampones fisiológicos en todo momento. Los signos vitales del ratón, tales como la respiración deben ser monitoreados durante todo el experimento. Para los estudios del corazón perfundido, se requieren oxigenación adecuada, control de la temperatura y suministro de sustrato. Se recomiendan controles positivos para verificar el estado y la capacidad de respuesta de los tejidos. Para ello, los ratones pueden ser inyectados con insulina o glucosa y corazones perfundidos puede ser estimular eléctricamentecionados o perfusión de isoproterenol. El aumento de los flashes superóxido deben ser observados después de estos tratamientos (Figura 4) ^19,20. Además, se toman las imágenes con lapso de tiempo cuando el artefacto de movimiento se suprime mediante la inhibición de los latidos del corazón, que produce las condiciones sub-fisiológicos debido a la carga de trabajo disminuye. Por lo tanto, el experimento corazón perfundido debe ser considerado como un mimético de cerca de la situación in vivo.

Por último, la técnica fue desarrollada utilizando un confocal Zeiss (LSM 510). Otro sistema confocal (por ejemplo, Nikon, Olympus o Leica) se puede utilizar si el sistema cumple con los siguientes requisitos: (1) tiene el modo de exploración de cuadros de lapso de tiempo, (2) tiene una velocidad de muestreo de 1 seg / marco, y (3) puede alcanzar una resolución mitocondria individual (por ejemplo, 1 m x 2 m). El software de un sistema confocal por lo general permite el procesamiento de imágenes simple y análisis, tales como la definición de la salida de ROI y la intensidad de fluorescencia con TIME etiquetas. Alternativamente, el software Image J se puede utilizar tanto para análisis de imagen y de cálculo de parámetros de flash.

En resumen, la formación de imágenes de eventos mitocondriales individuales tales como flashes superóxido en los músculos esqueléticos en vivo o en el corazón perfundido es un enfoque único para la determinación en tiempo real de la función mitocondrial. Esta técnica es un avance significativo sobre las mediciones tradicionales in vitro y proporcionará una evaluación más precisa de la función mitocondrial y su relación con los procesos celulares / funciones bajo condiciones fisiológicas reales.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Los autores desean agradecer a los Dres. Heping Cheng, Huiliang Zhang y Stephen Kolwicz por sus valiosos comentarios y apoyo técnico en el desarrollo de este método. Este estudio fue apoyado por subvenciones del NIH y el Bono de Desarrollo Científico de la Asociación Americana del Corazón para WW.