Imaging confocale delle singole mitocondriali superossido illumina di cuore intatto o

La microscopia confocale a scansione viene applicato per l'imaging eventi mitocondriali singoli in cuore perfuso o muscoli scheletrici in animale vivo. Monitoraggio in tempo reale dei processi mitocondriali singoli, come vampate di superossido e di membrana potenziali fluttuazioni consente la valutazione della funzione mitocondriale in un contesto fisiologicamente rilevanti e durante le perturbazioni patologiche.

Mitocondrio è un organello intracellulare critico responsabile per la produzione di energia e di segnalazione intracellulare nei sistemi eucarioti. Disfunzione mitocondriale spesso accompagna e contribuisce alla malattia umana. La maggior parte dei metodi che sono stati sviluppati per valutare la funzione mitocondriale e la disfunzione si basano su in vitro o ex vivo misurazioni. I risultati di questi esperimenti hanno limitato la capacità di determinare la funzione mitocondriale in vivo. Qui, descriviamo un nuovo approccio che utilizza la microscopia confocale a scansione per l'imaging di tessuti intatti in aminals vivi, che permette di valutare singola funzione mitocondriale in maniera tempo reale in vivo. In primo luogo, generiamo topi transgenici che esprimono la mitocondriale mirato indicatore superossido, proteina fluorescente giallo circolarmente permutato (mt-cpYFP). Mt-cpYFP anestetizzato mouse è fissato su una scheda palcoscenico su misura e time-lapse immagini sono prese fRom muscoli scheletrici esposte del arti posteriori. Il mouse viene successivamente sacrificato e il cuore è impostato per Langendorff perfusione con soluzione fisiologica a 37 ° C. Il cuore perfuso è posizionato in una camera speciale sul palco microscopio confocale e leggera pressione viene applicata per immobilizzare il cuore e sopprimere battito cardiaco indotto artefatti da movimento. Superossido lampi vengono rilevati mediante real-time confocale 2D immagini ad una frequenza di un fotogramma al secondo. La soluzione di perfusione può essere modificata per contenere diversi substrati respiratori o altri indicatori fluorescenti. La perfusione può anche essere regolata per produrre modelli di malattie come l'ischemia e riperfusione. Questa tecnica è un approccio unico per la determinazione della funzione di singolo mitocondrio in tessuti normali e in vivo.

I mitocondri svolgono un ruolo centrale nella bioenergetica di cellule, di segnalazione dei radicali liberi, redox omeostasi, regolazione ione, e il destino delle cellule determinazione ^1,2. La disfunzione dei mitocondri spesso accompagna e sottende la patogenesi delle malattie ^3-6. Soprattutto nei sistemi muscolari come il cuore e nei muscoli scheletrici, respirazione mitocondriale fornisce la maggior parte di ATP per sostenere regolamentazione tempestiva di calcio intracellulare e robusto ^7,8 sviluppo della forza. Questi muscoli in possesso di un gran numero di mitocondri, che spesso occupano fino al 20-40% del volume cellulare totale e sono "corretti" tra miofilamenti ^2.

Nonostante i numerosi studi, la nostra comprensione della regolazione della funzione mitocondriale, in particolare in vivo e in condizioni fisiologicamente rilevanti, è limitata. Uno dei motivi è che la maggior parte dei metodi sviluppati per valutare la funzione mitocondriale contare su di Vitroo approcci ex vivo, quali il monitoraggio del consumo di ossigeno di mitocondri isolati, completata con substrati artificiali, e la determinazione indiretta della funzionalità mitocondriale mediante la morfologia (ad esempio microscopia elettronica), l'attività enzimatica (ad esempio attività aconitasi), o livelli di ATP intracellulari ^9-11 .

Recentemente, piccoli indicatori fluorescenti molecola con relativa arricchimento mitocondriale sono stati applicati per fornire un assaggio dei segnali mitocondriali, tra cui il potenziale di membrana, di calcio e di specie reattive dell'ossigeno (ROS), in cellule intatte ^11-13. Inoltre, vari proteina fluorescente verde (GFP) basato redox e ROS indicatori sono stati sviluppati per ottenere una valutazione più specifica del redox intracellulare compartimenti o segnali ROS ^14-16. Tra questo, abbiamo sviluppato un indicatore geneticamente codificato superossido, la proteina fluorescente gialla permutato circolare, e targeted in mitocondri (mt-cpYFP) ^17. mt-cpYFP può essere eccitato a 405 o 488 nm con entrambi i picchi di emissione a 515 nm. L'emissione a 488 nm di eccitazione è specificamente rispondenti a superossido come mostrato dalla precedente in vitro e in vivo calibrazioni ^17,18. L'emissione a 405 nm di eccitazione viene utilizzato come controllo interno (si veda la Figura 1 di Ref 17 per informazioni dettagliate sulle emissioni di eccitazione e spettri di mt-cpYFP in varie condizioni). Con il time-lapse imaging confocale, questo indicatore rileva scoppio eventi di produzione di superossido, chiamato superossido lampi, in singoli mitocondri delle cellule intatte. Superossido in flash serve come una funzione composta di respirazione mitocondriale, accompagnamento transitoria depolarizzazione della membrana mitocondriale e la produzione di ROS ^17-20. Recentemente, abbiamo generato i pan-tessuto mt-cpYFP topi transgenici con il vettore pUC-CAGGS-mt-cpYFP ^17,19 su C57/BL6 sfondo e verificato le forti espressionisione di questo indicatore nel cuore, muscoli scheletrici e altri tessuti (Figura 2). I topi transgenici sarà disponibile per ricercatori accademici interessati su richiesta e approvazione MTA dall'Università di Washington.

In questo studio, descriviamo in situ imaging lampeggia superossido in Langendorff cuore perfuso e immagini in vivo di eventi flash nella muscoli scheletrici di anestetizzati mt-cpYFP topi transgenici ^17,19. Questa tecnologia consente il monitoraggio in tempo reale dei singoli eventi mitocondriali di produzione di ROS in una condizione fisiologicamente rilevanti o in vivo ^21,22. È anche possibile utilizzare il sistema per monitorare altri parametri singoli mitocondriali come potenziale di membrana e calcio con indicatori fluorescenti appropriati. Valutazione ulteriore, simultanea o parallela della funzione mitocondriale con eventi intracellulari (ad esempio transienti di calcio) o funzione cardiaca (ad esempio. Frazione di eiezione) può essere raggiunto. Perturbazioni patologiche, quali ischemia e riperfusione, possono essere applicati al cuore perfuso per valutare l'impatto dello stress sulla singola funzione mitocondriale nel miocardio intatta.

1. Esperimento Preparazione

1. Preparare la soluzione isotonica salina bilanciata (50 ml) contenente: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl _2, 2 mM MgCl ₂ e HEPES 10 mM (pH 7,2) per imaging in vivo muscolo scheletrico.
2. Preparare 1 L di tampone Krebs-Henseleit (KHB) contenente: 118 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 1,2 MgSO mm _4, EDTA 0,5 mm e 25 NaHCO mm _3.
3. Bubble il KHB con gas contenente 95% O _2/5% di CO ₂ per 10-15 minuti prima dell'aggiunta di 2 mM CaCl _2. Aggiungi substrati metabolici (glucosio ad esempio 10 mm e piruvato 0,5 mm).
4. Preparare gli strumenti chirurgici sterilizzando la pinza, forbici e pinze in etanolo al 70% e poi risciacquo in sterilizzata DDH ₂ O.
5. Accendere il sistema di perfusione cardiaca, regolare la temperatura su bagnomaria e circolatore, impostare la velocità della pompa peristaltica di 6 ml / min.
6. Bubble il KHB con il 95% O ₂/ 5% CO ₂ gas, e il controllo della portata e della temperatura (37 ° C, da una sonda di temperatura a fibre ottiche) dell'acqua residua. Il sistema necessita di circa 20 minuti per il gas e temperatura di equilibrazione.

2. Imaging confocale dei muscoli scheletrici In Vivo

1. Anestetizzare mouse con pentobarbital (80 mg / kg, ip). L'animale raggiungerà anestesia chirurgica (nessuna risposta al pinch tep) entro 10-15 minuti e rimane in questo stato per 1-1,5 ore, sufficiente per l'imaging in vivo dei muscoli scheletrici.
2. Rimuovere peli su una delle zampe posteriori e sterilizzare la pelle con etanolo al 70%.
3. Fare un'incisione sulla pelle lungo il lato esterno dell'arto per esporre i muscoli gastrocnemio.
4. Sollevare il epimisio delicatamente con una pinza taglienti e fare un'incisione attraverso di essa con le forbici. Ulteriore sezionare per rimuovere il epimisio ed esporre le fibre muscolari sotto di esso.
5. Per il carico in vivo di TMRM nel scheletricomuscolare, includono TMRM (500 nM) in soluzione isotonica salina bilanciata di immergere muscolare per 30 minuti e poi lavare con una soluzione priva di indicatore.
6. Posizionare il mouse su un lato con il microscopio confocale (Zeiss LSM 510) stadio e trattenere l'arto posteriore in una posizione che il muscolo scheletrico esposta sia rivolta contro il coprioggetto che forma il fondo della camera. Il vetrino è tra il tessuto muscolare e l'obiettivo invertita (olio 40X).
7. Premere la gamba delicatamente verso il basso per rendere stretto contatto tra il tessuto e il vetrino. Immergere i muscoli esposti in soluzione isotonica salina bilanciata.
8. Record bidimensionali (2D, xy) le immagini confocale ad una frequenza di campionamento di un secondo per fotogramma. L'intensità di ciascun pixel viene digitalizzato in profondità di 8-bit. Di solito, una scansione seriale contiene 100 fotogrammi.
9. Raccogliere immagini sequenziali di primo emozionante a 405 nm e la raccolta a> 505 nm poi a 488 nm, mentre la raccolta a> 505 nm per doppia lunghezza d'onda excitation imaging mt-cpYFP. Utilizzare eccitazione sequenziale a 405, 488 e 543 nm, e raccogliere emissione a 505-545, 505-545 e> 560 nm, rispettivamente, per tre lunghezze d'onda di eccitazione imaging mt-cpYFP e TMRM.

3. Imaging confocale di cuore perfuso mouse

1. Subito dopo imaging in vivo dei muscoli scheletrici, iniettare il mouse con 200 unità di eparina (ip). Dieci minuti dopo, eutanasia il mouse toracotomia e rapidamente rimuovere il cuore con i polmoni e timo collegato ad esso.
2. Rimuovere rapidamente il polmone in tampone ghiacciato. Identificare i lobi del timo e la buccia delicatamente per esporre l'aorta ascendente.
3. Rimuovere il timo e isolare l'aorta rimuovendo accuratamente qualsiasi tessuto circostante.
4. Effettuare un taglio all'estremità superiore della aorta ascendente prima del primo ramo della dell'arco aortico.
5. Tenere la parete dell'aorta delicatamente con due pinze sutura micro per esporre il lume e posizionare accuratamente l'aorta sulla cannula (PE50 tubo). L'aorta è tenuto in posizione con un morsetto nave micro mentre suture vengono rapidamente legato intorno all'aorta.
6. Rimuovere la fascetta, controllare attentamente la cannula con una pinza per assicurarsi che la punta della cannula è al di sopra della radice aortica. Legami vengono aggiunti se necessario per tenere il cuore a posto.
7. Accendere la pompa peristaltica e profumato cuore a 1 ml / min. Il cuore riprende a battere su di perfusione.
8. Regolare la posizione del sistema di perfusione e mettere il cuore sul palco microscopio. Lo stadio ha un adattatore che permette il riscaldamento della camera che contiene il cuore.
9. Aggiungere 1 ml di soluzione di perfusione KHB nella camera di immergere parzialmente cuore. Controllo della temperatura della camera a 37 ° C. Rimuovere effluenti dalla camera utilizzando una pompa peristaltica.
10. Aumentare la velocità della pompa peristaltica gradualmente per fornire un flusso sufficiente (circa 2 ml / min) al cuore.
11. Dopo 10 min di stabilizzazione, profumato il heart con 10 micron blebbistatin e 100-500 nM TMRM. Battito cardiaco rallenta dopo 10 min.
12. Applicare una leggera pressione sul cuore per assicurare stretto contatto del cuore con il coprioggetto sul fondo della camera e per sopprimere ulteriormente battito cardiaco.
13. Seguire la stessa procedura per l'imaging confocale di miocardio intatto come descritto nel precedente punto 2.8. Regolare accuratamente il piano focale per rivelare l'immagine più chiara possibile.

4. Image Processing e Analisi dei Dati

1. Utilizzare gli strumenti forniti dal modulo "Analisi fisiologica" del software confocale per analizzare singoli mitocondriali lampeggia e membrana potenziali cambiamenti. Questo modulo è spesso incluso nel software di acquisizione di immagini del sistema confocale e permette la determinazione di certe aree dell'immagine così come uscita di intensità di fluorescenza con etichette temporali.
2. Aprire il database e quindi il file immagine 2D di serie da analizzare.
3. Fare clic su "Regioned'interesse (ROI) significa "per passare al" media di ROI "mode. Clicca sul" regione di interesse (ROI) significare "per passare alla modalità" media del ROI ".
4. Disattivare la visualizzazione di altri canali, tranne il canale di cpYFP 488 nm per la selezione dei lampi.
5. Zoom a immagine e spostare manualmente barra di scorrimento per riprodurre le immagini 2D seriali.
6. Identificare i singoli mitocondriali superossido lampeggia individuando il luogo in cui gli aumenti segnale fluorescente transitoriamente. Utilizzare lo strumento ROI adeguato per contrassegnare i flash. La traccia mostrando tempo-dipendente variazione di fluorescenza di ogni ROI apparirà accanto all'immagine.
7. Dopo aver selezionato tutti i flash, attivare la visualizzazione di altri canali. Selezionare un ROI sull'immagine all'esterno della cellula per segnale sottrazione del fondo. Uscita la fluorescenza media di ogni ROI insieme alle etichette temporali.
8. Registrare il numero di lampeggi in ciascuno dei file immagine di scansione seriale con il tempo di scansione e l'area dila cella. Utilizzare Excel per calcolare la frequenza flash come numero di lampi per 100 sec / 1,000 micron ² superficie cellulare.
9. Utilizzare un programma personalizzato sviluppato scritto in Interactive Data Language (IDL, ResearchSystems) per calcolare i parametri di ogni flash (ampiezza, tempo al picco e tempo di decadimento). Software IDL è disponibile in commercio e il programma personalizzato sviluppato per analisi parametro flash può essere ottenuta dall'autore su richiesta.

Secondo questo protocollo, imaging in vivo di eventi mitocondriali singoli può essere realizzata in muscoli scheletrici di topi anestetizzati, seguita da in situ imaging cuore perfuso (Figura 1). La regolazione ottimale delle condizioni di imaging garantisce immagini chiare dei tessuti muscolari intatte e con una risoluzione singolo mitocondrio (Figura 2). TMRM viene spesso utilizzato per verificare la posizione del mt-cpYFP e dovrebbe mostrare un pattern completa sovrapposizione con il segnale mt-cpYFP (Figura 2). TMRM è un indicatore disponibile in commercio per la misura del potenziale di membrana mitocondriale in cellule intatte ^23. I suoi spettri sono distinguibili da quello di cpYFP. Inoltre, utilizzando il metodo di eccitazione sequenziale, i segnali di emissione di TMRM e mt-cpYFP non interferiscono tra loro ^17. Immagini rappresentative mostrato in Figura 3 indicano che solo il flash superossido mitocondriale accompanied da depolarizzazione della membrana possono essere identificati nelle immagini di scansione 2D seriali, con un aumento transitorio della fluorescenza nei segnali di fondo in entrambi i tessuti muscolari scheletrici e del miocardio (Figura 3). Oltre ad alta risoluzione, è necessaria anche un'adeguata intensità di fluorescenza. Ciò può essere ottenuto modulando l'intensità del laser e il guadagno nei canali di raccolta. In generale, il segnale di fluorescenza basale dalla cella è fissata a un terzo ad un quarto della massima intensità del canale. Poiché il livello di espressione di mt-cpYFP e il caricamento di TMRM può variare tra gli animali, la messa a punto delle condizioni di imaging dovrebbe essere fatto per ogni esperimento. Entrambe le perturbazioni fisiologiche e patologiche, quali substrati metabolici ^17,19, stimolazione elettrica (figura 4), ^{​​20-riperfusione} ischemica ^17, sono stati utilizzati per dimostrare che l'attività superossido Flash risponde ai cambiamenti di stato metabolico cellulare.

Figura 1. Illustrazione schematica del confocale dei muscoli scheletrici e Langendorff cuore perfuso. Il topo transgenico che esprime mt-cpYFP è anestetizzato e muscoli scheletrici su una delle zampe posteriori sono esposti per l'imaging confocale. Il cuore viene perfuso in modalità Langendorff e immagine confocale è condotta. Analisi elaborazione delle immagini e dei dati utilizzato il software confocale e programma personalizzato sviluppato.

Figura 2. Confocale delle fibre muscolari scheletriche in vivo e miocardio nel cuore perfuso. A. Immagini rappresentative che mostrano i muscoli scheletrici di nontransgenic (RTN) e MT-cpYFP transgenico (mt-cpYFP) Mouse caricato con indicatore potenziale di membrana mitocondriale, immagini TMRM. B. rappresentativi che mostrano il myoCardium di Ntg e mt-cpYFP topi in Langendorff perfusi cuore. Es: Eccitazione. mt-cpYFP è eccitato a 405 e 488 nm, con emissioni raccolti a 505-530 nm (blu) e 505-530 nm (verde), rispettivamente. TMRM è eccitato a 543 nm con emissione raccolte a> 560 nm (rosso). Bar scale = 50 micron.

Figura 3. Singolo mitocondriali superossido lampeggia rilevati nel muscolo scheletrico in vivo e in cuore perfuso. A. Immagini rappresentative (pannello superiore) e le tracce del tempo-dipendente variazione di fluorescenza (mt-cpYFP a 405 e 488 nm di eccitazione e TMRM a 543 nm di eccitazione, pannello inferiore) che mostra un singolo flash superossido mitocondriale (evidenziato dalle frecce arancioni nell'Europa allargata parte delle immagini) in fibre muscolari scheletriche. Si noti la maggiore segnale mt-cpYFP (a 488 nm di eccitazione) è accompagnata da una diminuzione del segnale TMRM. Imag B. Rappresentantees (pannello superiore) e le tracce del tempo-dipendente variazione di fluorescenza (pannello inferiore) durante un singolo flash superossido mitocondriale nel miocardio perfuso. Barre di scala = 50 micron. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 4. Aumento della superossido frequenza di lampeggio nel cuore perfuso dalla stimolazione elettrica. Il cuore è stato stimolato elettricamente (Pacing, 4 V e 2 Hz) per 2 minuti. I dati sono media ± SEM, n = 8 celle. *:. P <0.05 vs Riposarsi Clicca qui per ingrandire la figura .

Imaging eventi mitocondriali singoli organi irrorati di animali vivi o ha un vantaggio significativo rispetto ai metodi tradizionali di valutazione della funzione mitocondriale ^{17,19,21,22,24,25.} La tecnica qui descritta può realizzare in tempo reale in situ determinazione della funzionalità mitocondriale in una condizione fisiologica reale alla risoluzione subcellulare. Ciò è particolarmente utile, quando combinato con altre misurazioni, per studiare sistematicamente il ruolo dei mitocondri nel normale funzione di un particolare organo o tipo cellulare in vivo. Questa è una tecnica complessa che combina microscopia confocale e sofisticato sistema di perfusione con il controllo dei vari parametri. Tuttavia, questa tecnica è stata utilizzata per collegare tutto il metabolismo del corpo del glucosio con il muscolo funzione mitocondriale ^17,19,20 e sono attualmente impiegati da noi per studiare la disfunzione mitocondriale nella malattia di cuore.

Il cuore perfusio Langendorffn sistema è compatibile per la valutazione della funzione cardiaca attraverso il monitoraggio della pressione ventricolo sinistro e l'imaging intracellulare di Ca ^{2 +} transitori durante ogni battito. In alternativa, altri indicatori fluorescenti quali MitoSOX o DCF possono essere perfusi per facilitare l'imaging in situ dello stato stazionario livelli di ROS nel miocardio. Langendorff perfusi cuore è stato ampiamente utilizzato per valutare la risposta del cuore ad fisiologico (ad esempio stimolazione β-adrenergica da dobutamina) o patologiche (es. ischemia riperfusione) perturbazioni ^26-28. Tali trattamenti possono essere incorporati nel sistema di imaging confocale per valutare singola funzione mitocondriale in risposta a stress.

Le limitazioni di questo metodo includono la selezione di tessuti / organi che sono fattibili per l'imaging animale vivo. Tessuti superficiali come i muscoli scheletrici, strutture sottocutanee e nervi superficiali sono l'ideale per l'imaging confocale in vivo animal. Gli organi interni sono tecnicamente inadeguato per l'imaging animale vivo a causa della ingenti danni al mouse, esponendo l'organo. Tuttavia, gli organi interni possono essere impostati per organo perfusione / cultura, come il cuore Langendorff perfusi o cultura fetta cervello, se un ambiente mimetica fisiologico può essere mantenuta. Inoltre, microscopio confocale ha una profondità di imaging efficace di 30-50 micron, che permette l'imaging di pochi strati di cellule sotto la superficie dell'organo. E 'possibile che questo sistema può essere combinato con un microscopio multi-fotone, che ha una profondità di penetrazione molto più elevata (ad esempio fino a 1 mm) ed è stato utilizzato per valutare la funzione mitocondriale nel cuore intatto ^29. Artefatti da movimento è un'altra questione critica che deve essere considerato. I mitocondri nei muscoli scheletrici e dei miociti cardiaci hanno mostrato il minimo movimento durante la scansione. Inoltre, battito cardiaco indotto da artefatti da movimento può essere soppresso o eliminato perfusione con blebbistatin unnd applicazione di una leggera pressione sul cuore. In altri tipi di cellule, come i neuroni e fibroblasti, i mitocondri possono subire movimenti costanti e drammatiche. Durante l'elaborazione di immagini e di analisi, eventuali variazioni di segnale dovute al moto manufatto devono essere attentamente identificati ed esclusi.

Ulteriori sfide di questa tecnica includono il mantenimento della condizione appropriata per tutto l'esperimento, i controlli positivi e interpretazione dei dati. Per l'imaging muscolo scheletrico in topi anestetizzati, la superficie del muscolo esposta deve essere immerso in tamponi fisiologici in ogni momento. Segni vitali del mouse, ad esempio la respirazione devono essere monitorati durante l'esperimento. Per gli studi di cuore perfuso, l'ossigenazione del caso, il controllo della temperatura e la fornitura del substrato sono obbligatori. I controlli positivi si consiglia di verificare lo stato e la reattività dei tessuti. Per fare ciò, i topi possono essere iniettati con insulina o glucosio e cuori perfusi può essere sti elettricamentelata o perfusi con isoproterenolo. Aumento superossido lampeggia devono essere osservati dopo questi trattamenti (Figura 4) ^19,20. Inoltre, i time-lapse immagini sono presi quando il manufatto movimento viene soppressa tramite inibizione battito cardiaco, che produce condizioni sub-fisiologiche a causa del carico di lavoro diminuito. Quindi, l'esperimento cuore perfuso dovrebbe essere considerato come una stretta mimetica della situazione in vivo.

Infine, la tecnica è stata sviluppata utilizzando un confocale Zeiss (LSM 510). Altro sistema confocale (ad esempio Nikon, Olympus e Leica) può essere utilizzato se il sistema soddisfi i seguenti requisiti: (1) presenta modalità di scansione cornice time-lapse, (2) ha una frequenza di campionamento di 1 sec / fotogramma, e (3) può raggiungere la risoluzione mitocondrio singolo (ad esempio, 1 micron x 2 micron). Il software di un sistema confocale consente di solito di elaborazione delle immagini semplice e analisi, come definire la produzione ROI e l'intensità di fluorescenza con tIme etichette. In alternativa, il software Image J può essere utilizzato sia per l'analisi delle immagini e calcolo dei parametri del flash.

In sintesi, l'imaging di eventi mitocondriali singoli come vampate superossido nel muscolo scheletrico in vivo o in perfusione cardiaca è un approccio unico per la determinazione in tempo reale della funzione mitocondriale. Questa tecnica è un progresso significativo rispetto alle misure tradizionali in vitro e fornirà una valutazione più accurata della funzione mitocondriale e il suo rapporto con i processi cellulari / funzioni in condizioni fisiologiche reali.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Gli autori desiderano ringraziare Drs. Heping Cheng, Huiliang Zhang e Stephen Kolwicz per i loro utili commenti e supporto tecnico nello sviluppo di questo metodo. Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni NIH e la Scientist Development Grant dalla American Heart Association a WW.