Выявление ДНК мутации в Очищенная гемопоэтических стволовых / клеток-предшественников

Здесь мы опишем в естественных условиях мутагенеза анализ для небольшого количества очищенных гемопоэтических клеток с использованием трансгенных мышах Лачи. Ген LacI могут быть выделены для определения частоты, расположение и тип мутантов ДНК спонтанно возникшую или после воздействия генотоксинов.

В последние годы стало очевидно, что нестабильность генома тесно связана со многими нарушениями развития, рака, и старения. Учитывая, что стволовые клетки несут ответственность за обеспечение тканевого гомеостаза и ремонт на протяжении всей жизни, то разумно предположить, что популяции стволовых клеток имеет решающее значение для сохранения геномной целостности тканей. Таким образом, значительный интерес возник в оценке воздействия эндогенных и экологических факторов на геномной целостности в стволовых клетках и их потомства, с целью понять этиологию болезней стволовых клеток на основе.

LĀČI трансгенные мыши несут восстановительной λ вектор фага, кодирующей репортерный систему LĀČI, в котором ген LacI служит в качестве репортера мутаций. Результатом мутантного гена LacI является производство β-галактозидазы, который расщепляет хромогенный субстрат, превратив его синий. Репортер система LacI осуществляется яп все клетки, в том числе стволовых клеток / клеток-предшественников и могут быть легко восстановлены и использованы в дальнейшем заражают E. палочка. После инкубации зараженного E. палочка на агарозы, содержащей правильный субстрат, бляшки могут быть забил; голубые бляшки указывают мутантный ген Лачи, в то время как чистые таблички гавань дикого типа. Частота синего (среди ясных) бляшек указывает мутантный частоту в исходной популяции клеток ДНК, извлеченной из. Секвенирование мутантный ген Лачи покажет расположение мутаций в гене и тип мутации.

LacI трансгенных мышах хорошо разработана как в естественных условиях мутагенеза анализа. Кроме того, мыши и реагенты для анализа являются коммерчески доступными. Здесь мы подробно описывают, как эта модель может быть адаптирована для измерения частоты спонтанно возникающего мутантов ДНК в стволовых клеток обогащенный Lin ^- IL7R ^- SCA-1 ⁺ cKit ^{+ +} (LSK) клетки и другие субпопуляции кроветворной системы.

В большинстве тканей, дифференцированные клетки имеют ограниченный срок службы. Для поддержания функциональной целостности, долгоживущие, тканеспецифические стволовые клетки непрерывно производят клетки-предшественники, которые, в свою очередь, привели к возникновению полностью дифференцированных клеток, необходимых для функционирования этой конкретной ткани. Стволовые клетки также пополнить свой собственный отсек посредством процесса, называемого самообновлению. Таким образом, стволовые клетки несут ответственность за поддержание функциональной целостности ткани они проживают дюйма Таким образом, крайне важно, чтобы они оснащены надежными механизмами толку и потенциально ремонт поврежденной ДНК. Если нет, то они могут приобрести несколько геномных (потенциально опасные) возмущения, которые могут быть унаследованы их потомства. Понимание того, как стволовые клетки безопасной охранять их геном течение жизни организма очень важный вопрос, и может помочь нам понять, почему нестабильность генома связано с раком и некоторыми другими возрастными заболеваниями (отзывы в ^1,2).

Управление геномной целостности ткани на уровне стволовых клеток или популяции клеток-предшественников в начале может быть достигнуто путем либо устранение дефектный шток (или клетки-предшественники) клетки через клеточной гибели, старение или дифференцировки и / или эффективного ремонта поврежденной ДНК. Недавние исследования показали, что это возможно для измерения определенных типов репарации ДНК непосредственно в этих редких популяций ^3-6. Было установлено, что, например, в кроветворной системы, двойные разрывы цепи ДНК могут быть устранены путем гомологичной рекомбинации (HR) или негомологичной конце присоединения (NHEJ), причем последний ремонт процесс более низкой точностью и таким образом увеличивается риск принятия ошибки. Оба в настоящее время используются в гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) ^4,5, однако, у мышей кажется, что это в основном NHEJ в ГСК в то время как ранние прародители клетки используют HR ^4. Аналогичное наблюдение было сделано для стволовых клеток в коже ^6. Интересно, что в человеческой ГСК HR, не NHEJ,кажется, ремонт механизма выбора для двойных разрывов ДНК ^3. Является ли это функциональное различие между двумя видами реально или просто представляет технические или экспериментальную разницу еще предстоит выяснить.

Репертуар стволовая клетка для восстановления поврежденных ДНК, вероятно, включать другие механизмы репарации ДНК, такие как эксцизионной репарации оснований (BER), нуклеотид ремонта иссечение (НЭК) и несоответствие ремонта (MMR). BER а НЭК отвечают за ремонт одного или нескольких поражений пар оснований в одноцепочечной ДНК, в то время как MMR исправления база-основные несоответствия и вставки / удаления петли; эти типы повреждений ДНК не может быть отремонтировано NHEJ или HR. Поддержка этого понятия несколько исследований из кроветворной системы, демонстрируя связь между изменениями в одном из этих путей и нарушений в отсек HSC ^7-9, а также повышенным риском развития миелодиспластический синдром ^10-16 болезнь, которая берет свое начало вHSC и что связано с увеличением геномной нестабильности как болезнь прогрессирует ^17. Пока еще не сообщалось измерения BER, НКО и MMR непосредственно в ГСК.

В дополнение к выяснению различные процессы, которые контролируют целостность тканей на механистической точки зрения, крайне важно, чтобы иметь возможность измерить степень мутировал ДНК, так что последствия аберраций в одном из этих процессов могут быть проверены, например, в нормальный по сравнению с генетически инженерные стволовые клетки или в старый по сравнению молодой. Тем не менее, развитие соответствующих анализа трудно из-за недостатка тканеспецифических стволовых клеток, а также отсутствие условий культивирования, сохраняющий "стволовости". Более того, такой анализ должен быть исправимо в экологических и генетических манипуляций. Возможным решением этих ограничений и требований является использование мышиных моделях, которые специально сконструированных для обнаружения мутаций ДНК.

Mulбыли разработаны Кратные трансгенные модели мыши для обнаружения мутаций. Например, трансгенные мыши LacI ¹⁸ несут восстановительной λ вектор фага, кодирующей репортерный систему LĀČI, в котором ген кодирует LacI подавитель оператора Lac и служит в качестве репортера мутаций. После мутацией гена LacI, оператор Lac активируется и β-галактозидазы производится. β-галактозидазы расщепляет хромогенный субстрат Х-Gal (5-бром-4-хлор-е-индолил-β-D-галактопиранозид), который поворачивает это синий. ЦС сайты фланговые вектор Лачи позволяет легко восстановления по фага лямбда белков и последующего заражения E. палочка. После инкубации зараженного E. палочка на агарозы, содержащей X-гал субстрат, бляшки могут быть забил. Синие таблички содержат предполагаемый мутант Лак-я балансовую фаг, а четкие таблички гавани не-мутантов. Частота голубых бляшек (среди йе четкие те) указывает мутантный частоты в исходной клеточной популяции ДНК экстрагировали из. Кроме того, λ фага хостинг цель Лачи можно легко секвенировали с использованием методов ПЦР для относительно высокопроизводительного анализа. Секвенирование несколько мутантные гены Лачи покажет важную информацию о мутации спектра, что в свою очередь может указывать на возможные недостатки конкретных восстановления повреждений ДНК или к конкретным генотоксических событий. Трансгенные система LacI был стандартизирован в нескольких лабораториях ¹⁹ и реагенты коммерчески доступны. Одним из основных недостатков системы LacI является ограниченная способность обнаруживать большие делеции или перестановки, поэтому другие методы, например, многоцветные рыбы на метафазных должны быть использованы, чтобы хвалить этот недостаток.

В λ-фага вектора модели LacI мыши, существует гораздо меньше ген, CII, Доступны для анализа мутаций. Его размер и то, что мутанты могут быть выбраны делает это менее трудоемким и более дешевым анализ ^20, чем анализ генов LacI. Тем не менее, ген LacI более широко изучены в течение ²¹ мутагенеза и чувствительности к мутациям гена был хорошо охарактеризован, так что существует четкое понимание аминокислотных остатков, которые генерируют ответ на фенотипическую хромогенного субстрата ^22-25.

Другие модели мыши для обнаружения мутаций включают использование ΦX174 или LacZ трансгенов. ΦX174 трансгенных мышах, с оригинальным A: T → G: мутация возвращение C анализа ²⁶ или вперед мутация пробирного ^27, что позволяет обнаружение спектра пар оснований замен, представляет собой менее дорогостоящую систему, чем модели LacI. Тем не менее, мутационный экран в прямом анализе не является тривиальной и мутация спецификацииспектра трансгена ΦX174 не так хорошо охарактеризованный как и у LacI. В мышиных моделях, несущих LacZ трансгены, мутационный репортер LacZ восстанавливается с использованием E. палочки клетки-хозяева, которые чувствительны к галактозы и среде, содержащей галактозу ^28. Недостатком этой системы является то, что восстановление мишени LacZ также включает рестрикционной эндонуклеазой с последующим лигированием и электропорации Е. палочка проходит, тем самым затрудняя адаптировать систему для небольшого числа клеток. Хотя это не является обязательным требованием для работы с клеточных популяций стволовых / прародитель (всегда можно начать с более мышей), если большое количество клеток необходимы (например, миллионы или более) она быстро станет непрактичным и непомерно. Кроме того, относительно большие размеры LacZ, обеспечивая при этом чувствительную мутационный репортер, является громоздкой и более дорогостоящим для анализа последовательности ДНК и DETERMминации спектров мутаций. Главное преимущество этой модели, однако, является его способность обнаруживать крупные делеции и вставки, а также хромосомные перестройки.

Так как все клетки в трансгенных моделей LacI, ΦX174 и LacZ мыши несут репортерной системы, любой из этих мышиных моделях может быть использован для измерения мутагенеза в любом типе клеток, представляющих интерес, в том числе стволовых клеток и клеток-предшественников, поскольку они могут быть надежно собраны и в достаточном количестве. Поскольку у нас был большой опыт работы с мышиной модели LacI и мутация пробирного LacI, мы решили продолжить эту систему в дальнейшем для анализа мутагенеза в гемопоэтических стволовых и населения предшественников.

Кроветворной ткани хорошо охарактеризованы в терминах клеточной поверхности фенотипа отдельных его компонентов, в том числе долгосрочных заселения стволовых клеток, которые можно идентифицировать как крайне редких населения Лин ^- IL7R - SCA-1 ⁺ cKit ^{+ +} (ЛСК) / Flk2 ^- CD150 ⁺ CD48 ^- клетки ^29. . Mohrin др. ⁴ показали, что немного больше, население LSK/Flk2 ^- клетки все еще ​​хорошие представители для ГСК и значительно отличается от самой примитивной совершенного миелоидной прародителя (СМР) населения, когда дело доходит до изучения репарации ДНК. Более того, когда HSC обогащенный ЛСК (Flk-2 Flk-2 ⁺ и ^-) клетки по сравнению с Лин ^- IL7R ^- SCA-1-cKit ^{+ +} (клеток LS-K-предшественники), по-прежнему значительная разница в способность ⁵ NHEJ между менее чистыми, клеток обогащенный население LSK и клетки-предшественники стволовых. В нашем исследовании мы используем HSC обогащенный ЛСК (Flk-2 ⁺ и Flk-2 ^-) клетки, потому что мы обнаружили, что по крайней мере 2 х 10 ⁵ клеток необходимы для последовательных, надежных результатов в этом мутагенеза анализа; это число клеток крайне сложнодля получения, когда один сортирует LSK/Flk2 ^- население CD150 ⁺ CD48 или даже LSK/Flk2 ^- населения (с точки зрения мышей, затрат и практичности). Этот протокол, основанный на один первоначально разработанный Kohler и соавт. ¹⁸ подробно описывает, как спонтанный мутант частота ДНК может быть определена в LSK клеток и определили популяции дифференцированных миелоидных клеток, а также безотрывно костного мозга и клеток селезенки.

Лейкоциты из LacI трансгенных мышей на C57BL / 6 фоне не выражают SCA-1 (рис. 1). Поэтому, если Sca-1 представляет собой маркер для очистки клеток, эти мыши должны быть скрещены с соответствующим напряжением, чтобы получить Sca-1 экспрессию, в этом протоколе F1 скрещивания обычных C57BL / 6 (В6) мышей и LacI (C57BL / 6) трансгенных мышей (LacI) был использован (рис. 1). Из клеточных популяций, используемых в данном протоколе, LSKs и CMPS дает незначительный населения в костном мозге. Для того, чтобы очистить по крайней мере, 2 х 10 ⁵ друг / сортировать, объединять костный мозг от примерно десяти мышей при уборке костный мозг только из задних ног или как минимум из четырех мышей, когда и хип-, передние ноги-, позвоночные кости столбцов, и грудины используются.

Сделать одноклеточных суспензий из костного мозга и селезенки. Небольшая часть костного мозга используется как есть, большинство используется для PURзать LSKs и дифференцированные миелоидные клетки-предшественники, т.е. CMPS и гранулоцитарного / моноцитарные предшественники (GMP) с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS). Выделение клеток костного мозга и FACS-очистка этих групп описаны в другом месте ^30-32. Примерно шесть независимых виды должны определить существенные различия в мутации частот между популяциями.

Следующий протокол для измерения спонтанного IN VIVO мутантный частоту в очищенных гемопоэтических субпопуляции адаптирована из нескольких руководствах Stratagene ^33-35, на основе оригинальной работы от Kohler и соавт. ¹⁸ Наиболее важные различия между существующими протоколами ^33-35 и этого протокола , требуется при использовании относительно небольшого количества клеток, включают различия в объемах реагентов и времени и температуры, используемые для протеиназы К инкубации.

1. Образец хранения

После сбора нужных клеточных популяций, аликвоты клеток в 1-мл центрифужные пробирки (числа клеток на аликвоты, см. таблицу 1). Центрифуга при 266 мкг в течение 7 мин, при 4 ° С. Тщательно Аспирируйте супернатант. Положите трубки в жидкий азот в течение 5 мин, а затем передавать их на -80 ° C морозильник для дальнейшего использования. Образцы могут храниться в течение не менее 6 месяцев.

2. Выделение геномной ДНК

1. Возьмите образцы от -80 ° C морозильник. Добавить 500 мкл охлажденного на льду лизирующего буфера ДНК (табл. 3) в пробирку. Vortex трубы для 3-5 сек на средней скорости и поместить пробирки на льду в течение 10 мин.
2. Центрифуга трубки в течение 12 мин, 4000 мкг, 4 ° С Осторожно отбрасывать ~ 450 мкл супернатанта. Спин вниз по трубе в течение 3-5 сек. Используйте стекло капиллярной трубки осторожно удалите оставшуюся часть супернатанта. Высушите на внутренних стенках тон трубку, пока не капельки не могут видеть больше (~ 2 мин).
3. Добавить 2 мкл RNace-It коктейль рибонуклеазы и 10 мкл 1 М DTT к 100 мкл буфера пищеварения ДНК (табл. 3). Регулировка объемы в зависимости от количества образцов, которые будут обрабатываться; 20 мкл этого раствора ДНК пищеварения требуется на образец. После добавления 20 мкл этого к осадку клеток, попробуйте сделать осадок отделить себя от дна, аккуратным постукиванием трубки пальцем или пером.
   Примечание: это может быть трудно понять, осадок из-за низких количества клеток.
4. Добавить 20 мкл протеиназы К решение * (табл. 3) к каждому образцу, очень мягко нажмите трубку снова.
   * Примечание: протеиназы K раствор необходимо нагреть в водяной бане при 50 ° С, 2 мин перед использованием, чтобы активировать фермент.
5. Сразу Поместите пробирку в водяную баню при 50 °. Дайджест образца в соответствии с указаниями в Таблица 1. Нажмите на трубу очень мягко каждые 10 мин.
   Примечание: С такими небольшого числа клеток, температура водяной бани и время пищеварения абсолютно необходимы для успешного получения высокого качества геномной ДНК.
6. Подготовьте ДНК систему диализа в холодной комнате (рис. 2). Налейте 600 мл ТЕ-буфера (табл. 3) в 600 мл стеклянный химический стакан, добавить небольшой магнитной мешалкой таким образом, что буфер может быть перемешивают при диализе и пусть (0,025 мм размер пор) мембраны плавать на поверхности буфера. Одной из мембран на образец; 1-4 мембраны могут быть использованы в одном диализа стакан. Сделайте отметку на полях мембраны с ножницами для идентификации каждого образца.
7. После соответствующего времени варки, добавьте теперь очень вязкий геномной ДНК * бережно к центру плавающей мембраны (рис. 2). Накройте стакан сразу с алюминиевой фольгой. Диализировать геномной ДНК при 4 ° С в течение ~ 16-20ч, перемешать буфер осторожно.
   * Примечание: При работе с вязких растворов ДНК, используйте наконечники с широким отверстием.
8. На следующий день залить 600 мл свежеприготовленного буфера TE (табл. 3) в чистом стеклянном стакане и передавать мембраны к новому химический стакан с ложкой очень тщательно, и Стакан накрывают пленкой. Диализировать еще 2 часа.
9. Извлеките диализной мембраны из стакана с буфером ТЕ с помощью ложки и передавать только наиболее вязкий "глыбу" из раствора ДНК к новой, стерильную пробирку емкостью 1 мл. Храните образец при 4 ° С. Продолжить мутагенеза анализа на следующий день или до 1,5 месяцев. Для очищенных населения, подождать не менее 1 недели.

3. Подготовка лотков для Е. палочка / фаг Культура (день 1)

Каждый лоток будет содержать два различных слоя; агар слой в нижней и агарозном слой в верхней, которая содержит X-гал. Е.палочка / фаг решение будет добавлен к последней. Тип и количество клеток, выделенных будет определять, сколько лотков не требуется. Обратиться к Таблице 1, чтобы рассчитать количество лотков, необходимых и последующих количества решений для этой части протокола. Ниже будет генерировать ~ 60 лотков, которые один опытный человек может обрабатывать легко.

1. Подготовьте следующие носители:
   1. для нижнего слоя, подготовить 6 х 2 л колбы с каждый из которых содержит 1600 мл DDH ₂ O. Добавить NZY порошок (21 г / л) и агар (15 г / л); хорошо перемешать.
   2. для верхнего слоя, подготовить 4 х 1 л колб с каждая из которых содержит 800 мл DDH ₂ O. Добавить NZY порошок (21 г / л) и агарозном (7,2 г / л); хорошо перемешать.
   3. для культивирования E. палочка, добавить 2,5 г порошка NZY друг 2 х 250 мл колбах и довести объем до 100 мл с DDH ₂ O;
   4. для подтверждения лотков, используемых на этапе 8, добавить 8,4 г NZY порошка и 6 г агаг на 1 л колбу и довести объем до 400 мл с DDH ₂ O.
2. Закройте отверстие из колбы с алюминиевой фольгой. Хорошо перемешайте и автоклав их при температуре 121 ° С, 15 фунтов на квадратный дюйм в течение 30 мин.
3. Удалить колбы (очень жарко!) Из автоклава. Тщательно вихрем колбы для смешивания агара и агарозы, затем поместите их в водяной бане при 50 °. Когда вода ванна вновь достигла 50 ° С, залить от 2 л колбах (шаг 3.1.1) ~ 150 мл NZY агара в каждый лоток (нижний слой).
4. Разрешить агар затвердевать при комнатной температуре в течение по крайней мере 2 ч, затем инвертировать и открыть лотки. Поместите нижнюю часть лотков на крышке, 45 ° от центра (рис. 3) и дайте высохнуть в течение 30 мин. Закройте лотки и оставить O / N при комнатной температуре.
5. Между тем, подготовить СКС-8 E. палочка культуры в течение следующего дня. С одной из двух 250 мл колб * (шаг 3.1.3), взять 5 мл NZY бульон (табл. 3) и передать в стерильную 14 мл трубка. Дополнение с 62,5 мкл мальтозы / MgSO ₄ раствор и добавить 10 мкл СКС-8 Е. палочка запаса глицерина. Инкубировать при 37 ° С в течение 3-4 ч при встряхивании при 250-300 оборотов в минуту. С помощью 15 мкл этой культуры для инокуляции 95 мл бульона NZY (в 250 мл колбу боковым отводом), культура O / N при 37 ° С в инкубаторе со встряхиванием (250-300 оборотов в минуту).
   * Примечание: другой 250-мл колбу можно использовать позже, чтобы настроить OD культуры при необходимости (шаг 4.1)
6. Возьмите 1 л колбу с агар (шаг 3.1.4), и залить ~ 6-7 мл NZY агара в 60 мм блюд (этого будет достаточно в течение ~ 50 блюд, необходимых для этапа 8). Разрешить агар затвердеть (~ 10 мин), затем инвертировать и обернуть в пластик. Эти блюда можно хранить при температуре 4 ° С в течение до одного месяца.

4. Подготовка лотков для Е. палочка / фаг культура (2-й день)

1. Проверьте ОП СКС-8 Е. палочка культура (шаг 3.5) на спектрофотометре.Регулировка OD ₆₀₀ до 0,6 с NZY бульона (таблица 3) (этап 3.1.3) и колбу помещают на лед, чтобы остановить рост и не держать на льду до готовности к использованию. Эта информация будет использоваться для шагов 6,3 и 8,2. Эта культура может храниться в течение 5 дней при 4 ° С.
2. Воздух сухой все лотки анализа (налил накануне) в течение ~ 5 часов (рис. 3).

5. Упаковка из геномной ДНК (День 2; продолжение)

1. Возьмите необходимое количество апельсинового Transpack трубки из -80 ° C морозильник и не размещать их на сухом льду до готовности к использованию, возьмите один оранжевый Transpack трубку для каждого упаковочного реакции должны быть выполнены. На каждом трубку соответствующим образом. Есть геномные образцы ДНК (шаг 2.9) готовые на льду.
2. Этот шаг должен быть выполнен один трубу в данный момент. Закончить полный шаг, прежде чем перейти к следующему образца ДНК. Оттепель один оранжевый трубки * ^{примечание 1} быстро: используйте ваши пальцы, пока большинство из них не размораживают, затем положитьна льду. Возьмите соответствующий геномной образец ДНК и немедленно передать 8-12 образец мкл ^* Примечание ^2,3 к оранжевому трубки. Смешайте содержимое, осторожно пипеткой вверх и вниз 3 раза, а также аккуратным постукиванием трубки пальцем. Попробуйте не вводить пузырьков при смешивании. Поместите пробирку в C водяной бане 30 ° в течение 90 мин.
   * Примечание 1: быстрый спин в микроцентрифуге может быть необходимо собрать все содержимое из внутренних стенок и крышки.
   * Примечание 2: объем добавленной образца зависит от числа клеток, используемого для генерации, что образец: 11-12 мкл образцов, полученных от 2.0-5.0 × 10 ⁵ клеток; 10 мкл 1,0 х 10 ⁶ клеток-образцов, и 8 мкл 1,5 х 10 ⁶ клеток-образцов.
   * Примечание 3: ДНК-прежнему очень густой; взять ДНК из, нажмите на кончик пипетки на дно пробирки и тщательно крутить наконечник вокруг к внутренней стенке трубы.
3. Принимать по 1 или 2 синий Transpack втбес * вне -80 ° C морозильник и не размещать их на сухом льду до дальнейшего использования. Thaw них быстро и передать 12 мкл в каждую из оранжевых труб. Смешайте раствор, осторожно пипеткой вверх и вниз 3 раза. Вращайте трубу вниз в течение 2-3 сек, затем нажмите трубку пальцем для дальнейшего смешивания и немедленно вернуть его в C водяной бане 30 ° еще на 90 мин.
   * Примечание: Используйте 1 синий трубки в течение 5-6 реакций и 2 синих труб для 10-12 реакций.
4. Через 90 мин, развести в каждую пробирку 970 мкл SM буфера * (табл. 3), чтобы остановить реакцию и вихрь на средней скорости в течение 5 сек. Положите пробирки на лед до дальнейшего использования.
   * Примечание: если количество клеток ≤ 5 × 10 ^5, используйте 500 мкл SM буфер (табл. 3), чтобы остановить реакцию; 2 трубки (из того же образца) могут быть объединены позже (шаг 6.4).

6. Покрытие упаковке геномной ДНК (День 2; продолжение)

1. Закройте перевернутый агар тлучи, которые были открыты для сушки утром. Этикетка для лотков каждого образца.
2. Растворить 4,8 г Х-Gal в 16,8 мл N, N-диметилформамиде (необходимы для шаге 6.5). Движение сразу и поставить на платформе шейкера. Защитить от света. Решение должно быть ясно, в 20-30 мин.
3. Алиготе СКС-8 E. палочки клетки. Для каждого набора лотков *, используют один 50 мл коническую трубку. Этикетка трубки с именем упакованного образца ДНК. Добавить 2 мл Е. палочка подвеска для каждого лотка.
   * Примечание: Например 3 х 10 ⁵ ГМР требует набора 8 лотков (см. таблицу 1). Таким образом, две аликвоты, требуют 8 х 2 = 16 лотков. Держите аликвоты отделить и таким образом подготовить два 50 мл пробирки, с каждым 8 х 2 = 16 мл Е. палочка подвеска.
4. Добавьте 1 мл * упакованных образца ДНК (со стадии 5.4) к соответствующему 50 мл пробирку с СКС-8 E. палочка Аликвота и хорошо перемешать. Выдержите эту E. палочка / фаг смесь дрожащим INCUБатор (250-300 оборотов в минуту), при 37 ° С в течение 23 мин.
   * Примечание: Если ДНК экстрагировали из ≤ 5 × 10 ⁵ клеток 500 мкл буфера SM был использован для остановки реакции (этап 5.4). На этом этапе, трубы могут быть объединены и добавлены к одной 50 мл коническую пробирку.
5. Когда Е. палочка / фаг смесь инкубации, начать подготовку к верхней слой агарозы. Добавить 5 мл X-гал / N, N-диметилформамида раствор (шаг 6.2) к каждому 800 мл колбу верхнего слоя раствора агарозы (со стадии 3.1.2; выдерживают при 50 ° C). Конечная концентрация Х-Gal будет 1,5 мг / мл. X-гал может вызвать немного при добавлении к агарозы. Вихревой распустить X-гал и поставил бутылку на водяной бане 50 ° C.
6. Возьмите Е. палочка / фаг смесь из инкубатора (шаг 6.4). Каждый образец требует нескольких лотков, каждый лоток, требуется 50 мл X-gal/agarose решения (шаг 6.5). Налейте необходимый объем X-gal/agarose для каждого образца (то есть 50 мл хколичество лотков) в большем стерильной пластиковой бутылки и добавить соответствующую E. палочка / фаг смесь. Вихревой бутылку смешивать. Разделить смесь в аликвотам 45-50 мл в 50 мл конические пробирки. Количество трубок должен быть таким же, как количество лотков, необходимых для этого образца.
   Примечание: остаток раствор X-gal/agarose будут использоваться на этапе 8.3. Раствор можно хранить в водяной бане при 50 ° до дальнейшего использования.
7. Вылейте 50 мл верхней агарозном смеси в нижней половине лоток анализа. Быстро распространился агарозы слегка наклоняя лоток анализа в одном направлении.
   Примечание: агарозы остынет очень быстро и станет невозможно разложить на подносе. Таким образом, этот шаг должен быть выполнен относительно быстро и с агарозой, который сохраняется при 50 ° С
8. Разрешить лучших агарозы затвердеть в течение не менее 15 мин. Затем переверните и открыть лотки опробования, чтобы позволить им высохнуть на воздухе в течение 30 мин (рис. 3).
9. Закройте лотки, инкубировать лотки опробования перевернутые (нижний слой агара сторона сверху) при 37 ° С в течение 15-16 часов. Не ставьте более 5 лотков.

7. Определение частоты Предполагаемые Mutant (День 3)

1. Снимите лотки из 37 ° C инкубатора и дайте им остыть. Подсчитайте полупрозрачные, образующих единиц бляшек (PFU) на каждой тарелке; случайным образом выбрать 2 сайта на подносах, нарисовать квадрат * 2,5 х 2,5 см ² или 5 х 5 см ² и считать все Pfus в каждом квадрате с маркировкой клеток счетчика (4А, В).
   * Примечание: для рисования квадрата использовать устройство, как показано на рисунке 5. Если число подсчитанных блоков PFU является ≥ 40, используйте меньший квадрат, в противном случае использовать больше.
2. Возьмите среднее значение квадратов подсчитанных и умножить на 96, если отсчет с меньшего квадрата, или умножить это число на 24, если считая с большого. Добавить количество блоков PFU насчитал для всех лотков из самне попробовать. Это общее количество блоков PFU генерируется для этой выборки.
3. Далее, рассчитывать мутантные бляшек в каждом лотке. Лотки теперь остынет, который поможет найти мутантных бляшки. В целях дальнейшего содействия кровянистые выделения синие бляшки, переместите лоток над красной и / или белой поверхности; листы красного и белого бумаги хорошо работать. Круг какой-то синий табличка с маркером. Запишите форму и интенсивность синего цвета каждого мутанта (например, полный, круг, сектора; Рисунок 4C) ^36,37.
4. Определить предполагаемый мутантный частоту для каждого образца путем деления количества мутантного блоков PFU (этап 7.3) на общее количество блоков PFU (этап 7.2).

8. Проверка предполагаемого Mutant бляшек (День 3-5)

1. Использование пипетки Пастера ядро каждого мутанта (синий) PFU и передать вилку в 250 мкл стерильной буфера SM (табл. 3). Добавить 25 мкл хлороформ, вихря в течение 5 сек апд хранить при 4 ° С, чтобы продолжить на следующий день или оставить на 2 часа при комнатной температуре, прежде чем продолжить к следующему шагу, чтобы убедиться, что мутант PFU действительно мутант. Образцы можно хранить при температуре 4 ° С в течение не менее 1 года.
2. Этикетка один 1 мл и один 4 мл стерильной пробирке для каждого мутанта, который был подключен. В новом 1 мл пробирку, разбавить ресуспендировали фага выпущенный из агаровой пробки (этап 8.1) 1:50 в стерильном буфера SM (2 мкл образца в 100 мкл буфера SM (табл. 3)), вихревой кратко, отложить в сторону. К 4 мл стерильной трубки добавить 200 мкл СКС-8 E. палочка культура (с шагом 4,1) и 2 мкл разбавленного фага из соответствующего 1 мл трубки, инкубировать при 37 ° С в течение 5-10 мин.
3. Добавить 2,5 мл верхней агарозы, содержащей X-гал (слева с пункта 6.6) к каждому 4 мл трубки, вихревой трубки смешать и залить на 60-мм NZY агаром ранее налил (шаг 3.6). Оставьте на 10 мин (чтобы тон сверху агарозном укрепить), инвертировать блюдо и инкубировать O / N при 37 ° С
4. На следующее утро, снимите блюдо из инкубатора и определить долю синего блоков PFU на каждого блюда (рис. 6). Когда 70% или более блоков PFU синий, мутант считается подтвержденным ^38,39. Ядро мутант доска из чашки и положить в 1,5 мл с завинчивающейся крышкой трубки, содержащие 250 мкл SM буфер (табл. 3) и 25 мкл хлороформа; теперь он готов для секвенирования.
5. Когда 50% или менее от PFU синего цвета, то это не считается настоящим мутантом ^38,39. Когда частота голубой блоков PFU между 60-70%, зайдите с в примечаниях о форме бляшки; если форма ОРП был "полный", приступить к последовательности.

9. Секвенирование для мутации в LacI G ена

1. Настройка ПЦР реакции в реакционном объеме 25 мкл, в том числе 1,5 μ; Л супернатанта бляшек (шаблон, шаг 8,4), прямой праймер SF1 (5'-GGAAACGCCTGGTATCTT-3 ') и обратный праймер SR2 (5'-GCCAGTGAATCCGTAATCA-3'). Используйте полимеразной комплект ПЦР удлинитель Taq в соответствии с инструкциями изготовителя. Циклическую следующим образом: 94 ° С в течение 2 мин, затем 35 циклов при 94 ° С в течение 20 сек, 60 ° C в течение 20 сек, 72 ° С в течение 2 мин, а затем конечной стадии при 72 ° С в течение 5 мин .
2. Возьмем 5 мкл аликвоты каждой реакции и разгон ют на 0,8% агарозном геле, чтобы подтвердить амплификации.
3. Очистка реакции ПЦР с использованием очистки комплект Augencourt в соответствии с инструкциями изготовителя.
4. Количественного ДНК шаблона.
5. Использование ~ 100 нг продукта ПЦР в качестве матричной ДНК для секвенирования. Последовательность ампликонов в обоих направлениях с использованием тех же праймеров ПЦР в качестве праймеров секвенировани (см. выше).
6. Соберите последовательности и согласовать с эталонной последовательности LacI ⁴⁰ для обнаружения mutatiДополнения.

В естественных условиях мутагенеза анализе измеряют редкий случай (мутант Pfus) среди многих событий (все Pfus). По выполнением анализа с небольшим числом клеток, вполне возможно, что исход значительно зависит от ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Для решения этого вопроса мы провели серийный эксперимент разбавления с нефракционированных клеток костного мозга, собранных из трех различных животных. Мы измерили мутантный частоту в костном мозге этих животных с использованием 1,4 х 10 ^6, 7,0 х 10 ^5, 3,5 х 10 ^5, а 1,75 х 10 ⁵ клеток. Результаты (рис. 7) показывают линейную зависимость между числом клеток входного и количества PFU генерируется. Важно отметить, что мутант частота соответствует, является ли измеренный с низким или высоким числом клеток. Хотя непосредственно не проверял (из-за малого клеток), нет никаких оснований полагать, что это не относится к LSKs и ГИП.

Маркировка отдельных блоков PFU на подносе, показанной на рисунке 4В представляют разумный и достижимый плотность бляшек, когда один начинает с небольшим количеством очищенных клеток; лоток должен провести между 40-150 Pfus / небольшой площади. В данном конкретном эксперименте, небольшая площадь на фиг.4В содержит 103 бляшки. Другой квадрат на лоток, отображается в правом верхнем углу рисунке 4A содержится 111 Pfus. Эти два рассчитывает близко друг к другу (разница менее 10%), а если это не так, рассчитывать бляшки в 5 квадратов, выбранных произвольно на подносе, или повторить эксперимент, потому что изменение может быть связано с слишком мало бляшек на лоток. На этом примере лотка, общее количество блоков PFU является ([103 +111] / 2) х 96 = 10272 Pfus. Это число меньше, чем рекомендовано 12000 блоков PFU по другим ^41, потому что мы используем немного меньшие лотки и 12000 Pfus на этих лотков не позволили нам хорошую различие между индивидуальными бляшек.

Рисунок 4C показаны примеры различных типов голубых бляшек, которые можно наблюдать. В мутагенеза анализа LacI, морфология бляшек (т.е. полный, сектора или круг) является показателем происхождения мутации; полный мутация от мышиного происхождения, в то время как два других, вероятно, производится в Е. палочка ^36,37. По replating (см. лыо рис. 6), почти все "полные" бляшки не воспроизводить> 70% синих бляшек снова, в то время как лишь очень небольшая часть бляшек сектора делать и практически ни один из часто мелкие, круглые бляшки.

Таблица 2 показывает воспроизводимость образования бляшек с относительно небольшим числом очищенных клеток по сравнению с что с большим числом клеток костного мозга (то же пула клеток, где клетки были отсортированы с) и клеток селезенки.

Мутант Pfus подтвердятся, сначала replating (Рисунок 6 показывает характерные примеры блюд для подтверждения первичного мутанта (синий) Pfus) и, во-вторых, путем секвенирования. Блюда на рисунке 6, содержащие> 70% синих Pfus (нижняя два) подтвердить, что мутант возникла в мыши (а не в кишечной палочки). Тем не менее, в верхнем левом блюдо не показывает синие Pfus и, следовательно, основным PFU не должны учитываться как мутант и sequencing не надо. Право блюдо показывает ~ 65% синих Pfus. В зависимости от формы первичного бляшки, этот образец будет разослан для секвенирования (см. шаг 8.4). Только если мутации ДНК может быть подтверждена секвенированием это будет PFU считаться мутанта. Если вы не уверены о форме ОРП, последовательность!

Рисунок 1. SCA-1 окрашивание на клетках костного мозга от дикого типа C57BL6 мышей (B6), трансгенных мышей Лачи (LacI) и потомства на помесь этих двух клеток (В6 х LacI). Костном мозге мышей В6 выразить SCA- 1 на своей клеточной поверхности и этой характеристики используется для очистки стволовых предшественников и клеток. Трансгенные Лачи мыши на B6 фоне, однако, не выражают SCA-1; этот маркер должен быть потеряны белыйИль установления колонию. Чтобы вновь SCA-1 в трансгенных мышей Лачи, эти мыши были скрещены с регулярными мышей В6.

Рисунок 2. Диализ система ДНК. Три мембраны проведение вязкий раствор ДНК в центре (синего цвета для лучшей визуализации) плывут по ТЕ-буфера. Красные стрелки показывают небольшие зарубки в мембране, которые используются для идентификации образца.

Рисунок 3. Эффективный способ высушить 60 или более агар / агарозные содержащие лотков.

gether.within страницах = "всегда">
Рисунок 4. Обнаружение бляшкообразующих единиц (Pfus). Изображенный являются (части) больших чашках с лотков (изображенных на рисунке 3) с первичными колоний фага-инфицированных E. палочка. (А) Показаны является одним вся пластина с 2 маленькими квадратами нарисованных на нем для подсчета бляшек. Красный вкладыш показан в увеличенном виде (В). (B) Каждый человек черный маркер точка указывает на четкую дикого типа PFU в агаром (103 в общей сложности). (C) Различные формы потенциально мутантных блоков PFU. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

s/ftp_upload/50752/50752fig5highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/50752/50752fig5.jpg "/>
Рисунок 5. Считая Оргстекло квадратов., Изображенные являются малые и большие счета квадрат. Внутренние измерения большой площади равны 5 см х 5 см, что из небольшой площади 2,5 см х 2,5 см.

Рисунок 6. Подтверждение мутантных образующих единиц налета (Pfus). Показаны 4 маленькие блюда прививку накануне с разбавителем голубого PFU. Верхний левый блюдо не показывает синие Pfus. В правом верхнем блюдо показывает ~ 65% синих Pfus. Два нижних лотков показать 80-90% синие Pfus (слева) и 100% голубые Pfus (справа). Красные стрелки показывают ясно (дикого типа) Pfus.

повторно 7 "FO: контент-ширины =" 4 дюйма "FO: Пребывание" / files/ftp_upload/50752/50752fig7highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50752/50752fig7.jpg "/>
На рисунке 7. Мутант частота в нефракционированного костного мозга. Изображенный являются (A) количество блоков PFU, (B) количество мутантов и (C) мутант частота, измеряемая в трех различных животных (24-26 месяцев), которые представлены разными цветами. Для каждой мыши, измерения проводились на четырех различных размеров выборки: 1,4 х 10 ^6, 7,0 х 10 ^5, 3,5 х 10 ^5, а 1,75 х 10 ⁵ клеток. Данные показывают, что в пределах этого диапазона ячеек, размер выборки не оказывает существенного влияния измерения мутантные частот.

ИнжирЮр 8. импульсно-поле электрофорез проб с высокой молекулярной массы ДНК, выделенной из очищенных клеток. геномную ДНК выделяли, как описано в стадии 2 протокола и работать на Bio-Rad (CHEF-DR III) системы. Различные образцы, загруженные на геле образцы ДНК, выделенные из печени (Li; полоса 1), клетки костного мозга, истощенные по зрелом линии ⁺ клеток (LB; дорожки 2 и 14), CD34 ⁺ LSK клетки (L; дорожка 6), CMPS (полосы 7-9), GMPS (дорожки 11 и 12) и SCA-1 ⁺ клетки (S; переулок 15). Дорожка 4 держит лестницу для высокой молекулярной ДНК веса. На рисунке показано, что большинство из ДНК с высокой молекулярной массой (> 600 кб).

Таблица 1. Разное параметры выборки из очищенных населения, вся костного мозга и селезенки. Используйте эту таблицу, где указано в Протоколе. Для каждого население указано сверху, количество клеток (× 10 ⁵⁾ в аликвоте, время переваривание ДНК, объем пробы ДНКпосле диализа, число реакций, необходимых для каждой порции и количество лотков, необходимых на аликвоты указаны слева. Времена пищеварения при 50 ° С имеют решающее значение для успеха эксперимента.

ЛСК = Лин ^- SCA-1 ⁺ комплект ⁺ клеток ^+; CMP = привержены миелоидный прародитель; GMP = гранулоцитарного / моноцитарный предшественников; WBM = (несортированный) весь костный мозг. Клетки селезенки отсортированы.

Таблица 2. Эффективность образования бляшек сравнима среди различных клеточных популяций. Эта таблица показывает образование бляшек среди различных групп населения. Шесть месячных мыши C57BL / 6 были использованы для этих экспериментов (бедра и голени 10-11 мышей на эксперимент, 6 экспериментов в общей сложности). Все, кроме одного из популяций, используемых в этих экспериментах гаве по меньшей мере 1 до 24, (подтверждено) мутантный Pfus (Чжоу и др.., рукопись в стадии подготовки). Номера PFU может варьироваться в зависимости от линии мышей.

ЛСК = Лин ^- SCA-1 ⁺ комплект ⁺ клеток ^+; CMP = привержены миелоидный прародитель; GMP = гранулоцитарного / моноцитарный предшественников; WBM = (несортированный) весь костный мозг * Клетки селезенки не отсортированы.. SD = стандартное отклонение.

Таблица 3. Инструкции по подготовке дополнительных реагентов.

§ С Инструкции по эксплуатации Стратаген в изоляции Kit RecoverEase ДНК

¶ С Инструкции по эксплуатации Стратаген упаковочного экстракта Transpack

В естественных условиях мутагенеза описанный здесь анализ основан на LacI трансгенных мышах первоначально генерируемого Kohler и соавт. ¹⁸ Эта модель используетс λ вектор фага, несущего ген-репортер LĀČI. Два COS-сайты, фланкирующие вектор позволяют относительно простой и последующего восстановления упаковки в инфекционных фаговых частиц, использовали для инфицирования E. палочка. Синяя доска будет генерироваться фага-инфицированных E. палочка, содержащие мутантный ген Лачи. Синий налет на фоне бесцветного фона, тем самым значительно упрощая задачу мутанта скоринга. Методы секвенирования ДНК могут быть использованы для определения положения и тип мутации, которые произошли, которые могут помочь дальнейшие исследования в механизмах мутагенеза.

Изменения, которые мы сделали с протоколом этого мутагенеза анализа позволяют использовать его с СУИМ очищенного hematopoieтик клеточные популяции. Тем не менее, мы обнаружили, что воспроизводимый анализ по-прежнему требует не менее 2 х 10 ⁵ кроветворные клетки для обеспечения достаточного количества высококачественного ДНК. Поскольку частота долгосрочной перспективе заселения ГСК крайне низка ^29, выполняя анализ мутагенеза на этих ГСК в этот момент не достижимо. Ячейка обогащенный население стволовых мы используем в данном протоколе, ЛСК клетки, содержит в дополнение к Flk-2 ^- долгосрочные заселения ГСК, а также FLK-2 ^- краткосрочные заселения ГСК и Flk-2 ⁺ клеток, которые представляют мультипотентных прародителя клетки (МРР) ^42. Несмотря на это ограничение, мы считаем, что с помощью LSK клетки как чтения отъезда для ГСК в этом мутагенеза анализа является разумным, поскольку было показано, что LSK клетки ведут себя скорее как ЛСК-Flk-2 ^- ГСК с точки зрения использования NHEJ чем клеток-предшественников ^5. Кроме того, работа с Росси и соавт. ⁸ показывает, что MPPs лучше в копировании с damagред ДНК, чем ГСК, особенно когда они стареют, что приводит нас к гипотезе, что количество мутантов, найденных в популяции ЛСК отражает, что из ГСК, а не МРР.

Поскольку небольшое количество отсортированных клеток получаются при каждом эксперименте, важным вопросом для рассмотрения на стадии планирования этого в естественных условиях мутагенеза анализа, является размер выборки (т.е. общего количества бляшек на образец), необходимые для достижения статистической значимости. Другими словами, когда целью является, например, сравнить частоты мутаций модифицированных клеток LSK дикого типа управления LSK клеток, сколько бляшки в общей сложности требуется для каждой группы населения ЛСК обнаружить два или три-кратную разницу в Мутация частота? Следует отметить, что общее количество бляшек могут быть объединены со всех экспериментов, так как мы не обнаружили существенных различий между сортировки экспериментов, по крайней мере, в клетках дикого типа, на основе отрицательного биномиального регрессионного анализа ^43. Налет питБерс важно знать, потому что это будет определять количество сортов, которые должны быть выполнены (~ 10000 за РВО и ГИП и ~ 7000 для селезенки, LSKs и CMPS). Поскольку частоты мутаций малы по дикого типа тканей ^44, нормальное приближение статистически сравнивая их не является точным. По этой причине, мы используем распределение Пуассона, так как это приближает истинное биномиальное распределение (частоты мутаций), когда, что частота мала и размер выборки относительно большой; Хаффман ⁴⁵ предлагает формулу (Equation 4) для расчета размера выборки на основе на распределения Пуассона. При нанесении на гипотетических мутации частотах 2,5, 4 и 7 мутаций на 100000 клеток в контрольных клетках ^44, требуется 456949 язв, 285592 и 163196, соответственно, обнаруживают значительную двукратное различие (тестовый образец с два двухсторонний значение 0,05 и власти 0,80). Меньше бляшки обязаны обнаружить в три разаразница: 122 148; 76342 и 43624, соответственно. Таким образом, количество бляшек, необходимых для каждой группы населения интереса (и, таким образом количество видов, необходимых для получения достаточно клеток) зависит от частоты мутаций, что можно ожидать в популяции клеток управления и предсказанным раза-изменения в популяции сравнения.

Наиболее важным шагом в этом мутагенеза анализа является выделение геномной ДНК (этап 2). Хотя это важно начать этот протокол с образцами ДНК высокого качества (см. "репрезентативные результаты"), при работе с отсортированных клеток, число клеток часто ограничены и не могут быть потрачены на определении концентрации ДНК или размер. Мы обнаружили, что один хороший показатель для качества образца ДНК является ее вязкость; на шаге 2.9 образец должен быть чрезвычайно вязкой и трудно работать. Это требует некоторой практики, чтобы получить этот шаг вправо. Поэтому, рекомендуется выработать протокол с большим количеством клеток, например со всей костного мозга или отсортированных SCA-1 ⁺ клеток, и освоиться с выделения ДНК из этих образцов и научиться оценивать качество ДНК по его вязкости.

Качество и размер ДНК влияет на количество блоков PFU генерируется. Когда шаг выделения ДНК совершенствуется, следующий важный элемент оптимизации анализа является плотность блоков PFU за лоток. Таблица 1 показывает рекомендуемое число лотков использовать для каждого типа образца, соответствующего оптимальных количества клеток для этого образца. Используя эту директиву должно привести лотков, где отдельные бляшки еще можно выделить, но не распространяются слишком тонкая. Лоток должен провести между 40-120 блоков PFU на небольшой площади; пример, показанный на рисунке 4В представляет собой разумное плотность. С эти аспекты оптимизации разработаны, число блоков PFU генерируется на образец имеет высокую эффективность и воспроизводимость (табл. 2).

Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов.

Мы хотели бы поблагодарить Дэвида Р. Родригес, MA для графического дизайна и фотографии в этой рукописи. Эта работа была поддержана финансирование из GCCRI, в NIH / NIA (5R21AG033339) и онкологического центра поддержки Грант (P30CA054174) к UTHSCSA проточной цитометрии основной комплекс и UTHSCSA Расширенный нуклеиновые кислоты Основной фонда.