A identificação de DNA Mutações em Purificada-Tronco Hematopoéticas / células progenitoras

Descrevemos aqui um ensaio in vivo de mutagénese para pequenos números de células hematopoiéticas purificados utilizando o modelo de ratinho transgénico Lacl. O gene LacI pode ser isolado para determinar a frequência, a localização eo tipo de mutantes de DNA espontaneamente surgido ou após a exposição ao genotoxinas.

Nos últimos anos, tornou-se evidente que a instabilidade genômica é estreitamente relacionada com muitos transtornos do desenvolvimento, câncer e envelhecimento. Tendo em conta que as células-tronco são responsáveis ​​por garantir a homeostase e reparação tecidual ao longo da vida, é razoável supor que a população de células-tronco é fundamental para a preservação da integridade genômica dos tecidos. Portanto, o interesse significativo surgiu na avaliação do impacto de fatores endógenos e ambientais sobre a integridade genômica em células-tronco e seus descendentes, com o objetivo de compreender a etiologia das doenças com base em células-tronco.

Ratinhos transgénicos LacI transportar um vector de fago λ recuperável que codifica o sistema LacI repórter, em que o gene LacI serve como o repórter mutação. O resultado de um gene mutante LacI é a produção de β-galactosidase que cliva um substrato cromogénico, transformando-azul. O sistema repórter LacI é i realizadon todas as células, incluindo as células tronco / progenitoras e podem ser facilmente recuperados e usados ​​para infectar posteriormente E. coli. Após incubação de E. infectado coli em agarose que contém o substrato correcta, as placas podem ser marcados; placas azuis indicam um gene mutante LacI, enquanto placas claras porto de tipo selvagem. A freqüência de azul (entre limpar) placas indica a frequência de mutantes na população célula original do DNA foi extraído. Sequenciação do gene mutante LacI vai mostrar a localização das mutações no gene e o tipo de mutação.

O modelo de ratinho transgénico LacI está bem estabelecido como um ensaio de mutagénese in vivo. Além disso, os ratos e os reagentes para o ensaio estão disponíveis comercialmente. Aqui nós descrevemos em detalhes como este modelo pode ser adaptado para medir a freqüência de ocorrência espontânea mutantes de DNA em células-tronco enriquecido Lin ^- IL7R ^- Sca-1 ⁺ c-kit ^{+ +} (LSCélulas K) e outras subpopulações de o sistema hematopoiético.

Na maioria dos tecidos, células diferenciadas têm uma duração de vida limitada. Para manter a integridade funcional, células estaminais de tecidos específicos de longa duração produzir continuamente células progenitoras que, por sua vez dão origem às células totalmente diferenciadas requeridas para a função daquele tecido particular. As células-tronco também reabastecer seu próprio compartimento através de um processo chamado de auto-renovação. Assim, as células-tronco são responsáveis ​​por manter a integridade funcional do tecido eles residem dentro, portanto, é imperativo que eles são equipados com mecanismos robustos para detectar e potencialmente reparar o DNA danificado. Se não, eles podem adquirir múltiplas perturbações genômicos (potencialmente perigosos), que podem ser herdadas por seus descendentes. A compreensão de como as células-tronco salvaguardar seu genoma durante o tempo de vida de um organismo é uma questão importante e pode nos ajudar a entender por que a instabilidade genômica está relacionada com o câncer e outras doenças relacionadas com a idade (revisada em ^1,2).

Controlando integridade genómica de um tecido ao nível das células estaminais ou de populações de células progenitoras no início pode ser conseguida quer eliminando haste com defeito (ou progenitora) por meio de células de morte celular, senescência ou diferenciação e / ou por reparação eficiente ADN de danificado. Estudos recentes demonstraram que é possível medir a certos tipos de reparação do ADN directamente nestas populações raras ^3-6. Verificou-se que, por exemplo, no sistema hematopoiético, quebras duplas ADN cadeia pode ser reparada por recombinação homóloga (HR) ou a extremidade não-homóloga de união (NHEJ), sendo este último um processo de reparação de baixa fidelidade e, portanto, o aumento do risco de fazer erros. Ambos estão sendo utilizados em células estaminais hematopoiéticas (HSCs) ^{de 4,5,} no entanto, em murganhos, parece que é predominantemente NHEJ no HSCs enquanto que as células progenitoras iniciais utilizam RH ^4. Uma observação semelhante foi feita por células-tronco na pele ^6. Curiosamente, em humano HSCs HR, não NHEJ,parece ser o mecanismo de reparo de escolha para a vertente breaks duplos ^3. Se essa diferença funcional entre as duas espécies é real ou apenas representa uma diferença tecnológica ou experimental continua a ser visto.

Um repertório de células-tronco para reparar o DNA danificado é susceptível de incluir outros mecanismos de reparo do DNA, como a reparação por excisão de bases (BER), reparo por excisão de nucleotídeos (NER) e reparação incompatibilidade (MMR). BER e NER são responsáveis ​​pela reparação de lesões únicas ou múltiplas pares de bases no DNA fita simples, enquanto descasamentos correções MMR base-base e alças de inserção / exclusão; estes tipos de danos no DNA não pode ser reparado por NHEJ ou RH. Apoiando esta noção de diversos estudos do sistema hematopoiético que indicam uma ligação entre as alterações em uma destas vias e anormalidades no compartimento HSC ^7-9, bem como um risco aumentado de desenvolvimento de síndrome mielodisplásica ^10-16, uma doença que se origina naHSC e que está associada com o aumento da instabilidade genómica como a doença progride ^17. Até o momento, não foram relatados medidas de BER, NER e MMR diretamente em HSCs.

Além de elucidar os vários processos que controlam a integridade do tecido a um nível mecanístico, é imperativo para ser capaz de medir a extensão de ADN mutado, de modo que as consequências das aberrações em que um destes processos pode ser testada, por exemplo, normal versus geneticamente células-tronco modificadas ou no velho contra jovens. No entanto, o desenvolvimento de um ensaio relevante é difícil devido à escassez de células estaminais de tecidos específicos e a falta de condições de cultura que preserva "stemness". Além disso, um tal ensaio deve ser modificável para manipulações genéticas e ambientais. Uma possível solução para estas limitações e exigências é a utilização de modelos de rato, que são especificamente projectados para detectar mutações no DNA.

Mulmodelos de ratinhos transgénicos tiple para a detecção de mutações têm sido desenvolvidos. Por exemplo, o LACI ratinhos transgénicos ¹⁸ transportar um vector de fago λ recuperável que codifica o sistema LacI repórter, em que o gene codifica um supressor de LacI do operador Lac e serve como o repórter mutação. Após a mutação do gene LacI, o operador Lac é activado e β-galactosidase produzida. cliva β-galactosidase do substrato cromogénico X-gal (5-bromo-4-cloro-e-indolil-β-D-galactopiranósido), o que a torna azul. Os cos locais de acompanhamento do vetor LacI permite a recuperação fácil por proteínas do fago lambda e posterior infecção de E. coli. Após incubação de E. infectado coli em agarose que contém o substrato X-gal, as placas podem ser marcados. As placas azuis conter um mutante putativo Lac-I transportando fago, enquanto placas claras porto não mutantes. A freqüência de placas azuis (entre ªe as claras) indica que a frequência de mutação na população de células original é o DNA foi extraído a partir de. Além disso, o fago λ hospeda o alvo LacI pode ser facilmente sequenciada utilizando técnicas de PCR para análise relativamente alto rendimento. Seqüenciamento múltiplos genes mutantes LacI irá revelar informações importantes sobre o espectro de mutação, o que pode apontar para possíveis deficiências nas vias de reparo de DNA específicas ou eventos genotóxicos específicos. O sistema transgênico LacI foi padronizado em vários laboratórios ¹⁹ e os reagentes estão disponíveis comercialmente. Uma grande desvantagem do sistema LacI é a capacidade limitada para detectar grandes deleções ou rearranjos e, portanto, outros métodos, por exemplo, FISH multi-color em metáfase precisam ser usados ​​para complementar essa deficiência.

Dentro do vector de fago λ do modelo do rato LacI, existe um gene muito menor, CII, Disponível para análise de mutação. O seu tamanho e ao facto de que os mutantes podem ser seleccionados torna este um ensaio de trabalho intensivo e mais barato menos ²⁰ do que a análise do gene LacI. No entanto, o gene LacI está mais extensivamente estudado para a mutagénese ²¹ e a sensibilidade do gene de mutações foi bem caracterizada de modo a que existe um claro entendimento dos resíduos de aminoácidos que produzem uma resposta fenotípica sobre um substrato cromogênico ^22-25.

Outros modelos de ratinho para a detecção de mutações incluem a utilização do ΦX174 ou os transgenes LacZ. O modelo de camundongo transgênico ΦX174, com o Um original de: T → G: mutação reversão C ensaio ²⁶ ou no ensaio de mutação para a frente ^27, que permite a detecção de um espectro de substituição de pares de base, representa um sistema menos oneroso do que o modelo LacI. No entanto, a tela mutacional no ensaio para a frente não é trivial e a especificação mutaçãotro do transgene ΦX174 não é tão bem caracterizados como a do LACI. Em modelos de ratos portadores transgenes LacZ, o repórter mutacional LacZ é recuperado utilizando E. células hospedeiras de E. coli que são sensíveis à galactose e meio contendo galactose ^28. Uma desvantagem deste sistema é que a recuperação do alvo LacZ também envolve a digestão com endonuclease de restrição seguida por ligação e a electroporação de E. coli hospeda, tornando assim difícil para adaptar o sistema para um pequeno número de células. Embora não seja uma exigência absoluta para o trabalho com populações de células tronco / progenitoras (sempre se pode começar com mais ratos), se um grande número de células são necessárias (por exemplo, milhões ou mais) ele vai rapidamente tornar-se impraticável e de custo proibitivo. Além disso, o tamanho relativamente grande de LacZ, enquanto proporciona um repórter sensível mutacional, é pesado e mais dispendioso para a análise de sequência de ADN e determminação de espectros de mutações. Uma grande vantagem deste modelo no entanto, é a sua capacidade de detectar grandes deleções e inserções, bem como os rearranjos cromossómicos.

Uma vez que todas as células nos modelos de ratinho transgénicos LacI, LacZ ΦX174 e transportar o sistema repórter, qualquer destes modelos de rato pode ser utilizado para medir a mutagénese em qualquer tipo de células de interesse, incluindo as células estaminais e progenitoras, contanto que eles possam ser colhidos de forma fiável e em número suficiente. Porque nós tivemos uma vasta experiência com o modelo do rato LacI eo ensaio de mutação LacI, decidimos prosseguir este sistema ainda mais para a análise de mutagênese em tronco hematopoiéticas e populações progenitoras.

O tecido hematopoiético é bem caracterizada em termos de fenótipo da superfície celular de seus componentes individuais, incluindo repovoamento de células-tronco de longo prazo, que são identificáveis ​​como a população extremamente rara de Lin ^- IL7R ^{- Sca-1 + c-kit + + (LSK) / Flk2 - CD150 + CD48 - células 29. . Mohrin et al 4 demonstraram que o ligeiramente maior população de LSK/Flk2 - células ainda são bons representantes para HSCs e significativamente diferente do mais primitivo progenitor mielóide comprometido população (CMP), quando se trata de estudar o reparo do DNA. Além disso, quando o LSK HSC enriquecido (Flk-2 + e Flk-2 -), as células foram comparados com o Lin - IL7R - Sca-1-c-kit + + (células progenitoras LS-K), há ainda uma diferença significativa nas NHEJ capacidade 5 entre o menos puro, caule enriquecida com células população LSK e as células progenitoras. Em nosso estudo utilizamos HSC-enriquecido LSK (Flk-2 + e Flk-2 -) células porque descobrimos que pelo menos 2 x 10 5 células são necessários para resultados consistentes e confiáveis ​​neste ensaio mutagênese, o número de células é extremamente difícilobter quando se classifica a LSK/Flk2 - população CD150 + CD48 ou mesmo o LSK/Flk2 - população (em termos de ratos, custos e praticidade). Este protocolo, com base no originalmente desenvolvida por Kohler et al. 18 descreve em pormenor a forma como a frequência de mutação espontânea de ADN pode ser determinada em células LSK e populações de células mielóides diferenciados, bem como células de medula óssea e do baço não separada definida.}

Leucócitos de ratinhos transgénicos LacI num fundo de C57BL / 6 não expressam a Sca-1 (Figura 1). Portanto, se Sca-1 é um marcador utilizado para a purificação de células, estes ratos necessitam de ser cruzadas com uma estirpe apropriada para ganhar Sca-1 expressão; neste protocolo a F1 de um cruzamento entre ratinhos C57BL / 6 (B6) e ratinhos LacI regulares (C57BL / 6) ratinhos transgénicos (LacI), foi utilizado (Figura 1). Das populações de células utilizadas neste protocolo, LSKs e CMPs representam as menores populações na medula óssea. Para purificar pelo menos 2 x 10 ⁵ de cada / classificar, combinar a medula a partir de cerca de dez ratos quando a colheita da medula a partir de apenas as patas traseiras ou a partir de pelo menos quatro ratos quando também o hip-, pernas-frente, os ossos da coluna vertebral, esterno e são usadas.

Fazer suspensões de células isoladas a partir da medula óssea e do baço. Uma pequena proporção de medula óssea é usado como é, a maioria é usada para purify LSKs e células progenitoras mielóides diferenciadas, ou seja, CMPs e granulocítica / monocítica progenitores (BPF) pelas células ativadas por fluorescência (FACS). O isolamento de células de medula óssea e por FACS purificação dessas populações são descritos noutro ^30-32. Aproximadamente seis tipos independentes são necessários para identificar diferenças significativas nas freqüências de mutação entre as populações.

O protocolo a seguir para medir o in vivo a frequência de mutação espontânea em subpopulações hematopoiéticas purificadas é adaptado de vários manuais de instruções Stratagene ^33-35, com base na obra original de Kohler et al. ¹⁸ As diferenças mais importantes entre os protocolos existentes ^33-35 e este protocolo , necessária quando se utiliza um número relativamente pequeno de células, incluem diferenças nos volumes de reagentes e os tempos e as temperaturas utilizadas para proteinase K incubação.

1. Armazenamento Amostra

Depois de recolher as populações de células, as células desejadas alíquotas em tubos de centrífuga de 1 ml (para o número de células por aliquota, ver Tabela 1). Centrifugar a 266 xg durante 7 minutos, a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante cuidadosamente. Colocar os tubos em azoto líquido durante 5 minutos e depois transferi-los para um congelador a -80 ° C para posterior utilização. As amostras podem ser armazenadas durante pelo menos 6 meses.

2. Isolamento de ADN genómico

1. Tome as amostras do freezer -80 ° C. Adicionar 500 ul de tampão de lise de ADN gelado (Tabela 3) para o tubo de amostra. Vortex os tubos de 3-5 seg em velocidade média e coloque os tubos em gelo durante 10 min.
2. Centrifugar os tubos para 12 min, 4000 xg, 4 ° C. Cuidadosamente descarte ~ 450 ul do sobrenadante. Gire para baixo o tubo de 3-5 seg. Utilizar um tubo capilar de vidro para remover cuidadosamente o resto do sobrenadante. Secar as paredes internas de tele tubo até que não gotículas são mais visíveis (~ 2 min).
3. Adicionar 2 mL de RNace-A ribonuclease cocktail e 10 ul de DTT 1 M a 100 ul do tampão de digestão de DNA (Tabela 3). Ajustar o volume de acordo com o número de amostras que serão processados; é necessário 20 ul desta solução de digestão de ADN por amostra. Após a adição de 20 l de presente para o agregado de células, tente fazer a pelota se desprender do fundo, tocando suavemente o tubo com o dedo ou uma caneta.
   Nota: pode ser difícil ver o pellet devido a baixos números de células.
4. Adicionar 20 ul de solução de proteinase K * (Tabela 3) a cada amostra, muito bater suavemente tubo novo.
   * Nota: a solução de proteinase K deve ser aquecido num banho de água a 50 ° C, 2 min antes da sua utilização, a fim de activar a enzima.
5. Colocar imediatamente o tubo num banho de água a 50 C °. Digerir a amostra de acordo com as diretrizes Tabela 1. Toque no tubo muito suavemente a cada 10 min.
   Nota: Com estas pequenas quantidades de células, a temperatura do banho de água e os tempos de digestão são absolutamente crítico para a obtenção de sucesso de DNA genómico de qualidade elevada.
6. Prepare o sistema de diálise ADN na câmara fria (Figura 2). Verter 600 mL de tampão TE (Tabela 3) para uma proveta de vidro de 600 ml, adicionar uma pequena barra de agitação magnética de modo que o tampão pode ser agitada durante a diálise e deixar os 0,025 mm (tamanho dos poros) membranas de flutuar na superfície do tampão. Uma membrana por amostra; 1-4 membranas pode ser usada em um único recipiente de diálise. Faça uma marca na margem da membrana com uma tesoura para a identificação de cada amostra.
7. Após o tempo de digestão adequada, adicionar o ADN genómico agora muito viscoso * cuidadosamente para o centro da membrana flutuante (Figura 2). Cobrir o copo imediatamente com papel alumínio. Dialisar o ADN genómico, a 4 ° C durante ~ 16-20hr, misture delicadamente o buffer.
   * Nota: Quando se trabalha com soluções de DNA viscosos, use as pontas de pipeta com uma ampla abertura.
8. No dia seguinte, despeje 600 ml de tampão TE recentemente preparada (Tabela 3) a um copo de vidro limpo e transferir as membranas para o novo recipiente com uma colher com muito cuidado, e tapar com folha de alumínio. Dializar durante mais 2 horas.
9. Retirar a membrana de diálise, a partir do copo, com o tampão TE com uma colher e transferir apenas a "aglomeração" mais viscoso da solução de DNA de uma nova, estéril tubo de 1 ml. Armazenar a amostra a 4 ° C. Continuar o ensaio de mutagénese, no dia seguinte, ou até 1,5 meses mais tarde. Para as populações purificadas, espere pelo menos uma semana.

3. Preparação de bandejas para a E. coli / Phage Cultura (Dia 1)

Cada tabuleiro contém duas camadas diferentes, uma camada de agar na parte inferior e uma camada de agarose de topo que contém X-gal. A E.solução coli / fago será adicionada a esta última. O número eo tipo de células isoladas vai determinar quantas bandejas será necessária. Consulte a Tabela 1 para calcular o número de bandejas necessários e valores subseqüentes de soluções para esta parte do protocolo. A seguir irá gerar ~ 60 bandejas, o que uma pessoa experiente pode processar rapidamente.

1. Prepare as seguintes mídias:
   1. para a camada inferior, preparar 6 x 2 L com frascos, cada um contendo 1.600 ml de ddH ₂ O. Adicionar NZY em pó (21 g / l) e agar (15 g / L) e misturar bem.
   2. para a camada superior, preparar 4 x 1 L com frascos contendo cada um 800 ml de ddH ₂ O. Adicionar NZY em pó (21 g / L) e agarose (7,2 g / L) e misturar bem.
   3. para a cultura de E. coli, adicionar 2,5 g de pó de NZY a cada um de 2 x 250 ml de frascos e levar o volume a 100 ml com _ddH2O;
   4. para as bandejas de confirmação utilizados na etapa 8, adicionar 8,4 g de pó NZY e 6 g de agar para um balão de 1 L e levar o volume até 400 ml com ddH ₂ O.
2. Cobrir a abertura dos frascos com folha de alumínio. Misturar bem e autoclave los a 121 ° C, 15 psi durante 30 min.
3. Retire os frascos (muito quente!) Da autoclave. Agite cuidadosamente os frascos para misturar o agar e agarose, em seguida, colocá-los em um banho de água C 50 °. Quando o banho de água atingiu 50 ° C, de novo, a partir de despejar os dois frascos L (passo 3.1.1) ~ 150 ml de ágar NZY de cada bandeja (camada inferior).
4. Permitir que o agar solidifique em TA durante pelo menos 2 horas, em seguida, invertido e abrir as bandejas. Coloque o fundo dos tabuleiros na tampa, de 45 ° fora do centro (Figura 3) e deixar secar durante 30 min. Feche as bandejas e deixar O / N à temperatura ambiente.
5. Enquanto isso, prepare o SCS-8 E. cultura coli para o dia seguinte. A partir de um dos dois balões de 250 ml * (passo 3.1.3), ter 5 ml de caldo NZY (Tabela 3) e transferir para um estéril 14 ml tubo. Suplemento com 62,5 ul de maltose / _MgSO4 solução e adicionar 10 ml de SCS-8 E. estoque de glicerol coli. Incubar a 37 ° C durante 3-4 horas, agitando a 250-300 rpm. Utilizar 15 mL desta cultura para inocular 95 ml de caldo NZY (em um balão de arma 250 ml), a cultura O / N a 37 ° C numa incubadora com agitação (250-300 rpm).
   * Nota: o outro frasco de 250 ml, pode ser usado mais tarde, para ajustar a densidade óptica da cultura, se necessário (passo 4.1)
6. Pegue o frasco de 1 L com agar (passo 3.1.4), e despeje ~ 6-7 ml de agar NZY em 60 milímetros pratos (isso será suficiente para ~ 50 pratos, necessários para a etapa 8). Permitir agar para endurecer (~ 10 min), em seguida, inverter e embrulhe em plástico. Estes pratos podem ser mantidas a 4 ° C, durante até um mês.

4. Preparação de bandejas para a E. coli / Phage Cultura (Dia 2)

1. Verifique o OD do SCS-8 E. cultura coli (passo 3.5) no espectrofotómetro.Ajustar o OD _600-0,6 com caldo NZY (Tabela 3) (passo 3.1.3), e colocar o balão sobre gelo para parar o crescimento e manter em gelo até que esteja pronto para uso. Isso será usado para as etapas 6.3 e 8.2. Esta cultura pode ser mantido durante 5 dias a 4 ° C.
2. Ar seco todos os tabuleiros de ensaio (vertida no dia anterior) durante ~ 5 horas (Figura 3).

5. Embalagem de Genomic DNA (Dia 2; Continuação)

1. Pegue o número necessário de laranja Transpack tubos a -80 ° C congelador e colocá-los em gelo seco até que esteja pronto para uso, tomar um tubo Transpack laranja para cada reação de embalagens a serem realizadas. Rotular cada tubo adequadamente. Ter as amostras de DNA genômico (passo 2.9) pronto no gelo.
2. Este passo deve ser realizado um tubo no momento. Termine o passo completo antes de passar para a próxima amostra de DNA. Descongele um tubo laranja * ^{Nota 1} rapidamente: use os dedos até que a maior parte dele é descongelado, em seguida, colocarem gelo. Leve a amostra de DNA genômico correspondente e transferir imediatamente 8-12 mL de amostra * ^{nota 2,3} ao tubo laranja. Misture o conteúdo cuidado pipetando para cima e para baixo 3x, bem como ao tocar suavemente o tubo com o dedo. Tente não introduzir bolhas quando a mistura. Colocar o tubo num banho de água a 30 C ° durante 90 min.
   * Nota 1: um giro rápido em uma microcentrífuga pode ser necessário coletar todos os conteúdos das paredes internas e da tampa.
   * Nota 2: O volume da amostra adicionada depende do número de células usadas para gerar essa amostra: 11-12 ul de amostras preparadas 2,0-5,0 x 10 ⁵ células, 10 ul de 1,0 x 10 ⁶ amostras de células e 8 ul de 1,5 x 10 ^6-amostras de células.
   * Nota 3: O DNA é ainda viscosa, para levar o ADN para fora, empurra a ponta da pipeta para o fundo do tubo de amostra e cuidadosamente torcer em torno da ponta contra a parede interior do tubo.
3. Tome 1 ou 2 blue Transpack tubes * a -80 ° C congelador e colocá-los em gelo seco até à sua utilização. Descongelar los rapidamente e transferir 12 ul a cada um dos tubos de laranja. Misturar a solução cuidado pipetando para cima e para baixo 3 vezes. Gire o tubo para baixo por 2-3 segundos, em seguida, toque o tubo com o dedo para uma maior mistura e imediatamente devolvê-lo ao C banho de água a 30 ° por mais 90 min.
   * Nota: Use um tubo azul por 5-6 reações e 2 tubos azuis para 10-12 reações.
4. Depois de 90 min, diluir com tampão de cada reacção de 970 ul * SM (Tabela 3) para parar a reacção e vórtice na velocidade média de 5 seg. Coloque os tubos no gelo até à sua utilização.
   * Nota: se o número de células é ≤ 5 x 10 ^5, utilizar 500 ul de tampão SM (Tabela 3) para parar a reacção, dois tubos (de uma mesma amostra) pode então ser combinado mais tarde (passo 6.4).

6. Chapeamento Embalado Genomic DNA (Dia 2; Continuação)

1. Feche o ágar invertido traios que foram abertas para a secagem da manhã. Rotular as bandejas para cada amostra.
2. Dissolve-se 4,8 g de X-gal em 16,8 ml de N, N-dimetilformamida (necessário para o passo 6.5). Mexa e coloque imediatamente em uma plataforma shaker. Proteger contra a luz. A solução deve ser clara em 20-30 minutos.
3. Alíquota da SCS-8 E. células de E. coli. Para cada conjunto de bandejas *, use um tubo de 50 ml. Rotular o tubo com o nome da amostra de ADN empacotada. Adicionar 2 ml de E. coli suspensão por cada bandeja.
   * Nota: Por exemplo 3 x 10 ⁵ BPF requer um conjunto de 8 bandejas (ver Tabela 1). Assim, duas alíquotas, requerem 8 x 2 = 16 tabuleiros. Manter as alíquotas de separar e, assim, preparar dois tubos de 50 ml, com cada um de 8 x 2 = 16 ml de E. suspensão coli.
4. Adicionar a 1 ml de amostra de DNA * empacotado a partir do passo (5.4) para o tubo apropriado 50 ml contendo a SCS-8 E. alíquota coli e misture bem. Incubar este E. coli mistura / fago numa incu agitaçãobator (250-300 rpm), a 37 ° C durante 23 min.
   * Nota: Se o DNA foi extraído a partir de ≤ 5 x 10 ⁵ células, 500 ul de tampão SM foi utilizado para parar a reacção (passo 5.4). Neste passo, os tubos podem ser combinadas e adicionadas a um tubo de 50 ml.
5. Quando a E. mistura coli / fago está incubando, iniciar os preparativos para a camada de agarose topo. Adicionar 5 ml de X-gal / N, a solução de N-dimetilformamida (passo 6.2) a cada frasco de 800 ml de solução de topo da camada de agarose (a partir do passo 3.1.2, mantida a 50 ° C). A concentração final de X-gal, será de 1,5 mg / ml. O X-gal pode precipitar uma pequena quando adicionado à agarose. Agite para dissolver o X-gal e colocou a garrafa de volta no banho de água a 50 ° C.
6. Leve o E. mistura coli / fago fora da incubadora (passo 6.4). Cada amostra requer várias bandejas; cada bandeja, requer 50 ml de solução X-gal/agarose (passo 6.5). Verter o volume necessário de X-gal/agarose para cada amostra (isto é, 50 ml xnúmero de tabuleiros) de uma garrafa de plástico estéril e adicionar a maior E. apropriada coli mistura / fago. Agitar o frasco para misturar. Divida a mistura em alíquotas de 45-50 ml em tubos de 50 ml cônico. O número de tubos deve ser o mesmo que o número de tabuleiros necessários para essa amostra.
   Nota: A solução X-gal/agarose residual será usado no passo 8.3. A solução pode ser armazenada em um banho de água a 50 ° C até à sua utilização.
7. Despeje 50 ml de topo mistura agarose através da metade inferior do tabuleiro de ensaio. Espalhou-se rapidamente a agarose, inclinando o tabuleiro de ensaio ligeiramente em uma direção.
   Nota: a agarose vai esfriar muito rapidamente e se tornará impossível a espalhar-se sobre a bandeja. Portanto, este passo deve ser realizado relativamente rápido e com agarose, que foi mantida a 50 ° C.
8. Permitir que a parte superior de agarose a endurecer durante pelo menos 15 min. Em seguida, inverter e abrir os tabuleiros de ensaio para os deixar secar ao ar durante 30 minutos (Figura 3).
9. Feche os tabuleiros, incuba-se as bandejas de ensaio invertido (lado da camada de fundo de agar no topo), a 37 ° C durante 15-16 horas. Não empilhar mais de 5 bandejas.

7. Determinação de uma frequência putativo Mutant (dia 3)

1. Remova as bandejas a partir do 37 ° C incubadora e deixá-los esfriar. Contagem das unidades formadoras de placas translúcidas (UFP) em cada bandeja; selecionar aleatoriamente 2 locais nas bandejas, desenhe um quadrado * de 2,5 x 2,5 cm ² ou 5 x 5 cm ² e contar toda a PFUs em cada quadrado com um contador de células marcação (Figura 4A, B).
   * Nota: Para desenhar o uso quadrado um dispositivo como mostrado na Figura 5. Se o número de contados PFUs é ≥ 40, utilize o quadrado menor, caso contrário, use o maior.
2. Tire a média dos quadrados contados e multiplicar por 96, se contar com um quadrado menor, ou multiplicar esse número por 24, se contar com o grande. Adicione o número de PFUs contadas para todas as bandejas a partir do same provar. Este é o número total de PFU gerado por essa amostra.
3. Em seguida, contar as placas mutantes em cada bandeja. As bandejas já arrefecido, o que ajudará a localizar as placas mutantes. Para facilitar ainda mais a manchar as placas azuis, mova a bandeja sobre uma superfície vermelha e / ou branca; folhas de papel vermelho e branco funcionam bem. Circule qualquer placa azul com uma caneta marcador. Gravar a forma e intensidade da cor azul de cada mutante (por exemplo cheio, círculo, o sector e a figura 4C) ^36,37.
4. Determinar a frequência de mutação putativa para cada amostra dividindo o número de mutantes PFUs (passo 7.3), por o número total de PFU (passo 7.2).

8. Verificação de putativo Mutant Placas (dia 3-5)

1. Usando uma pipeta Pasteur, núcleo de cada mutante (azul) UFP e transferir o plugue em 250 mL de tampão SM estéril (Tabela 3). Adicionar 25 ul de clorofórmio, de vórtice durante 5 segundos umaarmazenamento d a 4 ° C para continuar no dia seguinte ou deixar durante 2 horas à temperatura ambiente antes de continuar com o próximo passo, para verificar que o mutante UFP é de facto um mutante. As amostras podem ser armazenadas a 4 ° C durante pelo menos 1 ano.
2. Rotular um 1 ml e um tubo 4 ml estéril para cada mutante que estava ligado. No novo tubo de 1 ml, diluir a fagos ressuspensos libertado do tampão de agar (passo 8.1) 1:50 em tampão SM estéril (2 ul de tampão de amostra em 100 ul de SM (Tabela 3)), vortex brevemente, anular. Para os 4 ml tubo estéril adicionar 200 mL SCS-8 E. cultura coli (a partir do passo 4.1) e 2 ul de fago diluído a partir do correspondente tubo 1 ml, incubar a 37 ° C durante 5-10 min.
3. Adicionar 2,5 ml de agarose de topo contendo X-gal (da esquerda a partir do passo 6.6) a cada tubo 4 ml, tubo de redemoinho para misturar e derramar sobre uma 60 mm placa de ágar NZY previamente vazada (passo 3.6). Deixe por 10 min (para deixar tele topo de agarose solidificar), inverter o prato e incubar O / N a 37 ° C.
4. Na manhã seguinte, remover o prato da incubadora e determinar a proporção de azul PFUs em cada prato (Figura 6). Quando 70% ou mais do PFU são azuis, um mutante é considerada confirmada ^38,39. Núcleo placa mutante do prato e colocar em 1,5 ml parafuso top tube, contendo 250 ul de tampão SM (Tabela 3) e 25 mL de clorofórmio, que já está pronto para o seqüenciamento.
5. Quando 50% ou menos da UFP é azul, não é considerado um mutante ^38,39 reais. Quando a freqüência de azul PFUs está entre 60-70%, volte com nas notas sobre a forma da placa, se a forma da UFP foi "cheio", proceda com o sequenciamento.

9. Sequenciamento de Mutações no LacI G ene

1. Configure reações de PCR em um volume de reação de 25 mL, incluindo 1,5 μ; L de sobrenadante da placa (modelo, passo 8.4), o iniciador directo SF1 (5'-GGAAACGCCTGGTATCTT-3 ') e o SR2 iniciador reverso (5'-GCCAGTGAATCCGTAATCA-3'). Utilizar o kit de PCR da polimerase Taq extensor de acordo com as instruções do fabricante. As condições de amplificação são as seguintes: 94 ° C durante 2 min, depois 35 ciclos de 94 ° C durante 20 seg, 60 ° C durante 20 seg, 72 ° C durante 2 min, seguido por um passo final de 72 ° C durante 5 min .
2. Tomar uma aliquota de 5 ul de cada reacção e corrido num gel de agarose a 0,8%, para confirmar a amplificação.
3. Limpar as reacções de PCR utilizando o kit de limpeza Augencourt de acordo com as instruções do fabricante.
4. Quantificar DNA Modelo.
5. Use ~ 100 ng de produto de PCR como DNA molde para o seqüenciamento. Amplicões Sequência em ambos os sentidos, utilizando os mesmos iniciadores de PCR como os iniciadores de sequenciação (ver acima).
6. Montar seqüências e alinhar com a seqüência de referência LacI ⁴⁰ para detectar Mutations.

O ensaio de mutagênese vivo mede um evento raro (PFUs mutante), entre muitos eventos (todos PFUs). Ao realizar o ensaio com pequeno número de células, é possível que o resultado é consideravelmente influenciado por resultados falsos positivos e falsos negativos. Para abordar esta questão foi realizado um experimento de diluição em série com células da medula óssea não fraccionada, colhidas a partir de três animais diferentes. Medimos a frequência de mutantes na medula óssea destes animais com 1,4 x 10 ^6, 7,0 x 10 ^5, 3,5 x 10 ^5, e 1,75 x 10 ⁵ células. Os resultados (Figura 7) mostra uma relação linear entre o número de células de entrada e o número de UFP do gerado. É importante ressaltar que a freqüência mutante é consistente, se medido com baixas ou altas quantidades de células. Apesar de não ser diretamente testada (devido à escassez de células), não há razão para acreditar que este não é o caso para LSKs e BPF.

As marcas de PFUs individuais em uma bandeja mostrado na Figura 4B representam uma densidade razoável e alcançável de placas quando se começa com um pequeno número de células purificadas, uma bandeja deve conter entre 40-150 PFUs / pequena praça. Neste experimento particular, o pequeno quadrado na Figura 4B contém 103 placas. O outro quadrado sobre o tabuleiro, mostrado no canto superior da figura 4A continha 111 PFUs. Estes dois aspectos estão juntos (menos que 10% de diferença), se este não for o caso, contar as placas em 5 quadrados, desenhados de forma aleatória no tabuleiro, ou repetir a experiência, pois a variação pode ser devido a muito poucas placas em o tabuleiro. Nesta bandeja exemplo, o número total de PFU é ([103 111] / 2) x 96 = 10.272 PFUs. Esse número é menor do que o recomendado 12.000 PFUs por outros ^41, porque usamos bandejas ligeiramente menores e 12.000 PFUs sobre estas bandejas não permitiu uma boa distinção entre placas individuais.

A Figura 4C mostra exemplos dos diferentes tipos de placas azuis, que podem ser observados. No ensaio de mutagénese LacI, a morfologia das placas (isto é, integral, ou sector de círculo) é uma indicação da origem da mutação; completo é uma mutação de origem murina, enquanto que os outros dois são provavelmente produzido na E. coli ^36,37. Após repique (ver also Figura 6), quase todas as placas "cheio" reproduzir placas azuis> 70% de novo, enquanto que apenas uma parcela muito pequena das placas do setor e fazer praticamente nenhuma das muitas vezes menores, placas circulares.

A Tabela 2 apresenta a reprodutibilidade da formação de placa, com um número relativamente pequeno de células purificadas em relação a que com um número elevado de células da medula óssea (o mesmo pool de células em que as células foram separadas das) e células de baço.

PFUs Mutantes são confirmados, primeiro repique (Figura 6 mostra exemplos representativos de pratos para a confirmação do mutante primário (azul) PFUs) e, segundo, por seqüenciamento. Os pratos na Figura 6, contendo> 70% PFU azuis (dois inferior) confirmam que o mutante originado no rato (e não em E. coli). No entanto, o prato superior esquerdo não mostra PFUs azuis e, portanto, a UFP primário não devem ser contados como mutante e Sequencing não é necessário. O prato da direita mostra ~ 65% azuis PFUs. Dependendo da forma da placa primária, esta amostra será enviado para a sequenciação (ver passo 8.4). Só no caso de uma mutação no DNA pode ser confirmada por sequenciação será este UFP ser contado como mutante. Se não tiver certeza sobre a forma da UFP, seqüência!

Figura 1. Sca-1 coloração em células da medula óssea de camundongos selvagens C57BL6 (B6), camundongos transgênicos (LacI LacI) e os descendentes de um cruzamento entre estas duas células (B6 x LacI) de medula óssea. Dos camundongos B6 expressar Sca- 1 na sua superfície celular e esta característica é usado para purificar as células estaminais e progenitoras. Ratinhos transgénicos LacI sobre um fundo B6, no entanto, não expressam Sca-1, o marcador tem de ter-se perdido while que institui a colônia. Para reintroduzir Sca-1 em camundongos transgênicos LacI, esses ratos foram cruzados com camundongos B6 regulares.

Sistema de diálise Figura 2. DNA. Três membranas segurando uma solução de DNA viscoso no centro (de cor azul para melhor visualização) estão flutuando em tampão TE. As setas vermelhas indicam pequenos entalhes na membrana, os quais são utilizados para a identificação da amostra.

Figura 3. Eficiente forma de secar a 60 ou mais de agar / agarose contendo tabuleiros.

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Figura 4. Detecção de unidades formadoras de placas (PFU). Descrito são (em parte) de grandes tabuleiros de agar (representados na Figura 3), com as colónias primárias infectadas com o fago de E. coli. (A) É mostrado uma placa inteira com 2 pequenos quadrados desenhados sobre ele para a contagem de placas. A inserção de vermelho é mostrado ampliado em (B). (B) Cada indivíduo negro marcador ponto indica um UFP tipo selvagem claro na placa de ágar (103 no total). (C) As formas diferentes de PFUs potencialmente mutantes. Clique aqui para ver imagem ampliada.

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Figura 5. Plexiglas contando praças. Descritos são um pequeno e grande praça de contagem. As medições internas do quadrado grande são 5 cm x 5 cm, com o do pequeno quadrado 2,5 cm x 2,5 cm.

Figura 6. Confirmação de unidades formadoras de placas mutantes (PFUs). São mostrados quatro pequenos pratos inoculados no dia anterior, com um diluente de um UFP azul. O prato superior esquerdo não mostra PFUs azuis. O prato superior direito mostra ~ 65% azuis PFUs. As duas bandejas inferiores mostram 80-90% PFUs azuis (à esquerda) e 100% PFUs azuis (à direita). As setas vermelhas indicam clara (tipo selvagem) PFUs.

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Freqüência Figura 7. Mutant na medula óssea não fracionada. Descrito são (A) o número de PFUs, (B) o número de mutantes e (C) a freqüência mutante medido em três animais diferentes (24-26 meses de idade), que são representados por cores diferentes. Para cada ratinho, as medições foram realizadas em quatro diferentes tamanhos de amostra: 1,4 x 10 ^6, 7,0 x 10 ^5, 3,5 x 10 ^5, e 1,75 x 10 ⁵ células. Os dados mostram que, dentro deste intervalo de células, o tamanho da amostra não influencia significativamente as medições de freqüência mutantes.

Figoeletroforese ure 8. Pulsed-field de amostras de DNA de alto peso molecular isoladas de células purificadas. DNA genômico foi isolado como descrito na Etapa 2 do protocolo e executado em um sistema Bio-Rad (CHEF-DR III). As várias amostras carregadas sobre o gel de amostras de DNA são isoladas a partir de fígado (Li; pista 1), as células da medula óssea empobrecido da linhagem de células maduras ⁺ (LB; pistas 2 e 14), as células CD34 ⁺ LSK (L; pista 6), CMP (faixas 7-9), BPF (pistas 11 e 12) e Sca-1 ⁺ células (S; pista 15). A pista 4 contém a escada de DNA de alto peso molecular. O quadro mostra que a maioria do ADN é de elevado peso molecular (> 600 kb).

Tabela 1. Parâmetros das amostras diversas de populações purificadas, medula óssea e baço inteiro. Use esta tabela onde indicado no Protocolo. Para cada população indicado em cima, o número de células (x 10 ⁵⁾ por alíquota, tempo de digestão de ADN, o volume da amostra de DNAapós a diálise, o número de reacções necessárias para cada aliquota e número de tabuleiros requeridas por alíquota estão indicados à esquerda. Os tempos de digestão a 50 ° C, são críticos para o sucesso da experiência.

LSK = Lin ^- Sca-1 ⁺ células Kit ^{+ +;} CMP = progenitor mielóide comprometida; GMP = progenitor granulocítica / monocítica; WBM = (indiferenciados) toda medula óssea. Células do baço são indiferenciados.

Tabela 2. Eficiência de formação de placas é comparável entre os diferentes populações de células. Esta tabela mostra a formação da chapa entre as diferentes populações. Seis meses de idade C57BL / 6 machos foram utilizados para esses experimentos (fêmures e tíbias de ratos 10-11 por experimento, 6 experimentos no total). Todos com exceção de uma das populações usadas nestes experimentos gave pelo menos 1, até 24, (confirmado) PFUs mutante (Zhou et al., manuscrito em preparação). Números UFP pode variar por rato tensão.

LSK = Lin ^- Sca-1 ⁺ células Kit ^{+ +;} CMP = progenitor mielóide comprometida; GMP = progenitor granulocítica / monocítica; WBM = (indiferenciados) de medula óssea todo * células do baço são indiferenciados.. DP = desvio padrão.

Tabela 3. As instruções para a preparação de reagentes adicionais.

§ A partir do Manual de Instruções Stratagene do Kit de isolamento de DNA RecoverEase

¶ A partir do Manual de Instruções Stratagene do Extrato Embalagem Transpack

O ensaio de mutagénese in vivo aqui descrita baseia-se no modelo de ratinho transgénico LacI originalmente gerado por ¹⁸ Kohler et al. Este modelo utiliza um vector de fago λ portador de um gene repórter de lacl. Os dois sítios cos do vector que flanqueiam permitir uma recuperação relativamente simples e subsequente empacotamento em partículas de fago infecciosas, utilizados para infectar E. coli. Uma placa azul será gerado por infectadas com fago E. coli que contêm um gene mutante LacI. A placa azul é contra um fundo incolor, assim simplificando enormemente a tarefa de marcar um gol mutante. Técnicas de sequenciação de ADN pode ser utilizada para identificar a posição e tipo de mutação que ocorreu, o que pode ajudar a investigações adicionais sobre os mecanismos subjacentes a mutagénese.

As modificações que fizemos com o protocolo deste ensaio mutagênese permitem usá-lo com hematopoie FACS-purificadapopulações de células de tiques. No entanto, verificou-se que uma análise reprodutível ainda requer pelo menos 2 x 10 ⁵ células hematopoiéticas para assegurar uma quantidade suficiente de ADN de alta qualidade. Como a freqüência de longo prazo repovoamento HSCs é extremamente baixo ^29, realizando uma análise sobre estes mutagênese HSCs É neste ponto não alcançável. A população enriquecida em células-tronco que usamos neste protocolo, as células LSK, contém, além de Flk-2 ^- a longo prazo repovoamento HSCs, também FLK-2 ^- de curto prazo HSCs repovoamento e células Flk-2 ^+, que representam progenitor multipotential células (PPMP) ^42. Apesar desta limitação, sentimos que usando células LSK como uma leitura para HSCs neste ensaio mutagénese é razoável, uma vez que foi demonstrado que as células LSK se comportam mais como LSK-Flk-2 ^- HSCs em termos de utilização de NHEJ de células progenitoras ^5. Além disso, o trabalho de Rossi et al. ⁸ sugere que MPPs são melhores em cópia com DAMAGed DNA de HSCs, especialmente quando eles envelhecem, levando-nos a supor que o número de mutantes encontrados na população LSK reflete a do HSCs em vez dos MPPs.

Desde pequeno número de células classificadas são obtidas em cada experimento, uma questão importante a considerar na fase de planeamento deste ensaio mutagênese in vivo, é o tamanho da amostra (ou seja, o número total de placas por amostra) necessário para alcançar significância estatística. Em outras palavras, quando o objectivo é, por exemplo, comparar a frequência de mutação de células manipuladas para LSK de tipo selvagem de células de controlo LSK, quantas placas no total são necessários para cada população LSK para detectar uma diferença de duas ou três vezes na frequência de mutação? De notar que o número total de placas podem ser combinados de todos os experimentos, uma vez que não houve diferença significativa entre os experimentos de classificação, pelo menos em células do tipo selvagem, com base em uma análise de regressão binomial negativa ^43. Plaque númebros são importantes para saber, porque isso vai determinar o número de tipos que precisam ser executadas (~ 10.000 para WBM e BPF e ~ 7.000 para Spleen, LSKs e CMPs). Desde as frequências de mutação são pequenos em tecidos do tipo selvagem ^44, a aproximação normal comparando estatisticamente estes não é preciso. Por esta razão, usamos a distribuição de Poisson, uma vez que se aproxima da verdadeira distribuição binomial (da frequência de mutação), quando essa frequência é pequeno eo tamanho da amostra é relativamente grande; Huffman ⁴⁵ fornece uma fórmula (Equação 4) para calcular o tamanho da amostra com base sobre a distribuição de Poisson. Quando aplicado a freqüências hipotéticas de mutação de 2,5, 4 e 7 mutações por 100.000 células nas células de controle ^44, exigimos 456.949 pragas, 285592 e 163196, respectivamente, para detectar uma diferença de duas vezes significativa (teste de duas amostras com dois importância atada de 0,05 e um poder de 0,80). Menos placas são necessários para a detecção de uma três vezesdiferença: 122148; 76.342 e 43.624, respectivamente. Assim, o número de placas necessárias para cada população de interesse (e, portanto, o número de tipos necessários para obter células suficientes) depende da frequência de mutação que pode ser esperado na população de células de controlo e o previsto dobra-mudança na população de controlo.

O passo mais importante neste ensaio de mutagénese é o isolamento de ADN genómico (passo 2). Embora seja essencial para iniciar este protocolo com amostras de DNA de alta qualidade (ver "resultados representativos"), ao trabalhar com células classificadas, números de celular são muitas vezes limitadas e não podem ser desperdiçados em determinar a concentração ou o tamanho do DNA. Descobrimos que um bom indicador da qualidade da amostra de ADN é a sua viscosidade; no passo 2.9, a amostra deve ser extremamente viscosa e difícil de trabalhar com ele. Ele requer um pouco de prática para obter este direito passo. Portanto, recomenda-se a trabalhar fora do protocolo com o número de células grandes, por exemplo, com medula óssea ou células todo ordenados Sca-1 ^+, e se sentir confortável com o isolamento de DNA a partir dessas amostras e aprender a julgar a qualidade do DNA por sua viscosidade.

A qualidade e tamanho do ADN afecta o número de PFU gerado. Quando o passo de isolamento de ADN é aperfeiçoado, o próximo elemento importante da optimização do ensaio é a densidade de PFU por tabuleiro. Tabela 1 mostra o número de tabuleiros recomendado utilizar, para cada tipo de amostra que corresponde a um número óptimo de células por essa amostra. Usando essa diretriz deve resultar em bandejas onde as placas individuais ainda podem ser distinguidos, ainda não se espalham muito fino. Uma bandeja deve conter entre 40-120 PFU por pequenos quadrados, o exemplo mostrado na Figura 4B representa uma densidade razoável. Com estes aspectos optimização funcionou, o número de PFU gerado por amostra é altamente eficiente e reprodutível (Tabela 2).

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Gostaríamos de agradecer a David R. Rodriguez, MA para o design gráfico e fotografia neste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do GCCRI, o NIH / NIA (5R21AG033339) eo Apoio Grant Cancer Center (P30CA054174) à facilidade UTHSCSA Citometria de Fluxo Core e da Facilidade UTHSCSA avançada Ácidos Nucleicos Core.