Method Article
Аутофагия вездесущий процесс, который позволяет клеткам деградировать и переработку белков и органелл. Мы применяем передовые флуоресцентной микроскопии для визуализации и количественной небольшой, но существенный, физические изменения, связанные с индукцией аутофагии, в том числе формирование и распределение аутофагосом и лизосом, и их слияние в autolysosomes.
Рак предстательной железы является ведущей формой злокачественных новообразований среди мужчин в США, а операция несет в себе существенный риск импотенция и недержание мочи, традиционные химиотерапевтические подходы были в значительной степени неудачны. Гормональная терапия является эффективным на ранней стадии, но часто не с возможным развитием гормонорефрактерный опухолей. Мы были заинтересованы в разработке терапии, ориентированные на конкретные метаболические дефицита опухолевых клеток. Недавно мы показали, что клетки опухоли простаты в частности отсутствие фермента (argininosuccinate синтазы или АСС), участвующих в синтезе аминокислоты аргинина 1. Это состояние приводит к опухолевым клеткам, чтобы стать зависимыми от экзогенных аргинин, и они подвергаются метаболическому стрессу, когда свободного аргинина исчерпывается аргинин deiminase (ДСП) 1,10. Действительно, мы показали, что человеческие клетки рака простаты CWR22 Rv1 эффективно убит ADI с каспазы-независимого апоптоза и агрессивных autophaГр (или макроаутофагии) 1,2,3. Аутофагия эволюционно-консервативный процесс, который позволяет клеткам усваивать нежелательных белков лизосомальными пробоя при питании 4,5 голода. Хотя основные компоненты этого пути хорошо характеризуется 6,7,8,9, многие аспекты молекулярного механизма до сих пор неясны - в частности, какова роль аутофагии в смерти-ответ клеток рака простаты после лечения ADI ? Для того, чтобы ответить на этот вопрос, мы потребовали экспериментального метода для измерения уровня и степени аутофагической ответа в клетках - и так как нет никаких известных молекулярных маркеров, которые могут точно отслеживать этот процесс, мы решили развивать изображений подход, используя количественной флуоресцентной микроскопии 3D 11,12.
Использование CWR22Rv1 клеток, специфически-меченных флуоресцентными зондами для аутофагосомы и лизосом, мы показываем, что 3D-изображение, полученное стеки либо с Widefield деконволюцией микроскопии (а позднее, с супер-разрешения, структурированное освещения микроскопия) может четко захватить на ранних стадиях аутофагию индукции. С помощью коммерчески доступных цифровых приложений анализа изображений, мы можем легко получить статистическую информацию о аутофагосом лизосом и количество, размер, распределение и степень колокализации из любого отображаемого клетки. Эта информация позволяет нам точно отслеживать прогресс аутофагию в живых клетках и позволяет нашим продолжение расследования роли аутофагию в химиотерапии рака.
1. Часть 1: Культура клеток и иммуно-флуоресцентное мечение
2. Часть 2: Подготовка Клетки для живых изображений
3. Часть 3: Деконволюция микроскопии и анализа
Протокол в этом разделе предполагается использование DeltaVision Личная деконволюцией DV микроскопом и связанных с ними приложений Softworx (прикладная точность, Inc, штат Вашингтон).
4. Часть 4: супер-разрешения, структурированное освещения (OMX) микроскопии
Протокол в этом разделе относится к использованию OMX Структурированные микроскоп освещению (прикладная точность, штат Вашингтон).
Изображение последовательности, показанной на рисунке 1 показывает физические изменения, которые происходят в CWR22 клетки в течение первых 80 мин аутофагия индукции. В этом и других исследованиях (не показано) мы последовательно наблюдается: (1) смещением ядра от центра ячейки, (2) снижение адгезии координационные центры, а также (3) Общий транслокации аутофагосом и лизосом к центру клетке. Кроме того, мы также наблюдали небольшое увеличение колокализации (отмечены желтым) между аутофагосомы (зеленый) и лизосом (красный), в более поздние моменты времени.
В качестве демонстрации на основе образа цитометрии, мы использовали Volocity Digital Imaging приложений (версия 6.0, импровизация / Perkin-Elmer), чтобы определить, соперника, собирать статистические данные о меченых аутофагосомы и лизосом в образах CWR22 клетки показано на Рисунок 1. Как показано на графиках на рисунке 2, количества и размера тОн аутофагосом (после их первоначального формирования и внешний вид) действительно изменяются со временем: после 80 мин аутофагии индукции, был постепенным, но чистое уменьшение числа аутофагосом (рис. 2А) с соответствующим увеличением среднего размера аутофагосомы ( Фиг.2В). Кроме того, было измеримое увеличение колокализации аутофагосомы и лизосом, на основе корреляции Пирсона Коэффициент анализа (рис. 2С). Вместе взятые, эти результаты говорят о том, что после стимуляции аутофагии, многочисленные мелкие аутофагосомы сливаются, образуя большие аутофагосомы с течением времени (рис. 2D). В то время как 1 и 2 отражает результаты только одного исследования изображений, и более строгий количественный анализ будет необходимо провести четкую заключение он иллюстрируют особенности и преимущества количественной флуоресцентной микроскопии. Мы активно используют эту технику в НУR продолжает исследование молекулярного механизма и процесс клеточной аутофагии.
3А показывает бок-о-бок сравнения изображений, полученных и реконструированный в режиме DV (имитация широкопольных деконволюцией, слева) и структурированный освещения режиме с помощью микроскопа OMX (справа). Боковые резолюции улучшилось до 120 нм, что вдвое превышает разрешение обычных дифракционной микроскопии 14,15. Малые колокализации аутофагосом и лизосом (рис. 3В, отмечены стрелками), были очевидны с супер-разрешения микроскопа, тогда как они были едва заметной с обычной флуоресцентной микроскопии.
Одним из преимуществ использования Деконволюция микроскопия является реконструкция всех изображений в 3D-модель, которая покажет более точную пространственную информацию между различными молекулами. Movie 1 показывает общую картину CWR22 Rv1 клетки undergoiнг аутофагию на более позднем этапе, где значительное количество колокализации между аутофагосом лизосом и начинают происходить. E-кадгерина окрашивания (как указано в белый цвет) показывает контур клетки-мишени. В кино 2, 3D реконструированного модель обеспечивает более пространственный детали слияния между аутофагосомы и лизосом (как указано в желтый цвет). Мы ясно видим, взаимодействие между зелеными LC3 сигналы и сигналы красного Лизосома, и слияние двух сигналов для получения желтого сигналов.
Рисунок 1. Time-Lapse изображения CWR22 Rv1 клетки, обработанные ADI. Изображение показывает последовательность CWR22 Rv1 клетки, обработанные ADI в течение 80 мин. (2D изображения, полученные с оригинальных стеки изображение максимальной проекцией Z). WHITE пунктирная линия представляет контур ячейки, и свет-заштрихованная область представляет положение ядра.
Рисунок 2. Статистического анализа. Статистические тенденции были извлечены путем анализа последовательности изображений показано на рисунке 1 в качестве демонстрации того, что данные изображения количественно. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 3. Аутофагосом и лизосомы распределение в клетке. А. Top) Бок о бок Сравнение изображений, полученных и реконструированный в режиме DV (имитация широкопольных деконволюцией, слева) и структурированный освещения режиме с помощью микроскопа OMX (справа). Шкала бар представляет 5 мкм. B. Внизу) Малые колокализации аутофагосом и лизосом (указаны стрелками).
Фильм 1 и Фильм 2. 3D-реконструкция CWR22 Rv1 Сотовые Проходят Аутофагия. Этот фильм иллюстрирует нормальную индукцию аутофагии после лечения ADI. Z-Stack изображения были реконструированы в 3-мерной модели. Этот фильм был создан, вращая ячейку 360 ° по горизонтали и 360 ° по вертикали. Зеленый сигнал представляет LC3, красный сигнал представляет лизосом, белый сигнал представляет E-Cadherin и синий сигнал представляет ядро. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм 1 или= "_blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм 2.
В то время как непосредственное наблюдение клетки помечены флуоресцентными зондами против LC3 широко применяется в качестве стандартного метода для подтверждения аутофагической ответ 6, количественные изображения в 3D и той же системе (как мы сделали) обеспечивает беспрецедентную информацию и подробности о сложном процессе клеточного аутофагию . В частности, мы видим, что сотни (если не тысячи) аутофагосом в живых клетках образуются в течение 80 мин аутофагии индукции. Аналогичным образом, мы наблюдаем очень интересную морфологические изменения в распределении лизосомальных отсеков во время аутофагию индукции. В данной клетке, снижение аутофагосом число и соответствующее увеличение их среднего размера с течением времени, показывают, что аутофагосомы становятся большими путем слияния друг с другом, перед объединением с лизосомами в форме autolysosomes. Высокое разрешение 3D флуоресцентной микроскопии живых клеток позволяет исследовать ли аутофагосомы должны достичь критического размера ДОэлектронной сливается с лизосом, или может аутофагию идет просто в меньших физических размеров. Действительно, учитывая количество очень маленьких аутофагосомы, которые появляются на ранней активации только на пределе разрешающей способности микроскопа деконволюцией, и гораздо более четко решен на OMX структурированное освещения микроскопа 13, это может быть так, что основная часть деятельности фактически аутофагической На этой ступени.
Возможность мониторинга живых клеток в течение аутофагия является критически важным, так как изменение количества и размера аутофагосомы в данной соте может быть небольшим по отношению к вариации этих параметров от клетки к клетке. Изучая единый живой клетки с течением времени - мы можем быть более уверены, что морфологические изменения, которые мы наблюдаем обусловлены экспериментальных условиях, а не статистическую дисперсию.
Наконец, со специфическими молекулярными маркерами, то можно применить эти методы визуализации для изученияраннее формирование аутофагосом, проследить происхождение autophagosomal мембран, а также определить возможные органелл и / или внутриклеточных компонентов, которые были специально охвачен аутофагосомы во аутофагию индукции. Мы также надеемся, что такой подход позволяет исследовать роль аутофагии выживания клеток и гибель клеток, и лучше охарактеризовать последствия потенциальных лекарственных препаратов и ингибиторов на аутофагии.
Нет конфликта интересов объявлены.
Грантовая поддержка: NIH CA165263, NIH CA150197, NIH CA150197S1 (HJ Kung), NIH CA150197S1 (CA Changou), NSF PHY-0120999 Биофотоники Центр Науки и Технологии (DL Wolfson, FYS Чжуан), DOD PC073420 (RJ Жирный), Научно-исследовательский Совет Норвегии, Leiv Eiriksson грант 209286/F11 (BS Ахлувалия). HJ Кунг также благодарит за поддержку Рыжий Общественный фонд рака фонда. RJ Жирный также благодарит за поддержку J. McDonald одаренность.
Мы благодарим доктора Дженни Вэй-Jen Кунг-и д-р Бор-на Вэнь У DesigneRx на щедрые поставки ADI.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Arginine Deiminase (ADI) | DesigneRx | ||
HEPES | Sigma | H4034 | |
Casein | Sigma | C5890 | |
Paraformaldehyde | Fisher | 4042 | |
Saponin | Sigma | S4521 | |
Alexa anti-mouse 555 | Invitrogen | A21422 | |
Alexa anti-rabbit 647 | Invitrogen | A21244 | |
LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
anti-Lamp1 | DSHB | H4A3 | |
anti-Cadherin | Cell Signaling | #3195 | |
SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | |
35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate | MatTek | P35GC-1.5-1.4-C | |
No.1, 22 mm coverslip | Corning | #2865-22 | |
Microscope slides | Globe Scientific | 1324G |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены