Химически заблокирован антител Microarray для мультиплексный высокой пропускной профилирования конкретных гликозилирования белков в сложных образцов

В этом исследовании мы опишем улучшение протокола мультиплексной высокой пропускной способности антител микрочипов с лектин метод обнаружения, которые могут быть использованы в гликозилирования профилирования специфических белков. Этот протокол имеет новый надежный реагентов и значительно сокращает время, стоимость и требования лабораторного оборудования по сравнению с предыдущей процедуры.

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.

Introduction

Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes^1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases ^7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of α-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma ^13-15, and CA199 for pancreatic cancer ^{16, 17} are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample ¹⁸. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO₄ in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample ^18-20. This method has been used successfully in multiple different labs ^{1, 7, 13, 19-31}. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

1. Печать антител Microarray к анализу

1. Развести все антитела к 0,5 мг / мл в фосфатном буфере солевой раствор, рН 7,2 (PBS).
2. Алиготе 40 мкл каждого антитела в 384-и источник пластины.
3. Загрузите 384-а источник пластины на microarrayer sciFLEXARRAYER Scienion.
4. Загрузить 20 слайдов PATH микрочипов на microarrayer как цель.
5. Установить microarrayer печати 48 идентичных подрешеток, в которых 27 антител и контроль белки обнаружены в трех экземплярах 9x9 картина (рис. 1E, 1F).
6. Начать microarrayer печатать слайды антител микрочипов.
7. Соберите слайды антител микрочипов, и хранить их в слайдах кассету с осушителем. Вакуумное уплотнение кассеты в полиэтиленовый пакет с помощью вакуумного герметик (Foodsaver).
8. Хранить запечатанные слайды микрочипов при 4 ° С в холодильнике.

2. Химически блокируют антитело Microarray по предотвращению GBPПривязка к Capture Антитела

Анализ микрочипов начинается, как только микрочипов слайды химически заблокировали и длится около 8 часов. После запуска микрочипов анализ должен быть завершен (шаги от 2 до 8).

1. Возьмите микрочипов выдвигается из холодильника, и уравновешивать их в комнатной температуре в течение 30 минут.
2. Удалить слайд из ящика, и кратко промойте их в фосфатный буфер солевом рН 7,2 с 0,1% Твин-20 (PBST0.1) один раз в режиме слайд-умывальником, а затем в 15 мМ буферного раствора ацетата натрия рН 5,0 с 0,1% Tween (CBT0 0,1) в последовательной форме. Инкубируйте слайды в CBT0.1 в течение 10 минут в слайд умывальника.
3. Подготовить свежие 150 мМ NAIO ₄ в 15 мМ буферного раствора ацетата натрия рН 5,0 (ЦБ), и держать его в в слайд умывальником в холодильнике, избегая при этом свет перед использованием.
4. Удалить слайд из ЦБ, и положить его в миску со свежими NAIO ₄ с антителами сторонывверх. Накройте бассейн с алюминиевой фольгой, чтобы избежать свет, и инкубировать слайд бассейна в течение 2 часов с нежным встряхивании при 4 ° С в холодильнике.
5. Подготовить 300 мл 10 мМ гидразида глутаминовой кислоты (блокатор) в ЦБ.
6. Удалить слайд из бассейна, а также кратко промойте его в ЦБ 3 раза по 5 минут каждый раз в слайд умывальника.
7. Инкубируйте слайды окон в умывальником в течение 2 часов при комнатной температуре с нежным тряски.
8. Удалить слайды из бассейна, и мыть их с PBST0.1 течение 3 минут.

3. Блок без привязки к конкретным Microarray с бычьего сывороточного альбумина (БСА)

1. Подготовить 300 мл 1% BSA в фосфатный буфер солевом рН 7,2 с 0,5% Tween (PBST0.5) в режиме слайд-раковина, и инкубировать слайд микрочипов в бассейне в течение 1 часа при комнатной температуре, осторожно встряхивая.
2. Промойте слайдов PBST0.1 три раза в течение 3 минут каждый раз.
3. Положите слайдна слайде стойку, и спина в 1200 мкг на центрифугирования в течение 2 минут, чтобы высушить микрочипов слайдов.

4. Выходные данные Воск сетки на Microarray слайдов для разделения подмассива

1. Предварительное нагревание воска импринтера при 70 ° С в течение 5 минут.
2. Загрузите заблокирован микрочипов слайдов в воск импринтера с антителами стороной на воск. Осторожно потяните за ручку, чтобы отпечаток воска на слайде равномерно.

5. Применение образцов сыворотки на слайд Microarray

1. В шаге 2.4, подготовить образцы сыворотки или для анализа глико профилей в одном образце (5.1.1), или один глико epiptope измерения между несколькими образцами (5.1.2).
   1. В эксперименте на гликана profilings несколько сыворотки гликопротеинов в одном образце сыворотки с помощью нескольких ГБ (см. пример эксперимент 1), образцы сыворотки будут применяться на всех подрешеток. В этом случае, 40 мкл сыворотки достаточно разводят на 360 мкл PBS, содержащего 0,1%Твин-20, 0,1% Бридж 35, 100 мкг / мл IgG мыши, 100 мкг / мл IgG крысы, 100 мкг / мл IgG кролика, 100 мкг / мл IgG козы и 100 мкг / мл IgG осла. Этот объем является достаточным для применения 6 мкл разбавленной сыворотки решение на каждый подмассива.
   2. В ходе эксперимента на одной гликана измерения на нескольких белков сыворотки крови у нескольких образцов сыворотки с помощью одного GBP обнаружения (см. пример эксперимент 2). В этом случае, 1 мкл сыворотки достаточно разводят в 9 мкл PBS, содержащего 0,1% Твин-20, 0,1% Бридж 35, 100 мкг / мл IgG мыши, 100 мкг / мл IgG крысы, 100 мкг / мл IgG кролика , 100 мкг / мл IgG козы и 100 мкг / мл IgG осла. Этот объем является достаточным для применения 6 мкл разбавленной сыворотки решение на каждый подмассива.
2. После восковой отпечаток на шаге 4, бережно относиться 6 мкл разведенного образца или контрольных образцов (PBST0.1) для каждого подмассива слайда. Инкубировать слайд в увлажненном кассету с мокрыми полотенцами бумаги при комнатной температурев течение 1 часа.
3. Промойте слайд с PBST0.1 три раза в течение 3 минут каждый раз.
4. Высушите слайд вращая его в 1200 мкг в течение 2 минут.

6. Применить Биотинилированные GBP (лектина или Anti-гликана антител) на слайд

1. В шаге 2.4, подготовить 10μg/ml биотинилированного лектинов / ГБ в PBST0.1.
   1. В эксперименте профилирования гликана что зонд одного образца с несколькими лектинов (пример эксперимент 1), подготовить 350 мкл биотинилированного лектинов, что достаточно для всех подрешеток.
   2. В одном гликана эпитоп / биомаркеров скрининга в несколько образцов с помощью нескольких лектинов, готовить по 10 мкл каждого биотинилированного лектинов, что достаточно для одного подмассива.
2. Применить 6 мкл разбавленного биотинилированного лектин (ы) для каждого подмассива слайд, и инкубировать в увлажненном окно слайд с мокрыми полотенцами бумаги при комнатной температуре в течение 1 часа.
3. Промойте слайды с PBST0.1 три раза в течение 3 минут каждый тименя.
4. Высушите слайд вращая его в 1200 мкг в центрифуге в течение 2 минут.

7. Применение краски Маркированный NeutrAvidin для обнаружения флуоресценции

1. Подготовить 350 мкл Dylight 549 помечены NeutrAvidin, что достаточно для всех подрешеток.
2. Применить 6 мкл Dylight 549 помечены NeutrAvidin на каждый подмассива, и инкубировать слайд в увлажненном кассету слайдов при комнатной температуре в течение 1 часа.
3. Промойте слайд с PBST0.1 три раза в течение 3 минут каждый раз.
4. Высушите слайд вращая его в 1200 мкг в центрифуге в течение 2 минут.

8. Получить Microarray слайдов изображения путем сканирования слайдов

1. Сканирование слайдов с помощью флуоресценции сканер микрочипов на 10 мкм разрешением. Лазера и PMT настройки должны быть как можно более прочными, но не насыщение месте не наблюдается.

9. Извлечение данных и анализа

1. Откройте изображение в ArrayPro 3.2.
2. Настройка шаблона массива по массиву карта, которая показывает антитела пятна местах. Тщательно выровняйте каждый шаблон круга на соответствующем месте в изображении.
3. Извлечение интенсивность каждого места в Excel файл для последующего анализа.

10. Представитель Результаты

Пример эксперимента 1

Гликозилирование профилирования несколько сыворотки гликопротеинов в гепатоцеллюлярной карциномы сыворотки образец с помощью химически заблокировали антител микрочипов с несколькими обнаружения лектинов.

Целью данного эксперимента является изучение индивидуального профиля гликозилирования 20 гликопротеинов в гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) сыворотки образец с помощью химически заблокировали антител микрочипов с лектин обнаружения. Антитела микрочипов, что содержит 48 идентичных подмассивы которые включают 26 антител и биотин-BSA, был разработан и изготовлен, как описано в SТЭП 1. Эти 26 антитела против 20 гликопротеинов сыворотки, которые определены как перспективные ранней диагностики значение для больных ГЦК с помощью лектинов на основе иммунопреципитации в сочетании с масс-спектрометрического идентификации белков ^{12, 32,} как показано в таблице 1. Структура и расположение пятен антител печатается в трех экземплярах, по одному представителю подмассива показаны на рисунке 1E и 1F, соответственно. Два одинаковых слайды микрочипов, один не был химически заблокировали (рис. 1а), а другой был (рис. 1б), были использованы для выполнения такой же эксперимент профилирования гликозилирования для того, чтобы продемонстрировать важность химически блокирования процедуры анализа. Для химически заблокировали слайд (рис. 1б), эксперимент начался в шаге 2, ибо ни химически заблокировали слайд (рис. 1а), эксперимент начался с Шаг 3. Эксперимент проводился на followinг все шаги, описанные в протоколе, за исключением шага 5.1.2 и 6.1.2. В шаге 5.2, PBST0.1 контрольного образца был применен на подмассивы в графе 1 и 3, объединенных ГЦК сыворотки была применена на подмассивы в колонке 2 и 4, соответственно (как показано на рисунке 1G). Это сравнение, чтобы показать эффективность, эффективность процедуры, а также антигены сродство антител после химической блокировки. 22 биотинилированного лектинов (как показано в Таблице 1), характерных для различных гликанов ^{18, 20} были применены на каждом подмассива как показано на рисунке 1G для гликозилирования профилирования. Изображения химически заблокировали (рис. 1б) и не химически заблокировали (рис. 1А) микрочипы после анализа гликозилирования профилирования, следуя протоколу. Как показано в подмассивы в графе 1 и 3, не связанных с химически заблокировали микрочипов (рис. 1А и рисунок 1С), на которомтолько PBST0.1 была применена, большинство лектинов обязаны захватить антител, и показали очень высокий фон, сопоставимых с подмассивы в колонке 2 и 4, на котором сыворотки был применен. Невозможно получить информацию гликана профиль из этого слайда микрочипов. Напротив, когда тот же эксперимент был проведен на химически заблокировали слайд микрочипов антитела, подмассивы в графе 1 и 3, на котором только PBST0.1 была применена, большинство лектинов не показали или очень низкой привязки захвата антител, в то время как высокая антиген привязки по-прежнему наблюдается в подмассивы в колонке 2 и 4, на котором сыворотки был применен (рис. 1B и 1D). Это результат показал химически блокирование процедура была важным шагом Поэтому измерение гликанов на антитела захватили гликопротеинов. Следуя протоколу, гликозилирование профилей из 22 гликопротеинов в сыворотке ГЦК может быть получено.

Эксперимент 2

Экран для измененного fucosylation по конкретным сыворотки гликопротеины в качестве биомаркеров для дискриминации цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы пациентов.

Цель этого эксперимента для выявления измененных fucosylation по конкретным сыворотки гликопротеины в качестве биомаркеров, являющиеся дискриминационными по цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) пациентов. В отличие от эксперимента 1, в котором только один образец сыворотки был применен на каждый подмассивы и исследовал различные лектинов, в этом тесте, всего 40 различных образцов сыворотки с ГЦК и циррозом печени пациента наносится на каждый подмассива и исследовали с одной лектин (AAL ). Статистический анализ, такие как T тест, приемник-характеристической (ROC) кривой, это было сделано для оценки распределения или диагностических производительность гликана epiptope / биомаркеров на каждого белка во всех образцах сыворотки. Мы использовали тот же микрочипов антитела производятся в эксперименте 1, за исключением анти-CA19-9 и анти-Льюис Х антитела в этом исследовании. Экспериментаiment проводилась с сентября 2 Шаг 9, за исключением шага 5.1.1 и 6.1.1. Всего 40 образцов сыворотки от 20 циррозом печени и 20 больных ГЦК были применены наугад подмассива 48 подмассивы вместе с контрольными образцами PBS в качестве отрицательного контроля. Fucosylation каждого захваченного белков, то обнаруживается с помощью биотинилированного фукозы конкретных лектинов. Микрочипов изображение, показанное на рисунке 1 продемонстрирована лектин AAL только связывается с белками сыворотки, захваченные на микрочипов (рис. 2D), а захваченных антител (рис. 2Е). AAL обязательным интенсивности все места были затем экстрагировали и анализировали с помощью теста T и ROC кривые оценки эффективности fucosylation (AAL обязательным интенсивности) каждого из сывороточного белка на дискриминацию между ГЦК и циррозом групп. Результаты показали, что fucosylation из белка GP73 дал лучший различия между двумя группами р = 0,03 и площадь под-Кривая ROC кривой равна 0,72. Данный эксперимент показал, эта процедура является быстрым, эффективным методом гликана эпитоп / биомаркеров скрининг на нескольких образцов в течение нескольких белков.

Таблица 1. Список лектинов и антител, используемые в настоящем протоколе.

Таблица 2. Списокоборудования и реагентов, используемых в этом протоколе.

Схема 1 Схема показывает лектин микрочипов антител основан гликана биомаркеров открытие процесса 1 (шаг 2 до 4): Блок антител микрочипов с блокаторами (Glu-гидразид) и BSA, 2 (Шаг 5):.. Применять сыворотки крови и захвата конкретные гликопротеинов со специфическими антителами, 3 (Шаг 6): применяется биотинилированного лектин (ы), 4 (Шаг 7): Probe биотинилированного AAL с Dylight 549 помечены NeutrAvidin для микрочипов изображений.

Рисунок 1. Microarray изображения образца Эксперимент 1 гликозилирования профилирования несколько сыворотки гликопротеинов в ГЦК сыворотки образец с помощью химикосоюзника заблокирован антител микрочипов с несколькими лектин обнаружения. Два одинаковых слайды микрочипов, (А) ни химически заблокирован, или (б) химически заблокировали, как описано в шаге 2, и прошел через все шаги от 2 до 9 для гликозилирования профилирования, а также сравнение цели. (А) и (Б) микрочипов изображений, отсканированных на шаге 8 разрешением 10 микрон. (C) увеличить изображение первых двух строк ни химически заблокировали микрочипов слайдов (A), (D) увеличить изображение первых двух строк, не химически заблокировали микрочипов слайдов (B)), (E) Схема расположения антител в каждой подрешетки, (F) множество карт: расположение каждого антитела в подмассива, каждое антитело имя представляет собой 3 места; (G), сыворотки и лектин местоположение: Диаграмма показывает, какие подмассива каждого образца сыворотки и лектин был применен на.

Рисунок 2. Microarray изображенийпример эксперимент 2 экрана измененное fucosylation по конкретным сыворотки гликопротеины в качестве биомаркеров, являющиеся дискриминационными по цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы пациентов. Анализ микрочипов проводились, как описано в примере Эксперимент 2 раздела. (А) все изображение слайд микрочипов слайд с шага 8, (б) схема расположения антител в каждой подрешетки (C) массив карт: расположение каждого антитела в подмассива, каждое антитело имя представляет 3 места; (D) зум-в образе подмассива, которые инкубировали с сывороткой образца, (E) зум-в образе подмассива, что инкубируют с PBS контроля.

Рисунок 3. Гликан профилирования результаты эксперимента образец 1. Каждая гистограмма представляют собой лектин обязательным профилем (или гликана профилей) одного из 20 проверенных белка. Всего 22 различных лектинов были использованы для анализа йэлектронной гликана профиль каждого белка.

1. Белка-мишени и выбор захвата антител

До анализа микрочипов антитела, некоторые реактивы и материалы, необходимые для рассмотрения и подготовки. Для разработки антител микрочипов для гликана профилирования или гликана биомаркеров скрининга, панель антител, специфичных к гликопротеин кандидаты должны определяться в соответствии с литературой или с предыдущими результатами. Эти антитела, как правило, приобретенных у различных производителей, таких как R & D Systems и т.д. IgGs предпочитают захват антитела, так как наши предыдущие тесты показали, что некоторые IgM и IgE может полностью потерять свои антиген сродства после химической модификации.

2. Разработка и производство антител микрочипов

Производство микрочипов антител является дополнительным шагом, который нуждается в профессиональной и дорогой microarrayer и хорошо обученный персонал для работы. Тем не менее, индивидуальные антитела микрочипов производителейтуры можно легко сделать из услуг, таких как Serome Biosciences Инк Для надежного результата, мы рекомендуем бесконтактного microarrayer, такие как Scienion sciFLEXARRAYER ультра низкого объема бесконтактного microarrayer который был использован в нашем производстве микрочипов антител. Высокая способность к связыванию микрочипов горки, такие как PATH (Gentel Bio Инк WI) или слайдов H (Шотт, П.А.).

3. Выбор и подготовка Гликан белков (ГБ) для гликозилирования профилирования

ГБ, предназначенных для различных моно-или олигосахаридов, можно найти в литературе, и через поисковую систему разработанных Хааб лаборатории ²⁹ и поддерживается на Поступательное Genomics института Чтобы выбрать ГБ с высокой специфичностью и сродством кцелевых эпитопов гликана выберите мотив (эпитопов) из выпадающего меню, и нажмите кнопку "поиск". ГБ, специфичных для данного мотива (эпитопов) будут перечислены в соответствии с их значением LOgp от высокого до низкого порядка. Высшее LOgp указывает на сильное сродство и специфичность к мотиву гликана / эпитоп. Из-за присущего неспецифического связывания вопрос с лектин, этот метод еще не так, как оптимальный антител на основе анализа. Таким образом, мы настоятельно рекомендуем, чтобы анти-гликана антитела используются, такие как анти-Льюис х или анти-сиалил Льюис антитела, если они имеются. Использование нескольких ГБ для обнаружения другой стратегии перепроверить различных профилей и обязательным для получения достоверной привязки данных.

4. Анализ данных

Поскольку этот метод используется для определения родного сывороточных белков, белок-белковые комплексы могут быть захвачены и обнаружено. Вестерн-блот или масс-спектрометрии хорошо методов для проверки данных микрочипов. В то же время, Обнаружение белка с использованием тех же микрочипов еще один способ узнать подробности гликозилирования изменение белка, например, являются ли изменения были связаны с изменением уровня общего белка, или просто, что гликозилирование уровня увеличился на каждого из белков.

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Эта работа была поддержана Институтом гепатитов и вирусных исследований.